使核酸電泳的方法、濃縮和純化核酸的方法、用于核酸電泳的盒以及制造用于核酸電泳的 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供使核酸電泳的方法，該方法通過簡(jiǎn)單操作能夠高效地濃縮和純化核酸。電泳方法包括使插入了具有陰離子官能團(tuán)的嵌入劑的核酸電泳。該方法包括將含有核酸的樣品、具有與樣品中包含的物質(zhì)含有的羧基進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)的官能團(tuán)的化合物以及脫水縮合反應(yīng)的縮合劑進(jìn)行混合；以及使核酸電泳。濃縮和回收核酸的方法通過增加與嵌入劑結(jié)合的核酸的負(fù)電荷，能夠增加核酸的電泳速度。使核酸電泳的方法通過使樣品中的物質(zhì)的羧基進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)，能夠通過電泳穩(wěn)定地分離核酸和上述物質(zhì)。
【專利說明】使核酸電泳的方法、濃縮和純化核酸的方法、用于核酸電泳的盒以及制造用于核酸電泳的盒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明公開了涉及使核酸電泳的方法、濃縮和純化核酸的方法、用于核酸電泳的盒(cartridge)、以及制造該盒的方法。更具體地講，本公開涉及可以通過在槽中電泳來濃縮和純化核酸的盒。
【背景技術(shù)】
[0002]聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChain Reaction)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-MediatedIsothermal Amplification)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)已應(yīng)用于生物技術(shù)很多領(lǐng)域。比如,在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，實(shí)施基于DNA和RNA的核苷酸序列的診斷，以及在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，DNA測(cè)試已應(yīng)用于像確定基因改性作物的技術(shù)中。
[0003]核酸擴(kuò)增反應(yīng)使得能夠通過擴(kuò)增核酸高效地檢測(cè)到少量樣品中的核酸。但是，如果樣品中所包含的核酸的量極少的話，該量可能低于檢測(cè)極限。進(jìn)一步，如果樣品中核酸的濃度很小，那么該核酸可能就不能被檢測(cè)出來，因?yàn)槟軌蛞氲椒磻?yīng)場(chǎng)中的體積的樣品可能不包含要擴(kuò)增的核酸。在這些情況下，在被引入到反應(yīng)場(chǎng)之前，濃縮樣品中核酸可能是有效的。
[0004]一直以來，作為濃縮核酸的方法，使用苯酚/氯仿/乙醇的方法；使用色譜柱、過濾器等以吸收核酸的方法；使用磁性二氧化硅微珠等方法是已知的。例如，專利文獻(xiàn)I公開了使用具體有能夠吸附核酸的多孔載體濃縮核酸的方法。在非專利文獻(xiàn)I中描述了通過毛細(xì)管電泳濃縮核酸的方法。
[0005]專利文獻(xiàn)1:日本專利申請(qǐng)公開第2005-080555號(hào)。
[0006] 非公開專利文獻(xiàn) 1:“0n_line sample preconcentration in capillaryelectrophoresis-Fundamentals and applications.，，Journal of Chromatography A,2008 年，第 1184 卷，頁碼:504-541 ο

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的問題。
[0008]過去使用苯酚/氯仿/乙醇的方法必須使用有害的有機(jī)溶劑，這對(duì)離心等帶來麻煩。使用色譜柱、過濾器等以吸附核酸的方法會(huì)產(chǎn)生色譜柱、過濾器等容易造成阻塞的問題，并且就操作簡(jiǎn)便性而言也存在問題。
[0009]因此，本發(fā)明公開的主要目的是提供對(duì)使核酸電泳的方法，該方法通過簡(jiǎn)單地操作在短時(shí)間內(nèi)高效地濃縮和純化核酸。
[0010]解決問題的方式
[0011]為了解決上述所描述的問題，本公開提供了使核酸電泳的方法，該方法包括使插入了具有陰離子官能團(tuán)的嵌入劑(intercalator)的核酸電泳。
[0012]在使核酸電泳方法的該步驟中，期望嵌入劑的酸解離常數(shù)要大于O且小于等于3。[0013]進(jìn)一步，在使核酸電泳的此方法中，期望官能團(tuán)是磺酸基。
[0014]再進(jìn)一步，在使核酸電泳的此方法中，期望包括以下步驟:在填充了緩沖液的槽(channel)的兩端施加電壓使得在所述槽中預(yù)定位置引入的所述核酸進(jìn)行電泳；以及阻擋所述核酸移向正極端。
[0015]這里使用的嵌入劑插入核酸主要是指嵌入劑插入了雙鏈核酸的互補(bǔ)堿基對(duì)之間。進(jìn)一步，在公開中，術(shù)語“雙鏈核酸”包括最初作為單鏈構(gòu)成并且通過自我雜交而部分變成雙鏈的核酸。[0016]再進(jìn)一步，緩沖液的pH值小于等于5是可取的。
[0017]再進(jìn)一步，在本公開中提供了濃縮和純化核酸的方法，這方法包括使已插入了具有陰離子官能團(tuán)的嵌入劑的核酸電泳。
[0018]再進(jìn)一步，本公開提供了用于核酸電泳的盒，該盒包括:槽，被形成為能夠引入液體；用于阻擋物質(zhì)的阻擋部，布置在所述槽的預(yù)定位置；電極，布置在所述槽的兩端；能夠插入核酸的嵌入劑，具有陰離子官能團(tuán)；以及緩沖液；所述嵌入劑和所述緩沖液被容納在所述阻擋部與負(fù)極端之間。
