免疫測(cè)定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種對(duì)測(cè)試樣品中的多重抗原特異性免疫球蛋白進(jìn)行定量的方法，該方法包括利用固定于固體支持物上的抗免疫球蛋白抗體、其片段或衍生物的系列稀釋液以及免疫球蛋白參比樣品的系列稀釋液，產(chǎn)生多個(gè)結(jié)合力曲線。使所述結(jié)合力曲線與利用對(duì)這些抗原的反應(yīng)性已知的血清樣品針對(duì)待測(cè)試的每個(gè)特定抗原產(chǎn)生的特定劑量反應(yīng)曲線相匹配，以提供一種校準(zhǔn)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠更加精確的分析樣品中的抗原特異性免疫球蛋白。本發(fā)明還提供了校正設(shè)備的方法，所述設(shè)備適于檢測(cè)多重抗原特異性免疫球蛋白與固定在固體支持物上的多重抗原或其片段的結(jié)合。本發(fā)明還提供了用于上述方法的多重變應(yīng)原測(cè)試系統(tǒng)和試劑盒。
【專利說明】免疫測(cè)定
[0001]本發(fā)明涉及一種對(duì)樣品中IgE水平進(jìn)行定量的免疫測(cè)定方法，校正適于實(shí)施所述定量的設(shè)備的方法和一種實(shí)現(xiàn)所述定量的系統(tǒng)。
[0002]免疫測(cè)定是利用抗體結(jié)合性能的方法。通常，免疫測(cè)定用于分析樣品中特定抗原特異性抗體的存在。這種測(cè)定是通過在固定于固體支持物上的抗原上洗滌樣品，隨后使用不同的技術(shù)使任何結(jié)合的抗體可視化。
[0003]通常，免疫測(cè)定需要使用校準(zhǔn)物來給未知的樣品分配數(shù)值或濃度。在經(jīng)典的免疫測(cè)定中，使用一組校準(zhǔn)物繪出信號(hào)對(duì)濃度的校準(zhǔn)曲線，并通過插入法(interpolation)確定未知樣品的濃度。
[0004]過敏狀況通過對(duì)無害環(huán)境抗原的不當(dāng)和放大的免疫反應(yīng)來表征。這些抗原統(tǒng)稱為變應(yīng)原(過敏原)。對(duì)變應(yīng)原的免疫反應(yīng)包括第一階段致敏，該階段包括(i)抗原呈遞細(xì)胞(APC)處理變應(yīng)原，(ii)用APC將處理的變應(yīng)原呈遞至T輔助O (ThO)靜止細(xì)胞，(iii)ThO靜止細(xì)胞分化成Th2細(xì)胞，和(iv) Th2細(xì)胞刺激B細(xì)胞，導(dǎo)致B細(xì)胞產(chǎn)生和分泌變應(yīng)原特異性 IgE0
[0005]每種特異性變應(yīng)原都將刺激產(chǎn)生對(duì)該變應(yīng)原具有特異性的IgE。IgE抗體可與兩種不同的細(xì)胞類型相互作用:肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，其含有含組胺的顆粒。
[0006]當(dāng)引發(fā)致敏階段的相同變應(yīng)原第二次進(jìn)入體內(nèi)，并被適當(dāng)?shù)姆蚀蠹?xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞識(shí)別時(shí)，激發(fā)變態(tài)反應(yīng)機(jī)制的第二個(gè)階段，稱為“激發(fā)階段”。變應(yīng)原與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面呈遞的其特異性IgE結(jié)合，觸發(fā)了最終導(dǎo)致肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫粒并分泌組胺的機(jī)制，而組胺是變態(tài)反應(yīng)中典型的炎性反應(yīng)原因。隨后發(fā)生的變態(tài)反應(yīng)的激烈程度取決于該個(gè)體中變應(yīng)原特異性IgE的水平。因此，檢測(cè)并量化個(gè)體中針對(duì)特定變應(yīng)原產(chǎn)生的IgE濃度，以便能夠鑒定變應(yīng)性(或特應(yīng)性)個(gè)體并表征其變態(tài)反應(yīng)，這很重要。
[0007]診斷變應(yīng)原的定量免疫測(cè)定通常使用或參考世界衛(wèi)生組織(WHO)國(guó)際參比制品(International Reference Preparation) 75/502 來構(gòu)建校準(zhǔn)系統(tǒng)。這是一種具有確定的IgE反應(yīng)性的凍干的人血清樣品(Kontis K,等(2006), Correlation of theTurbo-MP RIA with ImmunoCAP FEIA for Determination of Food Allergen-SpecificImmunoglobulin-E.Ann Clin Lab Sc1.36 (I):79-87;Bousquet J 等(1990)Comparisonbetween RAST and Pharmacia CAP system:A new automated specific IgE assay.JAllergy Clin Tmmunol.85 (6): 1039-43;產(chǎn)品參考:http: //www.nibsc.ac.uk/documents/ifu/75-502.pdf)。
