凝血酶?jìng)鞲衅鞔鎯?chǔ)壽命的增長(zhǎng)的制作方法
【專利摘要】一種凝血時(shí)間測(cè)量傳感器，包括表面、施加于其上的樹(shù)脂層，所述樹(shù)脂層包含至少一種具有檢測(cè)功能的物質(zhì)，其特征在于所述樹(shù)脂層包含一種漆體系，其中所述漆體系：i）適于將所述至少一種具有檢測(cè)功能的物質(zhì)固定在所述表面上；和ii）提供帶有負(fù)電荷的表面層；iii）和允許用非生物化學(xué)惰性和穩(wěn)定的化合物代替生物凝血促進(jìn)劑。
【專利說(shuō)明】凝血酶?jìng)鞲衅鞔鎯?chǔ)壽命的增長(zhǎng)
[0001]發(fā)明背景
本發(fā)明涉及一種具有增長(zhǎng)的存儲(chǔ)壽命的凝血時(shí)間測(cè)量傳感器，所述增長(zhǎng)的存儲(chǔ)壽命是通過(guò)用非生物化學(xué)惰性和穩(wěn)定的合成化合物代替主要的生物組分實(shí)現(xiàn)的。
[0002]本發(fā)明更特別地涉及一種凝血時(shí)間測(cè)量傳感器，其使得當(dāng)沉積在傳感器上的試劑組合物包括其末端部分可以選擇性地被凝血酶通過(guò)釋放帶電荷的/或氧化還原活性基團(tuán)切掉的化學(xué)底物時(shí)能夠通過(guò)電分析方法例如電流法測(cè)定凝血酶原時(shí)間(PT)。
[0003]檢查凝血時(shí)間，即血液成分形成血塊以避免出血危險(xiǎn)的能力，是常規(guī)檢查的一部分。例如在心臟病的情況下在用抗凝血?jiǎng)┲委熎陂g能夠準(zhǔn)確地調(diào)整藥物的劑量是必要的以避免在過(guò)量用藥的情況下出血的危險(xiǎn)或反之如果施加的抗凝血?jiǎng)┑牧坎蛔阊ǖ奈ｋU(xiǎn)。
[0004]凝血級(jí)聯(lián)系統(tǒng)涉及兩種途徑，內(nèi)在途徑和外在途徑。兩種途徑均是復(fù)雜的并且涉及多個(gè)不同的凝血因子。因此，為了測(cè)量所謂的“快速(Quick)”-時(shí)間作為患者凝血時(shí)間的值，通常需要口服抗凝血治療，通常在化學(xué)上很復(fù)雜。該化學(xué)通常包括提供帶負(fù)電荷的脂質(zhì)表面和凝血促進(jìn)劑例如來(lái)自生物來(lái)源的促凝血酶原激酶(組織因子)的物質(zhì)。
[0005]為了進(jìn)行該測(cè)定已經(jīng)保留了不同的參數(shù)，但最通常的是在活化后測(cè)量凝血酶原時(shí)間(PT)，即取自患者的血液樣品觀察到形成血塊的時(shí)間。在這種體外測(cè)量系統(tǒng)中，可以通過(guò)添加帶負(fù)電荷的磷脂和“促凝血酶原激酶”的乳液、包含組織因子的鹽腦提取物來(lái)縮短結(jié)塊時(shí)間以減少測(cè)量時(shí)間。
[0006]盡管這一類(lèi)型的化學(xué)對(duì)于使用和生產(chǎn)那些測(cè)量系統(tǒng)的人員是眾所周知的，特別地家庭護(hù)理凝血測(cè)量系統(tǒng)的發(fā)展促進(jìn)了更穩(wěn)健化學(xué)的發(fā)展。
[0007]因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是規(guī)避這種凝血時(shí)間測(cè)量傳感器的固有的不穩(wěn)定性，該不穩(wěn)定性是由在生物凝血級(jí)聯(lián)中涉及的不穩(wěn)定的生物成分造成的。
[0008]US6352639公開(kāi)了一種用于測(cè)量代表一滴全血的凝結(jié)時(shí)間的值的電化學(xué)系統(tǒng)，其中固定了特定的試劑，包括至少一種化學(xué)底物，其一個(gè)末端連接可以被凝血酶切掉得到氧化還原活性基團(tuán)。在通過(guò)凝血酶消化凝血酶底物之后，釋放出帶電荷的基團(tuán)并且遷移到工作電極。在工作電極上測(cè)量通過(guò)釋放基團(tuán)的氧化或還原產(chǎn)生的電流并且其與代表凝結(jié)時(shí)間的值相關(guān)。