[0019]而且，本公開提供了制造盒的方法，該方法包括:使被引入基板上形成的槽中的單體溶液通過光聚合而凝膠化為預(yù)定形狀，從而形成高分子凝膠；以及將能夠插入核酸的具有陰離子官能團(tuán)的嵌入劑裝入所述槽中。
[0020]為了解決上述所描述的問題，本公開提供了使核酸電泳的方法，該方法包括:將含有核酸的樣品、具有與所述樣品中包含的物質(zhì)含有的羧基發(fā)生脫水縮合反應(yīng)的官能團(tuán)的化合物、以及所述脫水縮合反應(yīng)的縮合劑混合；以及使所述核酸電泳。
[0021 ] 在使核酸電泳方法的這些步驟中，所期望的官能團(tuán)是氨基。
[0022]進(jìn)一步，在使核酸電泳的此方法中，所期望的化合物是乙醇胺和乙二胺。
[0023]再進(jìn)一步，在使核酸電泳方法中，所期望的是縮合劑包括選自1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、4- (4，6- 二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽、二環(huán)己基碳二亞胺和二異丙基碳二亞胺中的至少一種。
[0024]再進(jìn)一步，在使核酸電泳的此方法中，所期望的是該化合物至少具有第一陽離子官能團(tuán)和第二陽離子官能團(tuán)，第一陽離子官能團(tuán)與羧基發(fā)生脫水縮合反應(yīng)，第二陽離子官能團(tuán)在電泳過程中以離子狀態(tài)存在。
[0025]再進(jìn)一步，在使核酸電泳的此方法中，所期望的是在填充了緩沖液的槽的兩端施加電壓使得在所述槽中預(yù)定位置引入的所述核酸進(jìn)行電泳；以及阻擋所述核酸移向正極端。所期望的是緩沖液的PH值小于等于8。
[0026]再進(jìn)一步，在使核酸電泳的此方法中，所期望的是樣品包括至少以下一種樣品:包含咽喉拭子、鼻腔拭子、陰道拭子、血液、血漿、血清、組織、組織碎片、痰、脊髓液、尿、汗和糞便中的至少一種的源自活體的樣品；或包含細(xì)胞培養(yǎng)液體、細(xì)菌培養(yǎng)液、食品中的液體和土壤中的至少一種的樣品。
[0027]再進(jìn)一步，本公開提供了濃縮和純化核酸的方法，該方法包括:將含有核酸的樣品、具有與所述樣品中包含的物質(zhì)含有的羧基發(fā)生脫水縮合反應(yīng)的官能團(tuán)的化合物、以及所述脫水縮合反應(yīng)的縮合劑混合；以及使所述核酸電泳。
[0028]再進(jìn)一步，本公開提供了用于核酸電泳的盒，該盒包括:槽，被形成為能夠引入液體；高分子凝膠，被布置在槽的預(yù)定位置；電極，布置在所述槽的兩端；具有與羧基發(fā)生脫水縮合反應(yīng)的官能團(tuán)的化合物；所述脫水縮合反應(yīng)的縮合劑；以及緩沖液；所述化合物、所述縮合劑和所述緩沖液被容納在槽中。
[0029]而且，本公開提供了制造用于濃縮和純化核酸的芯片的方法，該方法使被引入基板上形成的槽中的單體溶液通過光聚合而凝膠化為預(yù)定形狀，從而形成高分子凝膠；以及將具有與羧基發(fā)生脫水縮合反應(yīng)的官能團(tuán)的化合物、所述脫水縮合反應(yīng)的縮合劑、以及緩沖液裝入所述槽中。
[0030]發(fā)明效果
[0031 ] 根據(jù)本公開，提供了使核酸電泳的方法，通過簡(jiǎn)單的操作能在短時(shí)間里高效地濃縮和回收核酸。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1示出了根據(jù)本公開的實(shí)施方式的用于核酸電泳的盒的構(gòu)成以及使用該盒的使核酸電泳的方法的步驟的示意圖。
[0033]圖2示出了用于說明根據(jù)本公開的第一實(shí)施方式的酸解離常數(shù)的pH-電荷曲線。
[0034]圖3示出了從電泳開始隨著時(shí)間的過去凝膠界面的熒光強(qiáng)度變化的圖(實(shí)施例1:緩沖液的PH值為2.2)。
[0035]圖4示出了從電泳開始隨著時(shí)間的過去凝膠界面的熒光強(qiáng)度變化的圖(實(shí)施例2:緩沖液的PH值為4.0)。
[0036]圖5示出了蛋白質(zhì) (BSA)進(jìn)行電泳時(shí)的狀態(tài)的圖(實(shí)施例3)。
[0037]圖6示出了蛋白質(zhì)(AGP)進(jìn)行電泳時(shí)的狀態(tài)的圖(實(shí)施例4)。
【具體實(shí)施方式】
[0038]以下描述用于實(shí)施本公開的一些優(yōu)選實(shí)施方式。需要指出的是，下面所描述的實(shí)施方式僅僅是本公開中具有代表性的實(shí)施方式的例子和不應(yīng)該理解為是對(duì)本公開范圍的限制。將按照下面的順序給出說明。
[0039]1.根據(jù)所本公開的第一實(shí)施方式的用于核酸電泳的盒、使核酸電泳的方法、以及制造用于核酸電泳的盒的方法
[0040]( I)用于核酸電泳的盒[0041 ] (2)使核酸電泳的方法
[0042](3)制造用于核酸電泳的盒的方法
[0043]2.根據(jù)本公開的第二實(shí)施方式的用于核酸電泳的盒、使核酸電泳的方法、以及制造用于核酸電泳的盒的方法
[0044]( I)用于核酸電泳的盒
[0045]( 2)使核酸電泳的方法
[0046](3)制造用于核酸電泳的盒的方法
[0047]1.根據(jù)所本公開的第一實(shí)施方式的用于核酸電泳的盒、使核酸電泳的方法、以及制造用于核酸電泳的盒的方法。
[0048](I)用于核酸電泳的盒[0049]圖1示出了根據(jù)本公開的第一實(shí)施方式的用于核酸電泳的盒的構(gòu)成以及使用該盒使核酸電泳的方法的步驟的示意圖。