[0008]典型的，測(cè)量的變應(yīng)原特異性IgE抗體的反應(yīng)值通過針對(duì)總IgE校準(zhǔn)曲線(WHO國(guó)際參比制品)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并以變應(yīng)原特異單元/升(kUA/Ι)的濃度表示。使用IgE參比曲線來描述測(cè)試的所有變應(yīng)原的劑量響應(yīng)曲線。這需要對(duì)固定在固體支持物上的免疫測(cè)定用變應(yīng)原性成分進(jìn)行濃度優(yōu)化，以使IgE和變應(yīng)原的劑量響應(yīng)曲線顯示出相同的趨勢(shì)。為優(yōu)化劑量響應(yīng)曲線中變應(yīng)原性濃縮物的濃度，針對(duì)反應(yīng)性已知的樣品組測(cè)定變應(yīng)原的不同濃度，以鑒定出產(chǎn)生與WHO國(guó)際參比總IgE曲線的形狀和傾斜度均類似的劑量響應(yīng)曲線的濃度。[0009]目前用于變應(yīng)性疾病的免疫測(cè)定包括:放射性過敏原吸附試驗(yàn)(RAST)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和 ImmunoCAP。
[0010]RAST涉及將變應(yīng)原(或其他抗原)與紙盤固相共價(jià)偶聯(lián)。隨后將紙盤與來自要檢測(cè)變態(tài)反應(yīng)狀況的病人的血清共同孵育。如果血清中存在針對(duì)該變應(yīng)原的抗體，則抗體與所結(jié)合的變應(yīng)原發(fā)生反應(yīng)，并通過放射性標(biāo)記抗IgE抗體來顯示這種結(jié)合。在其最初的形式中，測(cè)試結(jié)果通過從異源IgE抗白樺花粉參比曲線的內(nèi)插以等級(jí)或任意單位的形式報(bào)告。偶聯(lián)于紙盤上的白樺變應(yīng)原與具有已知反應(yīng)性的血清樣品共同孵育，通過針對(duì)已知IgE濃度對(duì)獲得的信號(hào)繪制曲線產(chǎn)生參比曲線。如上所述，WH0/NIBSC國(guó)際參比IgE制品通常被用于校準(zhǔn)白樺參比系統(tǒng)。
[0011]類似的，ELISA涉及將吸附到固相(典型的為塑料多孔板)的變應(yīng)原(或其他抗原)與待測(cè)病人的血清一起孵育。通過將與吸附在固相上的變應(yīng)原結(jié)合的IgE與酶聯(lián)抗IgE抗體共孵育，并隨后加入酶的適當(dāng)?shù)孜?，來揭示樣品中IgE與吸附變應(yīng)原的結(jié)合。底物催化導(dǎo)致平板上的顏色變化。通過將顏色信號(hào)插入?yún)⒈惹€來測(cè)量色彩的強(qiáng)度，從而能夠量化血清IgE。通過用捕獲抗人IgE抗體包被ELISA孔，并將其先與WH0/NIBSC國(guó)際參比IgE制備標(biāo)準(zhǔn)品共孵育，隨后與具有適當(dāng)?shù)孜锏拿嘎?lián)抗IgE抗體共孵育，從而產(chǎn)生參比曲線。所述捕獲抗IgE的濃度在參比孔中保持恒定，對(duì)參比IgE制品進(jìn)行滴定以獲得參比曲線。
[0012]例如，由ALLERGOPHARMA生產(chǎn)的ELISA RV-5試劑盒由一種吸附于置于平底96孔板底部的紙盤的單濃度變應(yīng)原以及包被有單濃度的捕獲抗人IgE的盤組成。當(dāng)將變應(yīng)原包被的盤與人血清共孵育時(shí)，包被有捕獲抗IgE的盤與來源于WH0/NIBSC國(guó)際參比的人IgE制品雜交。隨后通過針對(duì)來自包被有捕獲抗IgE孔板的信號(hào)強(qiáng)度和已知的WHO/NIBSC IgE濃度繪制參比曲線。HYCOR用于變應(yīng)性測(cè)試的全自動(dòng)酶免疫測(cè)定(EIA)就是基于同樣的原理。
[0013]CAP系統(tǒng)-PHADIA (對(duì)照法)在固相-1mmunoCAP的本質(zhì)上與上述方法實(shí)質(zhì)上不同。ImmunoCAP的固相是一種CNBr-激活的纖維素衍生物，其與其他底物相比具有更高的結(jié)合能力(David W.(2006), The immunoassay handbook, Elsevier Ltd 出版)。期望的變應(yīng)原共價(jià)偶聯(lián)于包裝于膠囊中的親水載體多聚體上。所述載體由具有高蛋白結(jié)合特性的纖維素衍生物組成。ImmunoCAP可與病人血清中的特異性IgE反應(yīng),在將未結(jié)合的IgE洗去后,力口入酶-標(biāo)記的抗IgE抗體以形成復(fù)合物，隨后將其與熒光底物共孵育。與使用ELISA方法相同，通過向用于校準(zhǔn)的異源總血清-1gE劑量響應(yīng)曲線中插入，顏色強(qiáng)度提供了血清中變應(yīng)原特異性IgE水平的指示。該測(cè)試通過WHO的IgE標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)，包括兩組校準(zhǔn)物:
0.35-100kUA/l (用于特異性IgE Ab和窄量程總IgE)和2_2000kUA/l (用于寬量程總IgE)。抗-1gE經(jīng)設(shè)計(jì)允許劑量響應(yīng)曲線具有相同初始斜率的更寬量程。隨后分別對(duì)所有固相變應(yīng)原的最大容量、響應(yīng)和相對(duì)于量程的低背景噪聲進(jìn)行個(gè)體優(yōu)化。
[0014]PHADIA生產(chǎn)的ImmunoCAP ISAC試劑盒是一種基于微陣列的變態(tài)反應(yīng)診斷測(cè)試。它基于現(xiàn)代生物芯片技術(shù)。ImmunoCAP ISAC是一種小型化免疫測(cè)定平臺(tái)，可以允許針對(duì)許多變應(yīng)原成分的特定IgE抗體的多重測(cè)量。將純化的天然或重組變應(yīng)原(40種常見的變應(yīng)原來源)成分固定在固體支持物(生物芯片)上。這是一種兩步化測(cè)定。第一步，使來自病人血清的IgE抗體與所固定的變應(yīng)原成分結(jié)合。第二步，在短暫的洗滌步驟之后，用熒光標(biāo)記的抗-1gE抗體檢測(cè)結(jié)合有變應(yīng)原的IgE抗體。ImmunoCAP ISAC是一種半定量測(cè)試，其結(jié)果以ISAC標(biāo)準(zhǔn)化單位(ISU)報(bào)告。
[0015]Deinhofer等(2004)Methods:32:249_254描述了將微陣列技術(shù)用于多重-變應(yīng)原測(cè)試系統(tǒng)。
[0016]EP1322960B1描述了一種基于微陣列的變應(yīng)原測(cè)試系統(tǒng)。
[0017]在本發(fā)明的說明書中對(duì)明顯的在先出版文件的羅列或討論不應(yīng)必然的視為承認(rèn)該文件是現(xiàn)有技術(shù)狀況的一部分或是常規(guī)的一般性知識(shí)。
[0018]本發(fā)明尋求解決上述免疫測(cè)定的問題。本發(fā)明提供一種對(duì)測(cè)試樣品的IgE水平進(jìn)行更精確的定量的免疫測(cè)定方法。
[0019]第一方面，本發(fā)明提供一種對(duì)測(cè)試樣品中的多重抗原特異性免疫球蛋白進(jìn)行定量的方法，該方法包含以下步驟:
[0020](i)分析系列樣品與固定于第一固體支持物上的多重重組或純化抗原成分或其片段的結(jié)合，所述樣品為例如血清樣品，其含有已知抗原反應(yīng)性的免疫球蛋白，該免疫球蛋白與測(cè)試樣品中的免疫球蛋白具有相同亞型，
[0021](ii)將步驟⑴中的結(jié)合水平與已知反應(yīng)性進(jìn)行比較，從而產(chǎn)生針對(duì)每種抗原成分或其片段的劑量響應(yīng)曲線，
[0022](iii)分析參比免疫球蛋白樣品的系列稀釋液與固定于第一或第二固體支持物上的抗免疫球蛋白抗體、其片段或衍生物的系列稀釋液的結(jié)合，其中所述參比免疫球蛋白樣品與步驟(i)使用的屬于相同的免疫球蛋白亞型，具有已知免疫球蛋白總量，
[0023](iv)將步驟(iii)中的結(jié)合水平與參比免疫球蛋白的已知總量進(jìn)行比較，以針對(duì)每種抗免疫球蛋白抗體、其片段或衍生物稀釋液產(chǎn)生結(jié)合力曲線，
[0024](V)將步驟(ii)中產(chǎn)生的劑量響應(yīng)曲線與步驟(iv)中產(chǎn)生的結(jié)合力曲線進(jìn)行比較，針對(duì)每種抗原或其片段鑒定出與劑量響應(yīng)曲線最密切匹配的結(jié)合力曲線，在此基礎(chǔ)上，為每種抗原或其片段分配(assign)結(jié)合力曲線，
[0025](vi)分析測(cè)試樣品中的抗原特異性免疫球蛋白與固定于第一、第二或第三固體支持物上的重組或純化抗原成分或其片段的結(jié)合，和
[0026](vii)將步驟(vi)關(guān)于每種單獨(dú)抗原或其片段的結(jié)合水平與步驟(V)中分配給該抗原或其片段的結(jié)合力曲線進(jìn)行比較，對(duì)測(cè)試樣品中存在的抗原特異性免疫球蛋白的水平
進(jìn)行定量。