[0009]根據(jù)US6352630的傳感器系統(tǒng)要求大量的優(yōu)化。尤其是生物凝血促進(jìn)劑的使用要求限定的和穩(wěn)定的反應(yīng)環(huán)境，其中所述介質(zhì)保持在限定的PH下并具有足夠的離子強(qiáng)度。此外，所述生物凝血促進(jìn)劑的穩(wěn)定性有限，尤其是在變化的或提高的溫度下，這限制了相關(guān)傳感器的存儲(chǔ)穩(wěn)定性。此外，生物凝血促進(jìn)劑由天然來(lái)源獲得，其明確地導(dǎo)致了在其性質(zhì)上批與批之間的變化。因此，涉及生物凝血促進(jìn)劑的可再生的傳感器的優(yōu)化和制造仍然是困難的。US6352630還公開(kāi)了所使用的組織因子的磷脂組成成對(duì)測(cè)定凝血酶原時(shí)間具有影響。磷脂具有反向PS/PC比(其中負(fù)磷脂的量大于正磷脂的量)的組織因子允許更好的信號(hào)測(cè)量(信號(hào)高度和信號(hào)的線性度)。這種復(fù)雜化學(xué)的缺點(diǎn)，即在系統(tǒng)中必須具有生物化合物作為凝血促進(jìn)劑，是顯而易見(jiàn)的。
[0010]尤其是用于測(cè)量患者凝血時(shí)間的家庭護(hù)理系統(tǒng)的發(fā)展要求傳感器化學(xué)盡可能地穩(wěn)健，以使得諸如存儲(chǔ)時(shí)間的因子的監(jiān)測(cè)變得不那么重要和存儲(chǔ)條件，例如溫度和濕度不再重要。在現(xiàn)有技術(shù)中描述的凝血時(shí)間測(cè)量系統(tǒng)通常需要在4°C存儲(chǔ)并且它們的存儲(chǔ)時(shí)間通常不能超過(guò)一年多少。當(dāng)然這種存儲(chǔ)條件也意味著在完整的冷鏈中分配這種傳感器。此外，由于在傳感器制備期間生物凝血促進(jìn)劑的整合，傳感器制造方案必須避免升高的溫度、有機(jī)溶劑和快速干燥。最終，生物材料的使用引起在生產(chǎn)工藝期間絕對(duì)需要單獨(dú)校準(zhǔn)許多傳感器，因?yàn)樯镂镔|(zhì)彼此之間不相同。在完全移除生物來(lái)源的所有材料的情況下，存儲(chǔ)的調(diào)節(jié)要求和最大存儲(chǔ)時(shí)間本身都變得不那么關(guān)鍵。
[0011]出于以上原因，需要可以克服在現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)的凝血時(shí)間測(cè)量傳感器的缺點(diǎn)并且適用于家庭護(hù)理系統(tǒng)以測(cè)量凝血時(shí)間的系統(tǒng)。本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是提供具有增長(zhǎng)的存儲(chǔ)壽命的凝血時(shí)間測(cè)量傳感器。
[0012]檢測(cè)元件在表面上的固定可以通過(guò)吸收、交聯(lián)或通過(guò)包括在聚合物膜中實(shí)現(xiàn)(如在 US 3,839,175，Strike 等.Biosens.Bioelectron., 10 (1995) 61-66 和Schuhmann, Mikrochim.Acta, 121 (1995) 1-29中分別公開(kāi)的)。檢測(cè)元件通常包埋在通過(guò)自由基聚合(例如公開(kāi)在EP-A0691408中)、平版印刷方法(如公開(kāi)在McGall等，J.Am.Chem.Soc., 119 (1997) 5081 中)或打印方法(如公開(kāi)在G.F.Khan, Electroanalysis, 9(1997) 325-329中)沉積在表面的基質(zhì)中。