[0050]圖1 (A)的用于核酸電泳的盒(用參考數(shù)字I來表示)有在基板上形成的槽11 ;布置在槽11的兩端的正極12和負(fù)極13。槽11被配置為能夠?qū)⒁后w引入其中；將高分子凝膠14布置在槽11中正極12和負(fù)極13之間。而且，電源V連接到正極12和負(fù)極13使得能夠在被引入槽11中的液體上施加或解除電壓。能夠插入核酸的嵌入劑、以及緩沖劑被容納在槽11中。
[0051]基板的材料可能是玻璃或各種塑料中任何一種(聚丙烯、聚碳酸酯、環(huán)烯烴聚合物、聚二甲基硅氧烷)。
[0052]作為正極12和負(fù)極13，優(yōu)選采用包含濺射或沉積了金(Au )或鉬的材料。
[0053]高分子凝膠14是本公開的阻擋部的示例。高分子凝膠14沒有特別的限制，只要它能夠在電泳過程中阻擋樣品中的核酸即可，后面將會(huì)有描述。此外，作為阻擋部，可以采用諸如透析膜、反滲透膜、半透膜和離子交換膜等多孔膜；諸如纖維素、聚丙烯腈、陶瓷、沸石、聚砜、聚酰亞胺和鈀的材料的多孔膜等。在下面的實(shí)施方式中(同樣適用于本公開的第二實(shí)施方式)，本公開的阻擋部將通過主要使用高分子凝膠14的例子來描述。
[0054]作為高分子凝膠14，適當(dāng)?shù)夭捎镁郾０?。更?yōu)選地，可以采用具有陰離子官能團(tuán)的聚丙烯酰胺。更優(yōu)選地，使用含酸解離常數(shù)(Pka)為I到5的陰離子官能團(tuán)的聚丙烯酰胺。在本實(shí)施方式中，“丙烯酰胺”是指丙烯酰胺或(甲基)丙烯酰胺。
[0055]陰離子官能團(tuán)的例子包括但不限于:羧酸，如乙酸，丙酸和丁酸；多元酸，如草酸和鄰苯二甲酸；羥基酸，如檸檬酸、乙醇酸和乳酸；不飽和酸和不飽和多元酸，如丙烯酸和甲基丙烯酸；氨基酸，如甘氨酸；磷酸的部分酯；硫酸的部分酯；磷酸；磺酸等。
[0056]羧酸的具體的例子包括脂肪族一元羧酸，如甲酸(pka:3.55)、醋酸(pka:4.56)、丙酸(pKa -A.67)、丁酸(pKa -A.63)、戍烯酸(pKa -A.68)、己酸(pKa -A.63)、庚酸(pKa:
4.66)、棕櫚酸(pKa:4.64)、硬脂酸(pKa:4.69);脂肪族或芳香族二羧酸酸，如琥珀酸CpKa1 -A.00、pKa2:5.24)、戍二 酸(PKa1:4.13、pKa2:5.03)、己二 酸(PKa1 -A.26、pKa2:
5.03)、庚二酸(PKa1:4.31、pKa2:5.08)、辛二酸(PKa1:4.35、pKa2:5.10)、壬二酸(PKa1:4.39、pKa2:5.12)、蘋果酸(PKa1:3.24、pKa2:4.71)和對(duì)苯二甲酸(PKa1:3.54、pKa2:4.46)；不飽和羧酸，如巴豆酸(pKa:4.69)、丙烯酸(pKa:4.26)和甲基丙烯酸(pKa:4.66);取代苯甲酸，如茴香酸(pKa:4.09)、間氨基苯甲酸(PKa1:3.12、pKa2:4.74)、間或?qū)β缺郊姿酑pKa1:3.82,pKa2:3.99)和羥基苯甲酸(PKa1:4.08、pKa2:9.96);多元羧酸，如檸檬酸(PKa1:2.87、pKa2:4.35、pKa3:5.69);以及其衍生物。
[0057]特別優(yōu)選丙烯酰胺烷基磺酸作為含有陰離子官能團(tuán)的丙烯酰胺單體?；撬岬睦影ū揭蚁┗撬?pKa:-2.8)、間胺苯磺酸(pKa:3.74)、對(duì)間胺苯磺酸(pKa:3.23)、2-(甲基)丙烯酰胺基-2-烷基(C1-C4)丙磺酸，更具體地，2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(pka:-1.7)，以及其它具有可聚合的不飽和基團(tuán)的磺酸。
[0058]優(yōu)選聚丙烯酰胺凝膠中的陰離子官能團(tuán)的濃度(wt%)在O到30%之間。
[0059]嵌入劑沒有特別的限制，只要嵌入劑是能夠結(jié)合到核酸并且具有陰離子官能團(tuán)即可。但是，優(yōu)選地，嵌入劑的酸解離常數(shù)(Pka)要大于O且小于等于3。這里所用的術(shù)語“嵌入劑”是指要插入核酸雙鏈中的物質(zhì)。[0060]嵌入劑中的陰離子官能團(tuán)的例子包括羧基(-COOH基)、巰基(-SH基)、磷酸基(-PO3H)、磷酸酯基(-PO4H2)、磺酸基(-SO3H)、硫酸酯基(-SO4H)等。
[0061]作為嵌入劑中包含的陰離子官能團(tuán)，磺酸基可以是尤其優(yōu)選的。含有磺酸基的嵌入劑的例子包括9，10-蒽醌-2，6- 二磺酸，蒽醌-1-磺酸鈉、蒽醌_2，7- 二磺酸二鈉、蒽醌-1，5- 二磺酸二鈉、蒽醌-2-磺酸鈉等。
[0062]緩沖液的pH值沒有特別限制，但是優(yōu)選例如2到3。另外，3到4的緩沖液pH值也是合適的。而且，4到5的緩沖液pH值也是合適的。緩沖液的例子包括但不限于甘氨酸-HCl緩沖液(pH:2.0到3.0)、檸檬酸緩沖液(pH:3.0到6.0)、醋酸緩沖液(pH:3.0到5.5)、檸檬酸-磷酸緩沖液(pH:2.5 到 7.0)、MES (pH:5.0 到 7.0)、Bis-Tris (pH:5.0 到 7.0)等。
[0063](2)使核酸電泳的方法
[0064]參考圖1的(B)到(D)，下面將會(huì)描述使用用于核酸電泳的盒的使核酸電泳的方法的步驟。這里所提到的使核酸電泳的方法可以是濃縮和提純核酸的方法。
[0065]首先，含有核酸的樣品被引入到槽11中的高分子凝膠14和負(fù)極13之間區(qū)域113(參見圖1中的(B))。至此，槽11中應(yīng)該填充有用于電泳的緩沖液。進(jìn)一步，嵌入劑也應(yīng)該被容納在位于槽11中的高分子凝膠14和負(fù)極13之間的區(qū)域113。
[0066]這時(shí)，嵌入劑將會(huì)插入被引入到區(qū)域113的核酸中。嵌入劑插入核酸的步驟可以是預(yù)先將嵌入劑插入核酸中，然后將核酸進(jìn)入到區(qū)域113中；或允許預(yù)先將嵌入劑容納在區(qū)域113中，當(dāng)引入核酸時(shí)插入核酸中。