[0027]含有已知免疫球蛋白反應(yīng)性的樣品可以是含有已知的對(duì)特定抗原的免疫球蛋白反應(yīng)性的任何樣品。優(yōu)選的，該樣品含有已知的IgE反應(yīng)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，樣品的反應(yīng)性應(yīng)在其應(yīng)用于本發(fā)明的方法之前已通過適當(dāng)?shù)拿庖邷y(cè)定方法測(cè)定。上文提供了適當(dāng)?shù)拿庖邷y(cè)定方法的例子，例如ELISA。優(yōu)選的，樣品是血清樣品，例如人血清樣品。反應(yīng)性表示為國(guó)際單位/毫升(IU/ml)。例如通過針對(duì)IgE反應(yīng)性(表示為國(guó)際單位/ml)對(duì)免疫測(cè)定中獲得的熒光基團(tuán)信號(hào)強(qiáng)度作圖，產(chǎn)生劑量響應(yīng)曲線。
[0028]目的是，步驟(i)使用的系列樣品包含一組樣品；每個(gè)樣品都可以與一種或多種固定化的或其他抗原反應(yīng)。該步驟利用了不同樣品的不同特性，每種樣品可對(duì)同樣的抗原具有不同的反應(yīng)性水平，以對(duì)每種抗原提供寬范圍的不同結(jié)合水平。例如，樣品I可對(duì)抗原A具有反應(yīng)性X，樣品2可對(duì)抗原A具有反應(yīng)性y，樣品3可對(duì)抗原A具有反應(yīng)性z。當(dāng)將樣品I到3對(duì)抗原A的反應(yīng)性繪制到曲線上時(shí)，即產(chǎn)生了劑量響應(yīng)曲線。因此，這些對(duì)相同抗原和對(duì)不同抗原具有不同反應(yīng)性的樣品被用于構(gòu)建針對(duì)在本發(fā)明方法隨后的步驟中使用的每種固定化抗原的劑量反應(yīng)曲線。
[0029]可以預(yù)期的是，已知反應(yīng)性的樣品和/或測(cè)試樣品是從患者，例如人類獲得的樣品。樣品可以是血清樣品，全血樣品，血漿樣品，淋巴樣品，腦脊液樣品，骨髓樣品，肺抽吸樣品，尿樣品，糞樣品，唾液樣品，痰樣品，組織樣品或其他任何含有免疫球蛋白的樣品。優(yōu)選的，樣品是含有已知IgE反應(yīng)性的血清樣品。
[0030]參比免疫球蛋白樣品根據(jù)測(cè)試樣品中期望待測(cè)的免疫球蛋白的類別而含有適當(dāng)類別的免疫球蛋白。例如，如果免疫測(cè)定是針對(duì)測(cè)試樣品中的IgE的測(cè)定，參比免疫球蛋白樣品將含有已知的總IgE。參比免疫球蛋白樣品可以是任何具有已知總免疫球蛋白濃度的免疫球蛋白樣品。例如，當(dāng)免疫球蛋白是IgE時(shí)，參比IgE樣品可以是WH0/NIBSC國(guó)際參比?？侷gE可以表示為國(guó)際單位/ml。
[0031]當(dāng)免疫球蛋白是IgG、IgA和/或IgM，或任何其他可用于本發(fā)明方法的免疫球蛋白亞類時(shí)，替換方案是可預(yù)期的。提供合適的抗免疫球蛋白抗體可用來產(chǎn)生結(jié)合力曲線，以表示特定抗原與這些不同類別免疫球蛋白各個(gè)之間的結(jié)合能力。也就是說，當(dāng)待測(cè)的免疫球蛋白亞類是IgA時(shí)，參比免疫球蛋白和已知反應(yīng)性的免疫球蛋白樣品將含有合適的IgA，并且抗免疫球蛋白抗體將是抗IgA。
[0032]固定于第一或進(jìn)一步的固體支持物上的第一方面步驟(iii)提供的抗免疫球蛋白抗體涉及測(cè)試樣品中期望待測(cè)的抗體類別。例如，如果期望檢測(cè)測(cè)試樣品中的變應(yīng)原特異性IgE抗體，則血清樣品和參比樣品將含有分別含有已知反應(yīng)性和已知總IgE的IgE。因此，抗免疫球蛋白抗體將是抗IgE抗體?？姑庖咔虻鞍卓贵w的抗體亞類通常是IgG。因此，可以預(yù)期，抗免疫球蛋白抗體可以是抗IgE、IgG抗體。
[0033]“抗原”的含義包括含有被免疫球蛋白特異性識(shí)別的表位的任何化合物。因此，抗原可來自天然提取物，可以是重組蛋白，或其他蛋白，或其他純化自天然提取物的分子(例如多糖)，或任何其他來源?？乖瓋?yōu)選是變應(yīng)原，即被認(rèn)為有能力在與個(gè)體接觸時(shí)在該個(gè)體中引起變態(tài)反應(yīng)的變應(yīng)原?？乖梢允且驯碚鞯淖儜?yīng)原，或尚待表征的變應(yīng)原?？梢灶A(yù)期，抗原可以是任何被IgG分子特異性識(shí)別的化合物。
[0034]可包含在固體支持物上的變應(yīng)原成分的例子包括:Der pi和Der p2 -塵螨、屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)中主要的變應(yīng)原分子；Bet vl 和 Bet v2 -白樣花粉中主要的變應(yīng)原分子；Phl pl,Phl p5，Phl p2和Phl p6_梯牧草花粉中主要的變應(yīng)原分子。
[0035]上述第一方面的步驟(ii)提供固體支持物上含有的每種抗原的劑量響應(yīng)曲線。固體支持物上的抗原濃度可以進(jìn)行優(yōu)化，以便獲得合適的響應(yīng)?？梢詮牡鞍诐舛确矫?，并通過使用最合適的緩沖液，對(duì)抗原(例如變應(yīng)原)進(jìn)行優(yōu)化?？乖瓭舛群途彌_液的優(yōu)化在本發(fā)明的方法實(shí)施前進(jìn)行。優(yōu)化通過針對(duì)每種抗原鑒定出最合適的蛋白濃度和最合適的緩沖液而進(jìn)行，所述緩沖液用于稀釋蛋白質(zhì)，從而在與針對(duì)該給定抗原具有已知反應(yīng)性的樣品相比時(shí)在反應(yīng)性方面具有最高的一致性。用于溶解待固定于固體支持物的抗原和優(yōu)化抗原濃度的適當(dāng)緩沖液的例子包括:pH7.4的磷酸鹽緩沖液，pH7.4的磷酸鹽緩沖液并加入0.lg/1吐溫20，和/或pH7.4的磷酸鹽緩沖液并加入10%甘油。