[0013]US2003/0153061公開(kāi)了使用更通用的電沉積方法來(lái)將檢測(cè)元件固定在傳感器表面上。由US2003/0153061可知可以使用多種類(lèi)型的電-可聚合的漆來(lái)在食品罐內(nèi)側(cè)電沉積用作保護(hù)層的類(lèi)型的層，也用于固定酶，從而保存它們的酶活性。
[0014]這種方法的另一實(shí)例在Shkotova 等.(2006), Material Science andEngineering, Volume 26, Issues 2-3, 411-414中給出，其中公開(kāi)了檢測(cè)乙醇的電流傳感器。醇氧化酶被電化學(xué)沉積在resydrol漆膜內(nèi)的傳感器表面。Smutok等.(2005),Biosensors and Bioelectronics Volume 20, 1285-1290 公開(kāi)了用電沉積漆例如陽(yáng)極電沉積resydro l漆來(lái)電沉積黃素細(xì)胞色素62。在Ngounou等.(2004), ElectrochimicaActa, Volume 49, 3855-3863的另一實(shí)例中，公開(kāi)了丙烯酸基聚合物庫(kù)的組合合成和它們作為電流生物傳感器固定基質(zhì)的評(píng)價(jià)。
[0015]在本發(fā)明中，一個(gè)目的是開(kāi)發(fā)一種如上所述的漆體系，其允許將如在US6352630中公開(kāi)的電流型(amperagenic)凝血酶底物固定。
[0016]本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過(guò)所述漆材料同時(shí)提供作為凝血級(jí)聯(lián)繼續(xù)的要求所提到的帶負(fù)電荷的表面。
[0017]發(fā)明概述
本發(fā)明的目的是通過(guò)提供一種具有增長(zhǎng)的存儲(chǔ)壽命的改進(jìn)的傳感器克服在現(xiàn)有技術(shù)的凝血測(cè)量系統(tǒng)中存在的缺點(diǎn)。
[0018]因此，本發(fā)明涉及一種凝血時(shí)間測(cè)量傳感器傳感器，包括表面、施加于其上的樹(shù)脂層，所述樹(shù)脂層包含至少一種具有檢測(cè)功能的物質(zhì)，其特征在于所述樹(shù)脂層包含一種漆體系，其中所述漆體系:
i)適于將所述至少一種具有檢測(cè)功能的物質(zhì)固定在所述表面上；和
ii)提供帶有負(fù)電荷的表面層；和
iii)允許用非生物化學(xué)惰性和穩(wěn)定的化合物代替生物凝血促進(jìn)劑。[0019]根據(jù)本發(fā)明，增長(zhǎng)的存儲(chǔ)壽命是通過(guò)用非生物化學(xué)惰性和穩(wěn)定的化合物代替凝血級(jí)聯(lián)的主要生物組分實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)，這種系統(tǒng)的測(cè)量時(shí)間與基于起凝血促進(jìn)劑功能的生物化合物的傳感器相比沒(méi)有顯著地延長(zhǎng)。
[0020]根據(jù)本發(fā)明，適于被固定在傳感器表面的樹(shù)脂層允許用非-生物化學(xué)惰性和穩(wěn)定的合成化合物代替主要的生物組分而不損害傳感器在測(cè)量凝血時(shí)間方面的功能。
[0021]優(yōu)選地，所述生物化學(xué)惰性和穩(wěn)定的合成化合物由該樹(shù)脂本身形成，該樹(shù)脂可以被設(shè)計(jì)為通過(guò)將合適的帶負(fù)電荷的側(cè)鏈引入到其聚合物主鏈中而本身帶負(fù)電。