[0067]作為用于根據(jù)本實(shí)施方式的使核酸電泳的方法中的含核酸的樣品，例如，可以使用源自活體的液體，例如咽喉拭子( throat swab)、鼻腔拭子、陰道拭子、血液、血漿、血清、組織、組織碎片、痰、脊髓液、尿、汗和糞便。另外，細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)菌培養(yǎng)液、食品中的液體、土壤中的液體等也可以作為樣品使用。由此，那些在分析核酸中不必要的各種蛋白質(zhì)、糖以及其他物質(zhì)(以下，這些物質(zhì)將稱為污染物；并且也適用于第二實(shí)施方式)可能包含在樣品液體中。所以，為了高效分析核酸，核酸需要與污染物分離。
[0068]在這方面，例如，作為本公開的相關(guān)技術(shù)，有一種方法用于在緩沖液等的pH酸性條件下(例如，pH值2到4)進(jìn)行電泳以分離核酸和污染物。可是，這種方法中，擔(dān)心核酸的電泳速度會(huì)較低，以及濃縮核酸變得困難。另外，當(dāng)污染物中含有痰酸等，或當(dāng)含有等電點(diǎn)低的其它蛋白質(zhì)時(shí)，擔(dān)心由于核酸與污染物的等電點(diǎn)將會(huì)相近，所以即使在進(jìn)行電泳時(shí)也難以分離核酸和污染物。
[0069]另一方面，本實(shí)施方式中所使用的嵌入劑具有陰離子官能團(tuán)。插入了嵌入劑后的核酸的PKa的值變得更低，由此核酸的等電點(diǎn)也會(huì)變得更低。結(jié)果，可以增大核酸和污染物等電點(diǎn)的差值，并且核酸的電泳速度變得高于污染物的電泳速度。所以，根據(jù)本實(shí)施方式的電泳(這將在后面描述)能穩(wěn)定地分離核酸和污染物。
[0070]現(xiàn)在，參看圖2，下面將詳細(xì)描述等電點(diǎn)對(duì)電泳的影響。圖2示出了對(duì)應(yīng)于組成核酸的各種堿基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶，圖2中分別縮寫為A、G、T和C)的各個(gè)PH-電荷曲線的圖。
[0071]這里所使用的術(shù)語“等電點(diǎn)”是指電荷為O時(shí)的pH值，如圖2所示。在任何堿基中，相對(duì)于等電點(diǎn)越高的PH引起越大的負(fù)點(diǎn)性。所以，更低等電點(diǎn)的物質(zhì)能夠增加核酸的電泳速度以使電泳更快。如上面所描述，通過將具有陰離子官能團(tuán)的嵌入劑插入核酸，各種堿基的pH-電荷曲線偏移到酸側(cè)，并且降低等電點(diǎn)。關(guān)于相應(yīng)堿基的各等電點(diǎn)，例如，胞嘧啶(C)的等電點(diǎn)(為約2.5到3)高于其它堿基的等電點(diǎn)；所以，特別是通過嵌入劑的酸解離常數(shù)為3或小于3，當(dāng)核酸進(jìn)行該嵌入劑的插入時(shí)，核酸的電泳速度可以被進(jìn)一步升高。
[0072]此外，通過使用pH值在2到3的緩沖液，可以很容易抑制污染物中包含的蛋白質(zhì)的電泳，并且允許核酸發(fā)生電泳。所以，這使得能夠更穩(wěn)定地分離核酸和污染物，以及有效地純化核酸。
[0073]再次參考圖1，根據(jù)本實(shí)施方式的使核酸電泳的方法，將描述使核酸電泳的方法。正如參照?qǐng)D1 (B)的描述，在將核酸引入到區(qū)域113后，通過在正極12和負(fù)極13之間施加電壓使得該電壓施加于緩沖液來執(zhí)行核酸的電泳。使帶有負(fù)電的核酸電泳以在槽11中向正極12移動(dòng)。這時(shí)，高分子凝膠14會(huì)阻礙核酸的遷移，通過阻擋核酸遷移，使得核酸在高分子凝膠14界面及其附近被濃縮(參見圖1 (C))。電泳時(shí)間可以根據(jù)槽11的尺寸來設(shè)定所需要的時(shí)間，例如，可以是大約10秒到10分鐘。需要指出的是，術(shù)語高分子凝膠的“界面”是指高分子凝膠14和填充在區(qū)域113側(cè)的緩沖液之間的接觸平面。
[0074]最后，在區(qū)域113中的高分子凝膠14附近的緩沖液由微量移液管2等吸收以回收濃縮的核酸(參見圖1 (D))。
[0075]由此，根據(jù)本實(shí)施方式的使核酸電泳的方法，具有陰離子官能團(tuán)的嵌入劑被插入核酸中。進(jìn)一步，優(yōu)選嵌入劑的酸解離常數(shù)大于O小于等于3。結(jié)果，核酸的負(fù)電荷變強(qiáng)并且核酸的等電點(diǎn)變得更低。特別地，在嵌入劑具有酸解離常數(shù)極低的官能團(tuán)(如磺酸基)情況下中，在插入了嵌入劑的核酸的等電點(diǎn)顯著降低。所以，根據(jù)本實(shí)施方式的使核酸電泳的方法，增加核酸的電泳速度，并且能夠在短時(shí)間內(nèi)濃縮和純化核酸。需要指出的是，在本公開中，“將嵌入劑插入核酸”是指在雙鏈核酸中的互補(bǔ)堿基對(duì)中插入嵌入劑，或換句話說，嵌入(intercalate)嵌入劑 。此外，在本公開中，術(shù)語“雙鏈核酸”包括最初作為單鏈構(gòu)成并且通過自我雜交而部分變成雙鏈的核酸。
[0076]進(jìn)一步，根據(jù)實(shí)施方式中使核酸電泳的方法，通過如上所述地降低核酸的等電點(diǎn)，可以增加樣品中核酸和污染物的等電點(diǎn)之間的差值。結(jié)果，可以抑制污染物的電泳，同時(shí)允許核酸進(jìn)行電泳，由此可以穩(wěn)定地分離核酸和污染物。所以，根據(jù)本實(shí)施方式的使核酸電泳的方法，可以以更高的純度純化核酸。
[0077]此外，通過要引入到區(qū)域113的緩沖液的低pH (例如從2到3)，在核酸具有負(fù)電荷而污染物的負(fù)電荷削弱的狀態(tài)下，可以執(zhí)行核酸的電泳，這能夠更精確地分離核酸和污染物。