[0036]完成第一方面的步驟(i)到(iv)后，本領(lǐng)域技術(shù)人員將得到每種固定化抗原的劑量響應(yīng)曲線和存在于第一或進(jìn)一步的固體支持物上的每個(gè)濃度的抗免疫球蛋白抗體的結(jié)合力曲線。因此，將產(chǎn)生兩個(gè)圖表:第一個(gè)比較了每種抗原的結(jié)合強(qiáng)度與已知樣品中存在的抗原特異性免疫球蛋白的反應(yīng)性(參見圖1，含有IgE樣品的曲線的實(shí)例)；第二個(gè)比較了抗免疫球蛋白抗體每種稀釋液的結(jié)合強(qiáng)度與參比樣品中存在的總免疫球蛋白的增加的濃度(參見圖2A，含有IgE樣品的曲線的實(shí)例)。
[0037]第一方面的步驟(V)提供了上述兩個(gè)圖表的比較，以使每種抗原產(chǎn)生的曲線與每種抗免疫球蛋白抗體濃度產(chǎn)生的曲線相匹配。這種比較可以以可視方式或其他方式進(jìn)行，例如使用計(jì)算機(jī)軟件。
[0038]一旦將每種抗原樣品與特定抗免疫球蛋白濃度相匹配，則將該免疫球蛋白濃度分配給該抗原，并隨后用作更加精確的參比或校準(zhǔn)，更精確的描述了該特定抗原的結(jié)合力的該抗原的曲線。因此，特異于測(cè)試樣品中的該抗原的抗體濃度可以通過使用該抗原的新分配的結(jié)合力校準(zhǔn)曲線而得到更精確的描述。
[0039]發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，作為本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)操作而使用單個(gè)參比曲線來校準(zhǔn)多重抗原尤其是多重變應(yīng)原的免疫測(cè)定，不足以描述不同變應(yīng)原所表現(xiàn)出來的不同結(jié)合力。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)免疫測(cè)定在與不同變應(yīng)原提取物共孵育的具有已知IgE反應(yīng)性的血清樣品上進(jìn)行時(shí)，利用針對(duì)每種變應(yīng)原產(chǎn)生的數(shù)據(jù)獲得了不同的劑量響應(yīng)曲線。這在圖1中有舉例說明。因此，在變應(yīng)原測(cè)定的實(shí)例中，當(dāng)在多重分析中測(cè)試多重變應(yīng)原時(shí)，以往變應(yīng)原免疫測(cè)定中使用的校準(zhǔn)系統(tǒng)不足以提供關(guān)于血清樣品IgE反應(yīng)性的精確定量信息。
[0040]發(fā)明人尋求提供一種校準(zhǔn)系統(tǒng)，其可以克服已有免疫測(cè)定的不足并提供更加精確的定量免疫測(cè)定。本發(fā)明中，基于抗原結(jié)合力，將不同的參比曲線分配給每種抗原的步驟，使得能夠?qū)y(cè)試樣品中特定免疫球蛋白進(jìn)行更加精確的定量。在變應(yīng)原測(cè)試的實(shí)例中，本發(fā)明以比以往測(cè)試更精確的方式描述了變應(yīng)原劑量響應(yīng)行為。
[0041]結(jié)合力曲線可以讀入控制免疫分析設(shè)備的軟件中，作為將來測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)?？蓪⒚總€(gè)測(cè)試的內(nèi)部對(duì)照用于彌補(bǔ)每個(gè)測(cè)試中的微小環(huán)境變化。然而，可以預(yù)期，為保證測(cè)定的準(zhǔn)確性，如本發(fā)明所教導(dǎo)，當(dāng)新批次的變應(yīng)原制備好并將荷載到固體支持物上時(shí)，可以適當(dāng)調(diào)整結(jié)合力曲線或產(chǎn)生新的結(jié)合力曲線。此種質(zhì)量控制活動(dòng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的。
[0042]第一方面的步驟(Vi)和(Vii)利用之前步驟產(chǎn)生的結(jié)合力曲線來對(duì)測(cè)試樣品中的抗原特異性免疫球蛋白水平進(jìn)行定量?？梢灶A(yù)期，根據(jù)用于實(shí)現(xiàn)該方法的測(cè)定設(shè)備要求，在第一方面中描述的所有固定化成分均可被固定化于相同或不同的固體支持物上。因此，所有合適的固定化成分均可以被固定于相同的固體支持物上，例如芯片，包括抗原、捕獲免疫球蛋白和陰性、陽性對(duì)照。然而，可以預(yù)期，可以將每種樣品與不同的固體支持物，如芯片一起孵育，以防止交叉污染。因此，在每個(gè)測(cè)定中可使用數(shù)個(gè)固體支持物，例如芯片。例如，如果要在固體支持物上孵育50個(gè)血清樣品，可以使用固定有適當(dāng)?shù)目乖?免疫球蛋白/對(duì)照的50個(gè)獨(dú)立的固體支持物。同樣，每個(gè)參比樣品也可以孵育于不同的固體支持物上，以防止交叉污染。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，使用的測(cè)定設(shè)備將影響樣品孵育的精確細(xì)節(jié)。