[0022]在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述帶負(fù)電荷的表面層是通過(guò)非生物化學(xué)惰性和穩(wěn)定的化合物提供的，所述化合物被整合在漆體系中。帶負(fù)電荷的材料可以與上述凝血酶底物一起共同固定在樹(shù)脂中。這些所述非-生物化學(xué)惰性和穩(wěn)定的化合物選自帶負(fù)電荷的粘土材料(如膨潤(rùn)土、硅藻土)或其它帶負(fù)電荷的添加劑(如氧化的碳納米管)。
[0023] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述漆體系包括非導(dǎo)電的陽(yáng)極電沉積漆，優(yōu)選所述漆選自具有可變單體組成的帶負(fù)電荷的丙烯酸基電沉積聚合物。在變化PH值之后所述漆體系變得不那么可溶。在提高PH值之后變得不那么可溶的漆體系被稱為陰極電沉積聚合物而在降低PH值之后變得不那么可溶的漆體系被稱為陽(yáng)極電沉積聚合物。
[0024]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種具有檢測(cè)功能的物質(zhì)包括一種具體試劑，所述試劑包括至少一種具有一個(gè)末端連接的化學(xué)底物，所述末端連接可被酶切掉以產(chǎn)生自由擴(kuò)散氧化還原活性化合物，優(yōu)選地其中所述具有一個(gè)可被酶切掉以產(chǎn)生氧化還原活性化合物的末端連接的化學(xué)底物試劑是電流凝血酶底物且所述酶是凝血酶。
[0025]本發(fā)明進(jìn)一步包括制備這種凝血測(cè)量傳感器的方法。
[0026]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括將包括漆體系的樹(shù)脂層沉積在表面上并且通過(guò)干燥將該樹(shù)脂層固定在該表面上。
[0027]附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
圖1:使用本發(fā)明的傳感器測(cè)量樣品中的凝血時(shí)間的測(cè)量裝置的透視圖。
[0028]圖2:如已經(jīng)在US6352630中顯示的描述該化學(xué)反應(yīng)的示意圖，其允許在傳感器的電極之間產(chǎn)生電流。
[0029]圖3A-D:傳感器表面上沉積溶液的固定方法的比較。在沒(méi)有凝血酶原時(shí)間測(cè)試試齊[I(ThromboreI)的存在下電沉積對(duì)比干燥。A) 10沉積脈沖的聚合物沉降；B)通過(guò)干燥進(jìn)行的聚合物沉降；C)電沉積的測(cè)量結(jié)果；C)干燥的測(cè)量結(jié)果。
[0030]圖4A和4B:傳感器的一個(gè)月存儲(chǔ)穩(wěn)定性的比較，其中沉積溶液通過(guò)電沉積和通過(guò)簡(jiǎn)單的干燥固定在傳感器表面上。
[0031]圖5A和5B:添加少量碳納米管制造的傳感器。
[0032]圖6A和6B:在增加量的帶負(fù)電荷的碳納米管的存在下制造的傳感器。
[0033]發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及一種凝血時(shí)間測(cè)量傳感器。圖1中所示的測(cè)量裝置顯示了一種設(shè)置的一個(gè)實(shí)例，其中根據(jù)本發(fā)明的凝血時(shí)間測(cè)量傳感器可以用于在樣品中測(cè)量凝血時(shí)間。這種測(cè)量裝置由US6352630已知。
[0034]測(cè)量裝置I包括通過(guò)組裝兩個(gè)模制的塑料元件4a和4b構(gòu)建的殼體3，其中頂元件4a包括用于顯示面板5的窗口，和用于控制按鈕6的開(kāi)口，該控制按鈕6允許進(jìn)入不同顯示模式。