[0078]進(jìn)一步，通過含陰離子官能團(tuán)的高分子凝膠14，可以通過帶負(fù)電荷的核酸和陰離子官能團(tuán)之間的電排斥力來防止核酸移入高分子凝膠14。如果核酸移動(dòng)到高分子凝膠14中，或者如果核酸穿過高分子凝膠14移動(dòng)到正極12側(cè)的區(qū)域112，則回收的核酸將減少。作為陰離子官能團(tuán)，優(yōu)選其酸解離常數(shù)為I到5。如果官能團(tuán)的pKa越小以及負(fù)電荷越大，防止核酸移動(dòng)到高分子凝膠14中的電場(chǎng)排斥力的效果也就越大。
[0079]此外，在區(qū)域113中的高分子凝膠14附近吸走緩沖液時(shí)在短時(shí)間里利用正極12和負(fù)極13之間的反向電壓對(duì)于以更大的量回收核酸是有效的。在回收核酸時(shí)短時(shí)間施加反向電壓可以將凝膠界面上的核酸以及凝膠界面附近凝膠內(nèi)部的核酸移到區(qū)域113中高分子凝膠14附近，從而可以用微量移液管2吸走核酸以回收。反向電壓的施加時(shí)間可以根據(jù)槽11的尺寸來設(shè)定所需要的時(shí)間，例如，可以是I秒到10秒。
[0080] (3)制造用于核酸電泳的盒的方法。
[0081]根據(jù)本實(shí)施方式，用于核酸電泳的盒可以如下地制造:使被引入基板上形成的槽11中的單體溶液通過光聚合而凝膠化為預(yù)定形狀，從而形成高分子凝膠14 ;以及將嵌入劑裝入槽11中。
[0082]基板上的槽11的形成例如可以通過將玻璃基板層進(jìn)行濕蝕刻或干蝕刻，或?qū)⑺芰匣鍖舆M(jìn)行納米壓印光刻(nanoimprint lithography)、注塑成型或切割來實(shí)施。應(yīng)該指出的是，在盒I上可以形成一個(gè)或多個(gè)槽11。
[0083]丙烯酰胺單體適合用作單體溶液。更優(yōu)選的是，可以使用具有陰離子官能團(tuán)的丙烯酰胺單體。進(jìn)一步優(yōu)選的是，可以使用酸解離常數(shù)在I到5之間的具有陰離子官能團(tuán)的丙烯酰胺單體。作為單體溶液，具體地，丙烯酰胺烷基磺酸(alkanesulfonic acid)可以是尤其優(yōu)選的。
[0084]優(yōu)選通過濺射或沉淀金或鉬來制備正極12和負(fù)極13。在這方面，根據(jù)相關(guān)技術(shù)的盒包括由鉬絲構(gòu)成的電極。在這種情況下，每當(dāng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，就需要把鉬絲布置在盒中用于核酸電泳。此外，由于鉬絲的價(jià)格昂貴，未提供一次性的盒。另一方面，如上述所描述，根據(jù)本實(shí)施方式，在用于核酸電泳的盒中，正極12和負(fù)極13通過濺射或沉淀金的方法來制備，以及由于這些電極預(yù)先形成在盒I中，所以，可以很容易處理盒I。此外，與根據(jù)相關(guān)技術(shù)的用于核酸電泳的盒相比，可以提供一次性的用于核酸電泳的盒I。因此，通過用于核酸電泳的盒1，可以避免樣品在濃縮時(shí)被污染。
[0085]2.根據(jù)本公開的第二實(shí)施方式的用于核酸電泳的盒、使核酸電泳的方法、以及制造用于核酸電泳的盒的方法。
[0086](I)用于核酸電泳的盒
[0087]與本公開的第一實(shí)施方式的描述相同，圖1是示出根據(jù)本公開的第二實(shí)施方式的用于核酸電泳的盒的構(gòu)成以及使用該盒使核酸電泳的方法的步驟的示意圖。首先，將參考圖1 (A)描述根據(jù)本公開的第二實(shí)施方式的用于核酸電泳的盒的構(gòu)成。
[0088]圖1 (A)的用于核酸電泳的盒(用參考數(shù)字I來表示)有在基板上形成的槽11 ;布置在槽11的兩端的正極12和負(fù)極13。槽11被配置為能夠?qū)⒁后w引入其中。將高分子凝膠14布置在槽11中正極12和負(fù)極13之間。而且，電源V連接到正極12和負(fù)極13使得能夠在被引入槽11中的液體上施加或解除電壓。與含有核酸的樣品中污染物中的的羧基進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)的化合物；和緩沖液被裝入槽11中。由此，根據(jù)本實(shí)施方式的用于核酸電泳的盒的槽11、正極12、負(fù)極13以及高分子凝膠14和本公開的第一實(shí)施方式中的基本相同。因此，在根據(jù)本實(shí)施方式的用于核酸電泳的盒中，將主要描述發(fā)生脫水縮合反應(yīng)的化合物和緩沖液。
[0089]進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)的化合物沒有特別的限制，只要能夠與含有核酸的樣品中污染物中的蛋白質(zhì)的羧基發(fā)生脫水縮合反應(yīng)的化合物即可。該化合物優(yōu)選至少具有與羧基發(fā)生脫水縮合反應(yīng)的第一陽離子官能團(tuán)；以及在核酸電泳過程中以離子態(tài)形式存在的第二陽離子官能團(tuán)。也就是說，優(yōu)選在化合物和污染物中的蛋白質(zhì)等的脫水縮合反應(yīng)后，化合物的一部分官能團(tuán)也能夠以離子態(tài)發(fā)生電泳。
[0090]進(jìn)一步，優(yōu)選的是，該化合物包含一個(gè)或多個(gè)氨基以酰胺鏈接至污染物的蛋白質(zhì)中的羧基。
[0091]該化合物的具體例子包括N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、乙醇胺、乙二胺等。
[0092]進(jìn)一步，優(yōu)選的是，用于脫水縮合反應(yīng)的縮合劑也被裝入槽11中?？s合劑可以優(yōu)選為碳二亞胺化合物?？s合劑的具體例子包括1-乙基-3- (3- 二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，4- (4，6- 二甲氧基-1, 3，5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(morpholiniumchloride) (DMT-MM)，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，二異丙基碳二亞胺(DIC)等。