[0043]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，參比免疫球蛋白樣品(例如WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)IgE)使用最終免疫球蛋白濃度，范圍為0.1到100IU/ml。優(yōu)選的，待固定在固體支持物上的抗免疫球蛋白抗體(例如抗IgE抗體)的使用濃度范圍為30到0.1 μ g/ml。
[0044]術(shù)語“免疫球蛋白”在本發(fā)明中可與術(shù)語“抗體”互換使用。[0045]第一方面可進(jìn)一步包括如下步驟，將步驟(iv)生成的結(jié)合力曲線群集成代表性的結(jié)合力曲線以代表不同的結(jié)合力水平，例如，極高度結(jié)合、高度結(jié)合、中等結(jié)合和低結(jié)合，其中將步驟(ii)中產(chǎn)生的劑量響應(yīng)曲線與代表性結(jié)合力曲線，而不是步驟(iv)中產(chǎn)生的結(jié)合力曲線進(jìn)行步驟(V)中的比較。
[0046]可以預(yù)期，將該進(jìn)一步的提供更少的經(jīng)鞏固結(jié)合力曲線的步驟納入將簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)管理，從而簡(jiǎn)化校準(zhǔn)過程。這些結(jié)合力曲線，如圖2B所例舉，將被儲(chǔ)存于免疫測(cè)定分析儀設(shè)備的軟件中用于將來的樣品分析。
[0047]“抗免疫球蛋白抗體、其片段或衍生物”包括以下含義:抗體包含抗體或其抗原結(jié)合片段，例如類Fab分子；Fv分子；單鏈Fv (ScFv)分子,其Vh和\配對(duì)結(jié)構(gòu)域通過彈性寡肽連接；和含有分離的V結(jié)構(gòu)域的單鏈抗體(dAbs)，其也可以是任何其他表現(xiàn)出上面提到的優(yōu)選結(jié)合特性的配基。
[0048]在第二方面，本發(fā)明提供了一種校準(zhǔn)設(shè)備的方法，所述設(shè)備適于測(cè)定多重抗原特異性免疫球蛋白與固定于固體支持物中的多重抗原或其片段的結(jié)合，該方法包含如下步驟:
[0049](i)分析系列樣品與固定于第一固體支持物上的多重重組或純化抗原成分或其片段的結(jié)合，所述樣品為例如具有已知抗原反應(yīng)性的免疫球蛋白的血清樣品，
[0050](ii)將步驟(i)中的結(jié)合水平與已知反應(yīng)性進(jìn)行比較，以針對(duì)每種抗原成分或其片段產(chǎn)生劑量響應(yīng)曲線，
[0051](iii)分析參比免疫球蛋白樣品的系列稀釋液與固定于第一或第二固體支持物上的抗免疫球蛋白抗體、其片段或衍生物的系列稀釋液的結(jié)合，其中所述參比免疫球蛋白樣品與步驟(i)使用的屬于相同的免疫球蛋白亞型，具有已知免疫球蛋白總量，
[0052](iv)將步驟(iii)中的結(jié)合水平與參比免疫球蛋白的已知總量進(jìn)行比較，以針對(duì)每種抗免疫球蛋白抗體、其片段或衍生物稀釋液產(chǎn)生結(jié)合力曲線，
[0053](V)將步驟(ii)中產(chǎn)生的劑量響應(yīng)曲線與步驟(iv)中產(chǎn)生的結(jié)合力曲線進(jìn)行比較，針對(duì)每種抗原或其片段鑒定出與劑量響應(yīng)曲線最密切匹配的結(jié)合力曲線，在此基礎(chǔ)上，為每種抗原或其片段分配結(jié)合力曲線，和
[0054](vi)將步驟(V)產(chǎn)生的結(jié)合力曲線輸入設(shè)備，以使每種抗原的結(jié)合力曲線能插入由含有未知量的特異性結(jié)合該抗原的免疫球蛋白的樣品產(chǎn)生的信號(hào)。
[0055]第二方面可進(jìn)一步包括如下步驟，將步驟(iv)生成的結(jié)合力曲線群集成代表性的結(jié)合力曲線以代表不同的結(jié)合力水平，例如，極高度結(jié)合、高度結(jié)合、中等結(jié)合和低結(jié)合，其中將步驟(ii)中產(chǎn)生的劑量響應(yīng)曲線與代表性結(jié)合力曲線，而不是步驟(iv)中產(chǎn)生的結(jié)合力曲線進(jìn)行步驟(V)中的比較。
[0056]一旦使用第二方面的方法校準(zhǔn)了所述設(shè)備，其就可以用于分析和量化測(cè)試樣品中的抗原特異性免疫球蛋白。