[0035]包括在所述殼體中的電子電路是用于葡萄糖分析(例如通過(guò)如先前指明的電流法)的電路的變體，并且與它的區(qū)別僅在于不同的電信號(hào)參數(shù)以顯示凝結(jié)時(shí)間。
[0036]測(cè)量裝置I還包括基本設(shè)置在殼體3的兩個(gè)部分4a和4b之間的狹縫7，將包括接觸區(qū)域8的傳感器2的一部分引入其中。包括旨在接收血液樣品的測(cè)量區(qū)域9的傳感器2的其它部分在整個(gè)測(cè)量時(shí)間期間保持在裝置I之外。在大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)的測(cè)量裝置中，將樣品引入到裝置中進(jìn)入通常在37°C溫控的封閉空間中，這導(dǎo)致另外的功率損耗。
[0037]在根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)中，其中不將樣品引入到溫控的封閉空間中，如果必要，很容易在裝置上接近狹縫7提供一個(gè)加熱探針10以作為環(huán)境溫度的函數(shù)調(diào)節(jié)電信號(hào)參數(shù)，這比溫控封閉空間所需的功率損耗低得多。[0038]傳感器2包括薄的塑料支持物11，例如由PET制成，在其整個(gè)長(zhǎng)度支撐兩個(gè)被小的間隙14分隔的集流器12、13，所述間隙14使得它們電絕緣。
[0039]支持物11和集流器12、13涂覆有絕緣層15，在其上切出兩個(gè)接近各端的窗口8，9，允許部分集流器12、13露出。第一窗口 8允許傳感器2電連接到測(cè)量裝置I上，而第二窗口 9構(gòu)成了測(cè)量區(qū)域，可見(jiàn)的集流器部分分別構(gòu)成了工作電極16和參比電極17。
[0040]工作電極16例如通過(guò)層壓薄的鉬條制成而參比電極17通過(guò)層壓薄的隨后氯化的銀條以同時(shí)形成參比電極來(lái)制成。還可以在測(cè)量區(qū)域9中分別提供工作電極、參比電極和對(duì)電極。工作電極涂覆有之后更詳細(xì)描述的具體的試劑18以允許測(cè)量凝血酶原時(shí)間(PT)。
[0041]沉積在傳感器上的本發(fā)明的試劑組合物包括一種化學(xué)底物，其末端部分可以通過(guò)釋放帶電的和/或氧化還原活性的基團(tuán)被凝血酶選擇性切除。
[0042]合適的底物和底物的組已經(jīng)先前描述在US6352630和特別是在US6495336中。
[0043]如在US6352630中描述的，合適的寡肽底物具有立體有擇結(jié)構(gòu)的凝血酶位點(diǎn)以允許切除通常被指定為離去基團(tuán)(LG)的帶電末端部分。所使用的底物的特征在于寡肽衍生物或其鹽的一種除了精氨酸之外還包含至少一種其它自由基氨基酸，選自2-氨基丁酸(Abu)、丙氨酸(Ala)、3_環(huán)己基丙氨酸(Cha)、2_環(huán)己基甘氨酸(Chg)、苯丙氨酸(Phe)、哌酸(Pip)、脯氨酸(Pro)、纈氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)，所述氨基酸能夠呈L、D或DL的形式。
[0044]同樣地，在本發(fā)明的條件下必須容易與精氨酸(Arg)的酸官能反應(yīng)、能夠被凝血酶切除和具有足夠的電荷二者的離去基團(tuán)(LG)優(yōu)選選自可以被一個(gè)或多個(gè)取代基取代的苯胺、氨基喹啉和萘胺衍生物，所述一個(gè)或多個(gè)取代基選自鹵素、羥基、氨基、硝基、烷基、烷氧基、燒酸基、苯胺基和氣基苯基，其可以被取代。
[0045]所述寡肽通過(guò)其鏈的與包括離去基團(tuán)LG的末端相反的末端固定在工作電極上。寡肽鏈的第一氨基酸，但優(yōu)選其末端氨基官能的氫由此被保護(hù)基團(tuán)R代替，所述保護(hù)基團(tuán)R選自Boc (叔丁氧基羰基)、Tos (對(duì)甲苯磺酸)、t-Bups (叔丁基苯磺酰基)、Mes (甲基磺?；?、Naps (2-萘基磺?；?、Bzo (苯甲酰)、Z (芐氧基羰基)、異丙基磺酰基、樟腦磺?；?。