[0093]在用于核酸電泳的盒的槽11中，優(yōu)選還加入緩沖液。緩沖液的pH沒有特別的限制，但是優(yōu)選pH為從3到4。另外，緩沖液的pH在4到5的范圍也可是合適的。而且，緩沖液的pH在6到7的范圍也可是合適的。再進(jìn)一步，緩沖液的pH在7到8的范圍也是合適的。另外，優(yōu)選的是緩沖液不含有羧基或氨基。緩沖液例子包括甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH:
2.0到3.0)，檸檬酸緩沖液(pH:3.0到6.0)，醋酸緩沖液(pH:3.0到5.5)，檸檬酸-磷酸緩沖液(pH:2.5 到 7.0),Tris (pH:7.2 到 9.0),MES (pH:3.0 到 7.0),Bis-Tris (pH:5.0 到
7.0), PBS (pH:5.0 到 8.0)等。
[0094]( 2)使核酸電泳的方法
[0095]下面，將參考圖1的(B)到(D)描述使用用于核酸電泳的盒的使核酸電泳的方法的步驟。
[0096]首先，將含有核酸的樣品引入到槽11的高分子凝膠14和負(fù)極13之間的區(qū)域113中(參見圖1(B))。這時(shí)，槽11中應(yīng)該填充有用于電泳的緩沖液。進(jìn)一步,上述化合物也應(yīng)該裝入在槽11的高分子凝膠14和 負(fù)極13之間的區(qū)域113中。
[0097]這時(shí)，存在被引入到區(qū)域113的含有核酸的樣品中包含的污染物，并且污染物中蛋白質(zhì)的羧基與上述化合物發(fā)生脫水縮合反應(yīng)。允許樣品液體和化合物發(fā)生脫水縮合反應(yīng)的步驟可以如下地執(zhí)行:將樣品液體引入預(yù)先容納在區(qū)域113中的化合物；或者允許化合物和樣品液體預(yù)先彼此反應(yīng)，然后將該樣品液體引入到區(qū)域113中。
[0098]由此，通過樣品液體中包含的污染物的蛋白質(zhì)與上述的化合物的脫水縮合反應(yīng)，蛋白質(zhì)的負(fù)電荷變成弱化狀態(tài)；等電點(diǎn)會(huì)變得更高。因此，根據(jù)本實(shí)施方式的使核酸電泳的方法，以與本公開中的第一實(shí)施方式的使核酸電泳的相同方式，樣品液體中包含的核酸和污染物的等電點(diǎn)的差值可被增加。
[0099]隨后，圖1 (C)和(D)中所示的核酸的濃縮和純化可以以與上述本公開的第一實(shí)施方式的濃縮和純化核酸的方法基本相同的方式進(jìn)行。
[0100]由此，根據(jù)本實(shí)施方式的使核酸電泳的方法，蛋白質(zhì)已與上述化合物發(fā)生脫水縮合反應(yīng)，該蛋白質(zhì)是包含在具有核酸的液體樣品的污染物中。結(jié)果，蛋白質(zhì)在發(fā)生脫水縮合反應(yīng)后負(fù)電荷減弱并且核酸的等電點(diǎn)變得更高。尤其是，在化合物含有多個(gè)陽離子官能團(tuán)的情況下，已與化合物發(fā)生脫水縮合反應(yīng)的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)明顯變高。因此，即使當(dāng)執(zhí)行核酸的電泳時(shí)，污染物從負(fù)極側(cè)向正極側(cè)的遷移變得困難。采用這種方式，根據(jù)本實(shí)施方式的使核酸電泳的方法，可以增加樣品液體中包含的核酸和污染物的等電點(diǎn)的差值。所以，通過使樣品中核酸電泳，可以穩(wěn)定地分離核酸和污染物。因此，根據(jù)本實(shí)施方式的使核酸電泳的方法，核酸可以以更高的純度被純化。
[0101]另外，通過引入到區(qū)域113中的緩沖液的更低的pH，電泳也可以在核酸具有負(fù)電荷而污染物不具有負(fù)電荷的狀態(tài)下完成，這也能更精確地分離核酸和污染物。所以，根據(jù)本實(shí)施方式的使核酸電泳的方法，核酸的濃縮系數(shù)可以進(jìn)一步增加。進(jìn)一步，根據(jù)本實(shí)施方式的使核酸電泳的方法，濃縮過程所需要的時(shí)間會(huì)縮短。通過使用這樣的使核酸電泳的方法，核酸擴(kuò)增反應(yīng)可以高精度執(zhí)行。
[0102]此外，污染物中的蛋白質(zhì)通過與N-羥基丁二酰亞胺反應(yīng)已經(jīng)形成了酰胺鍵的情況下，其它具有氨基官能團(tuán)的化合物(如乙醇胺)可以進(jìn)一步取代N-羥基丁二酰亞胺以與蛋白質(zhì)結(jié)合。由于蛋白質(zhì)與N-羥基丁二酰亞胺是彼此相對(duì)較弱的結(jié)合，所以可以根據(jù)需要選擇上面提到的其它具有氨基官能團(tuán)的化合物。
[0103](3)制造用于核酸電泳的盒的方法
[0104]根據(jù)本實(shí)施方式的用于核酸濃縮和純化的盒可以如下地制造:允許被引入基板上形成的槽11中的單體溶液通過光聚合而凝膠化為預(yù)定形狀，從而形成高分子凝膠14 ;以及將上述化合物裝入槽11中。根據(jù)上述所描述的所公開的第一實(shí)施方式，其它部分(如槽11的形成)可以采用與本公開上述第一實(shí)施方式的制造用于核酸電泳盒的方法基本相同的方式完成。
[0105]如上文所述，對(duì)各個(gè)實(shí)施方式進(jìn)行了說明。第一實(shí)施方式中描述的嵌入劑和第二實(shí)施方式描述的脫水縮合材料可以在本公開中結(jié)合使用。也就是說，通過允許核酸與嵌入劑鍵合以及通過允許樣品溶液中污染物的蛋白質(zhì)與N-羥基丁二酰亞胺等鍵合，可以執(zhí)行電泳以及可以濃縮核酸。通過組合使用嵌入劑和進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)的化合物，可以增加污染物的去除效率以及核酸濃縮效率。由此，可以在更短時(shí)間內(nèi)更高效地將核酸進(jìn)行濃縮等。