[0057]例如，可以在進(jìn)行適當(dāng)處理使結(jié)合抗體的抗原可視化后，使用ADAM設(shè)備(Microtest Matrices Ltd)讀出微陣列玻片(固體支持物)。收集原始數(shù)據(jù)并用于計(jì)算劑量響應(yīng)曲線。設(shè)備的輸出形式是文本文件，其中列舉了微陣列的所有點(diǎn)；他們通過坐標(biāo)以及數(shù)值來描述，其中數(shù)值是微陣列上每個(gè)點(diǎn)釋放的光子。使用類似Matlab的數(shù)字計(jì)算環(huán)境，對(duì)所有來自閱讀器的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，并產(chǎn)生一組描述劑量響應(yīng)曲線的因子。ADAM設(shè)備運(yùn)用這些因子構(gòu)建插入配置文件中的內(nèi)部控制校準(zhǔn)曲線。
[0058]在第一和第二方面的優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗原是變應(yīng)原，免疫球蛋白是IgE，抗免疫球蛋白抗體是抗IgE抗體。因此，在該實(shí)施方式中，通過分析來自病人的樣品對(duì)固定于固體支持物上的變應(yīng)原成分或其片段的IgE反應(yīng)性，該方法可被用于檢測(cè)病人對(duì)特定變應(yīng)原的變態(tài)反應(yīng)。這些信息有助于針對(duì)特定變應(yīng)原的變態(tài)反應(yīng)診斷。
[0059]可以固定在固體支持物上的變應(yīng)原的例子列舉于表I中。
[0060]表1:變應(yīng)原列表
[0061]變應(yīng)原列表
藥物F44 (草莓)M2 枝鼻菌(Chdoi^poriwn




erbantm)
Cl (青霉素G)F45 (烘焙酵母)M3 煙曲霉(AspergilIm




Jimiigatus)
Cl (青霉素V)F46 (辣椒)M4葡萄狀毛霉菌(Mucor




racemosus)
C214(阿莫西林)F49(蘋果)M5白色念珠菌(Cmdida




albicans)
鑛M6 細(xì)鏈格抱(W/ZerMr/o tenuis)
Dl 屋塵蛾(Dermatophagoides F74 (雞蛋 >M7 灰匍 ?π.]抱菌{Botrytis
pteronyssinus)cinerea)
D2粉塵螨(Den題F76(cx乳清蛋白)M9串珠鎌刀菌(Fusmimn




JnoniIiforme)
D3 表皮蛾{Dennatophagoides F77(p 乳清蛋白)M13 筆點(diǎn)霉microceras)
D70 粗腳粉螨siro)M20 蜂毛霉菌(Micor mucedo)
D71 (Lepidoglyjiis destructor)F83 (雞肉)樹的花粉
D72 腐食酸螨(Tywphagits F84 (稱猴桃)T2 (梧木)putrescentim)
D73 家甜食螨[Gfyciphagus FM (芹菜)? (白樺花粉)domesticus)
動(dòng)物上皮F92(香蕉)T4(榛子)
EI (貓毛)F95 (桃>Τ5 (歐洲山毛櫸)
Ε2(狗毛)草的花粉Τ6(高山雪松)
Ε3 (馬毛>Gl (甜黃花茅)Τ7 (橡樹>

G2 (狗牙根草/匍匐冰蘋)T9 (橄欖樹)
Ε78澳洲長(zhǎng)尾小鸚鵡羽毛(Budgerigar G3 (野茅)Tll (懸鈴木)feathers)
E81(綿羊上皮)G4(牛尾草>T14(白楊)
Ε82(兔上皮>G5(多年生黑麥草)Τ901(?蠟樹)
食物變應(yīng)原G6 (梯牧草)T卯4 (黃華柳)
Fl (蛋白)G8 (莓系屬牧草，六月-肯塔雜草花粉

基)
F2 (牛奶)G12(栽培黑麥)Wl (常見豚草)
F3(鱈魚:)G14(栽培燕麥)W6(艾蒿)
[0062]
【權(quán)利要求】
1.一種對(duì)測(cè)試樣品中的多重抗原特異性免疫球蛋白進(jìn)行定量的方法，所述方法包括以下步驟: (i)分析系列樣品與固定于第一固體支持物上的多重重組或純化抗原成分或其片段的結(jié)合，所述樣品含有具有已知抗原反應(yīng)性的免疫球蛋白， (ii)將步驟(i)中的結(jié)合水平與已知反應(yīng)性進(jìn)行比較，從而產(chǎn)生針對(duì)每種抗原成分或其片段的劑量響應(yīng)曲線， (iii)分析參比免疫球蛋白樣品的系列稀釋液與固定于第一或第二固體支持物上的抗免疫球蛋白抗體、其片段或衍生物的系列稀釋液的結(jié)合，其中所述參比免疫球蛋白樣品與步驟(i)使用的屬于相同的免疫球蛋白亞型，具有已知免疫球蛋白總量， (iv)將步驟(iii)中的結(jié)合水平與參比免疫球蛋白的已知總量進(jìn)行比較，以針對(duì)每種抗免疫球蛋白抗體、其片段或衍生物稀釋液產(chǎn)生結(jié)合力曲線， (v)將步驟(ii)中產(chǎn)生的劑量響應(yīng)曲線與步驟(iv)中產(chǎn)生的結(jié)合力曲線進(jìn)行比較，針對(duì)每種抗原或其片段鑒定出與劑量響應(yīng)曲線最密切匹配的結(jié)合力曲線，并在此基礎(chǔ)上，為每種抗原或其片段分配結(jié)合力曲線， (vi)分析測(cè)試樣品中的抗原特異性免疫球蛋白與固定于第一、第二或第三固體支持物上的重組或純化抗原成分或其片段的結(jié)合，和 (Vii)將步驟(Vi)關(guān)于每種單獨(dú)抗原或其片段的結(jié)合水平與步驟(V)中分配給該抗原或其片段的結(jié)合力曲線進(jìn)行比較，并對(duì)測(cè)試樣品中存在的抗原特異性免疫球蛋白的水平進(jìn)行定量。