[0106]本公開可以采用以下配置。
[0107]( I) 一種使核酸電泳的方法，該方法包括:
[0108]使已插入了具有陰離子官能團(tuán)的嵌入劑的核酸電泳。
[0109](2)根據(jù)(I)所述的方法，其中，嵌入劑的酸解離常數(shù)要大于O且小于等于3。
[0110](3)根據(jù)(I)和(2)所述的方法，其中，所述官能團(tuán)是磺酸基。
[0111](4)根據(jù)(I)或(3)任意一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括:
[0112]在填充了緩沖液的槽的兩端施加電壓使得在所述槽中預(yù)定位置引入的所述核酸進(jìn)行電泳；以及
[0113]阻擋所述核酸移至正極端。
[0114](5)根據(jù)(4)中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，緩沖液的pH是5或小于5。
[0115](6) 一種濃縮和純化核酸的方法，該方法包括:
[0116]使已插入了具有陰離子官能團(tuán)的嵌入劑的核酸電泳。
[0117](7) —種用于核酸電泳的盒，包括:
[0118]槽，被形成為能夠引入液體；
[0119]用于阻擋物質(zhì)的阻擋部，布置在所述槽的預(yù)定位置；
[0120]電極，布置在所述槽的兩端；
[0121]能夠插入核酸的嵌入劑，具有陰離子官能團(tuán)；以及
[0122]緩沖液；
[0123]所述嵌入劑和所述緩沖液被容納在所述阻擋部與負(fù)極端之間。
[0124](8) 一種制造用于核酸電泳的盒的方法，該方法包括:
[0125]允許被引入基板上形成的槽中的單體溶液通過光聚合而凝膠化為預(yù)定形狀，從而形成高分子凝膠；以及
[0126]將能夠插入核酸的具有陰離子官能團(tuán)的嵌入劑裝入所述槽中。
[0127](9) 一種使核酸電泳的方法，該方法包括:
[0128]將含有核酸的樣品、具有與所述樣品中包含的物質(zhì)含有的羧基發(fā)生脫水縮合反應(yīng)的官能團(tuán)的化合物、以及所述脫水縮合反應(yīng)的縮合劑混合；以及
[0129]使所述核酸電泳。
[0130](10)根據(jù)(9)所述的方法，其中，所述官能團(tuán)為氨基；
[0131](11)根據(jù)(9)或(10)所述的方法，其中，所述化合物為乙醇胺和乙二胺。
[0132](12)根據(jù)(3)所述的方法，其中，
[0133]所述縮合劑包括選自1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，4_(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽、二環(huán)己基碳二亞胺以及二異丙基碳二亞胺中的一至少種。
[0134](13)根據(jù)(9)到(12)中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，
[0135]所述化合物至少具有:
[0136]與羧基發(fā)生脫水縮合反應(yīng)的第一陽離子官能團(tuán)以及
[0137]在電泳時(shí)以離子狀態(tài)存在的第二陽離子官能團(tuán)。
[0138](14)根據(jù)(9)到(13)中任意一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括:
[0139]在填充了緩沖液的槽的兩端施加電壓使得在所述槽中預(yù)定位置引入的所述核酸進(jìn)行電泳；以及
[0140]阻擋所述核酸移至正極端。。
[0141](15)根據(jù)(14)所述的方法，其中，
[0142]緩沖液的pH小于等于8。
[0143](16)根據(jù)(9)到(13)任意一種所述的方法，其中，
[0144]所述樣品包括至少以下一種樣品:
[0145]包含咽喉拭子、鼻腔拭子、陰道拭子、血液、血漿、血清、組織、組織碎片、痰、脊髓液、尿、汗和糞便中的至少一種的源自活體的樣品；或
[0146] 包含細(xì)胞培養(yǎng)液體、細(xì)菌培養(yǎng)液、食品中的液體和土壤中的至少一種的樣品。
[0147]( 17) 一種濃縮和純化核酸的方法，該方法包括:
[0148]將含有核酸的樣品、具有與所述樣品中包含的物質(zhì)含有的羧基發(fā)生脫水縮合反應(yīng)的官能團(tuán)的化合物、以及所述脫水縮合反應(yīng)的縮合劑混合；以及
[0149]使所述核酸電泳。
[0150](18) 一種用于核酸電泳的盒，包括:
[0151]槽，被形成為能夠引入液體；
[0152]阻擋物質(zhì)的阻擋部，布置在所述槽的預(yù)定位置；
[0153]電極，布置在所述槽的兩端；
[0154]具有與羧基發(fā)生脫水縮合反應(yīng)的官能團(tuán)的化合物；
[0155]所述脫水縮合反應(yīng)的縮合劑；以及
[0156]緩沖液；
[0157]所述化合物、所述縮合劑和所述緩沖液被容納在所述阻擋部與負(fù)極端之間。[0158](19) 一種制造用于核酸電泳的芯片的方法，該方法包括:
[0159]允許被引入基板上形成的槽中的單體溶液通過光聚合而凝膠化為預(yù)定形狀，從而形成高分子凝膠；以及
[0160]將具有與羧基發(fā)生脫水縮合反應(yīng)的官能團(tuán)的化合物、所述脫水縮合反應(yīng)的縮合劑、以及緩沖液裝入所述槽中。
[0161]實(shí)施例
[0162]1.用于核酸電泳的盒的制造
[0163]在PMMA基板上，形成寬為5毫米，長(zhǎng)為60毫米以及深度為2毫米的槽。在槽的相對(duì)端，分別布置由鉬絲(直徑:0.5毫米,長(zhǎng)度10毫米,Nilaco Corporation制造)形成的正極和負(fù)極。將槽填充按照表1和表2所制備的丙烯酰胺溶液(溶液2)。使用共焦點(diǎn)激光掃描顯微鏡(由Olympus Corporation制造的“FV1000”),實(shí)施丙烯酰胺的光聚合以在槽中形成5毫米深和3毫米長(zhǎng)的的高分子凝膠。隨后，將未聚合的丙烯酰胺溶液用電泳緩沖液(IXTBE)替換。