2.權(quán)利要求1的方法，其中將步驟(iv)生成的結(jié)合力曲線群集成代表性的結(jié)合力曲線以代表不同的結(jié)合力水平，例如，極高度結(jié)合、高度結(jié)合、中等結(jié)合和低結(jié)合，其中將步驟(ii)中產(chǎn)生的劑量響應(yīng)曲線與代表性結(jié)合力曲線，而不是步驟(iv)中產(chǎn)生的結(jié)合力曲線進(jìn)行步驟(V)中的比較。
3.一種校準(zhǔn)設(shè)備的方法，所述設(shè)備適于測(cè)定多重抗原特異性免疫球蛋白與固定于固體支持物上的多重抗原或其片段的結(jié)合，所述方法包括以下步驟: (i)分析系列樣品與固定于第一固體支持物上的多重重組或純化抗原成分或其片段的結(jié)合，所述樣品包含具有已知抗原反應(yīng)性的免疫球蛋白， (ii)將步驟(i)中的結(jié)合水平與已知反應(yīng)性進(jìn)行比較，以針對(duì)每種抗原成分或其片段產(chǎn)生劑量響應(yīng)曲線， (iii)分析參比免疫球蛋白樣品的系列稀釋液與固定于第一或第二固體支持物上的抗免疫球蛋白抗體、其片段或衍生物的系列稀釋液的結(jié)合，其中所述參比免疫球蛋白樣品與步驟(i)使用的屬于相同的免疫球蛋白亞型，具有已知免疫球蛋白總量， (iv)將步驟(iii)中的結(jié)合水平與參比免疫球蛋白的已知總量進(jìn)行比較，以針對(duì)每種抗免疫球蛋白抗體、其片段或衍生物稀釋液產(chǎn)生結(jié)合力曲線， (V)將步驟(ii)中產(chǎn)生的劑量響應(yīng)曲線與步驟(iv)中產(chǎn)生的結(jié)合力曲線進(jìn)行比較，針對(duì)每種抗原或其片段鑒定出與劑量響應(yīng)曲線最密切匹配的結(jié)合力曲線，并在此基礎(chǔ)上，為每種抗原或其片段分配結(jié)合力曲線，和 (Vi)將步驟(V)產(chǎn)生的結(jié)合力曲線輸入設(shè)備，以使每種抗原的結(jié)合力曲線能插入由含有未知量的特異性結(jié)合所述抗原的免疫球蛋白的樣品產(chǎn)生的信號(hào)。
4.權(quán)利要求3的方法，其中將步驟(iv)生成的結(jié)合力曲線群集成代表性的結(jié)合力曲線以代表不同的結(jié)合力水平，例如，極高度結(jié)合、高度結(jié)合、中等結(jié)合和低結(jié)合，其中將步驟(ii)中產(chǎn)生的劑量響應(yīng)曲線與代表性結(jié)合力曲線，而不是步驟(iv)中產(chǎn)生的結(jié)合力曲線進(jìn)行步驟(V)中的比較。
5.權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)的方法，其中抗原是變應(yīng)原，免疫球蛋白是IgE，抗免疫球蛋白抗體是抗IgE抗體。
6.一種多重變應(yīng)原測(cè)試系統(tǒng)，其含有固定于固體支持物上的抗IgE抗體、其片段或衍生物的系列稀釋液。
7.權(quán)利要求6的系統(tǒng)，進(jìn)一步包含固定于第二固體支持物上的重組或純化的變應(yīng)原成分、或其片段。
8.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求6或7的多重變應(yīng)原測(cè)試系統(tǒng)和以下一種或多種: i)參比IgE樣品； ?)第一抗體制備物，含有結(jié)合IgE的第一抗體 iii)第二抗體制備物，含有特異性結(jié)合第一抗體的第二抗體； iv)第三抗體制備物，含有特異性結(jié)合第二抗體的第三抗體；并且 其中第二抗體或第三抗體與可檢測(cè)標(biāo)記相連接。
9.權(quán)利要求8的試劑盒 ，其中可檢測(cè)標(biāo)記是酶，例如辣根過氧化物酶(HRP)。
10.權(quán)利要求8的試劑盒，其中可檢測(cè)標(biāo)記是化學(xué)發(fā)光部分、放射性部分或熒光部分。
11.權(quán)利要求1到10任一項(xiàng)的方法、系統(tǒng)或試劑盒，其中固體支持物是微陣列芯片。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK103547921SQ201280019279
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月18日
【發(fā)明者】安德烈亞·克里桑蒂, 毛羅·馬卡里, 弗蘭切斯卡·巴爾德拉琦尼 申請(qǐng)人:微測(cè)試矩陣有限公司