[0164]表1
【權(quán)利要求】
1.一種使核酸電泳的方法,所述方法包括: 使已插入了具有陰離子官能團(tuán)的嵌入劑的核酸電泳。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述嵌入劑的酸解離常數(shù)大于O且小于等于3。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述官能團(tuán)是磺酸基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，進(jìn)一步包括: 在填充有緩沖液的槽的兩端施加電壓使得在所述槽中預(yù)定位置引入的所述核酸進(jìn)行電泳；以及 阻擋所述核酸移至正極端。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述緩沖液的pH小于等于5。
6.一種濃縮和純化核酸的方法，所述方法包括: 使已插入了具有陰離子官能團(tuán)的嵌入劑的核酸電泳。
7.一種用于核酸電泳的盒，包括: 槽，被形成為能夠引入液體； 阻擋物質(zhì)的阻擋部，布置在所述槽的預(yù)定位置； 電極，布置在所述槽的兩端； 能夠插入到核酸的嵌入劑，具有陰離子官能團(tuán)；以及 緩沖液； 所述嵌入劑和所述緩沖液被容納在所述阻擋部與負(fù)極端之間。
8.—種制造用于核酸電泳的盒的方法，所述方法包括: 使被引入基板上形成的槽中的單體溶液通過光聚合而凝膠化為預(yù)定形狀，從而形成高分子凝膠；以及 將能夠插入到核酸的具有陰離子官能團(tuán)的嵌入劑裝入所述槽中。
9.一種使核酸電泳的方法,所述方法包括: 將含有核酸的樣品、具有與所述樣品中包含的物質(zhì)含有的羧基進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)的官能團(tuán)的化合物、以及所述脫水縮合反應(yīng)的縮合劑混合；以及使所述核酸電泳。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述官能團(tuán)是氨基。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述化合物為乙醇胺或乙二胺。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中， 所述縮合劑包括選自1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、4- (4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽、二環(huán)己基碳二亞胺和二異丙基碳二亞胺中的至少一種。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中， 所述化合物至少具有: 與羧基進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)的第一陽離子官能團(tuán)，以及 在電泳中以離子狀態(tài)存在的第二陽離子官能團(tuán)。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，進(jìn)一步包括: 在填充有緩沖液的槽的兩端施加電壓使得在所述槽中預(yù)定位置引入的所述核酸進(jìn)行電泳；以及阻擋所述核酸移至正極端。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中， 所述緩沖液的PH小于等于8。
16.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中， 所述樣品包括至少以下一種樣品: 包含咽喉拭子、鼻腔拭子、陰道拭子、血液、血漿、血清、組織、組織碎片、痰、脊髓液、尿、汗和糞便中的至少一種的源自活體的樣品；或 包含細(xì)胞培養(yǎng)液體、細(xì)菌培養(yǎng)液、食品中的液體和土壤中的至少一種的樣品。
17.一種濃縮和純化核酸的方法，所述方法包括: 將含有核酸的樣品、具有與所述樣品中包含的物質(zhì)含有的羧基進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)的官能團(tuán)的化合物、以及所述脫水縮合反應(yīng)的縮合劑混合；以及使所述核酸電泳。
18.一種用于核酸電 泳的盒，包括: 槽，被形成為能夠引入液體； 阻擋物質(zhì)的阻擋部，布置在所述槽的預(yù)定位置； 電極，布置在所述槽的兩端； 具有與羧基進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)的官能團(tuán)的化合物； 所述脫水縮合反應(yīng)的縮合劑；以及 緩沖液； 所述化合物、所述縮合劑和所述緩沖液被容納在所述阻擋部與負(fù)極端之間。
19.一種制造用于核酸電泳的盒的方法，所述方法包括: 使被引入基板上形成的槽中的單體溶液通過光聚合而凝膠化為預(yù)定形狀，從而形成高分子凝膠；以及 將具有與羧基進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)的官能團(tuán)的化合物、所述脫水縮合反應(yīng)的縮合劑、以及緩沖液裝入所述槽中。
【文檔編號(hào)】G01N27/447GK103476930SQ201280018410
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月22日
【發(fā)明者】中村友彥 申請(qǐng)人:索尼公司