[0046]根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，選擇保護(hù)基團(tuán)、a -氨基酸和它們的鏈形成以及離去基團(tuán)以具有以下寡肽底物:
Z-Gly-Pro-Arg-3-氯-4-羥基酰苯胺 Tos-Gly-Pro-Arg-3-招 ~4~ 羥基酰苯胺Boc- (D) -Chg-Gly-Arg-3-氯-4-羥基酰苯胺 H- (D) -Chg-Gly-Arg-3-氯-4-羥基酰苯胺 Z-Gly-Pro-Arg-2-氯-4-羥基酰苯胺 以及和它們相容的無(wú)機(jī)或有機(jī)鹽。
[0047]在具體試劑的組成中的寡肽通常以它們的一種鹽的形式使用，所述鹽是例如與鹽酸(HCl )、乙酸或三氟乙酸(TFA)形成的。
[0048]圖2是如已經(jīng)在US6352630中顯示的描述該化學(xué)反應(yīng)的示意圖，其允許在電極20和21之間產(chǎn)生電流，電極20和21通過(guò)電子檢測(cè)電路連接(未示出)?？梢酝ㄟ^(guò)式Rl-AA2-AA1-Arg-LG (其中AAl和AA2表示如之前指明的其它氨基酸)示意性表示的底物通過(guò)Rl基團(tuán)連接到工作電極20上，所述Rl基團(tuán)朝向寡肽，寡肽鏈的另一末端包括如先前限定的離去基團(tuán)LG。在圖的左邊部分，可以看到凝血酶選擇性的切掉了精氨酸和所述離去基團(tuán)LG之間的連接。在圖的右邊部分，可以看到釋放的離去基團(tuán)可以向電極21遷移并產(chǎn)生電流，所述電流將與釋放的離去基團(tuán)LG的數(shù)量成比例，并由此與在樣品中形成的凝血酶的量成比例。
[0049]已經(jīng)在US6495336中描述的適用于本發(fā)明的傳感器的其它凝血酶底物為:
式(I)的寡肽衍生物
【權(quán)利要求】
1.一種凝血時(shí)間測(cè)量傳感器，包括表面、施加于其上的樹(shù)脂層，所述樹(shù)脂層包含至少一種具有檢測(cè)功能的物質(zhì)，其特征在于所述樹(shù)脂層包含一種漆體系，其中所述漆體系: i)適于將所述至少一種具有檢測(cè)功能的物質(zhì)固定在所述表面上；和 ii)提供帶有負(fù)電荷的表面層； iii)和允許用非生物化學(xué)惰性和穩(wěn)定的化合物代替生物凝血促進(jìn)劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的凝血測(cè)量傳感器，其中通過(guò)非生物化學(xué)惰性和穩(wěn)定的化合物提供帶有負(fù)電荷的表面層。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的凝血測(cè)量傳感器，其中所述漆體系是帶有負(fù)電荷的丙烯酸基電沉積聚合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的凝血測(cè)量傳感器，其中帶有負(fù)電荷的丙烯酸基電沉積漆選自Resydrol漆家族。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的凝血測(cè)量傳感器，其中所述樹(shù)脂層進(jìn)一步包含帶有負(fù)電荷的粘土材料，如膨潤(rùn)土、硅藻土，或其它帶有負(fù)電荷的添加劑，如氧化的碳納米管。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的凝血測(cè)量傳感器，其中所述至少一種具有檢測(cè)功能的物質(zhì)包括至少一種具有一個(gè)末端連接的化學(xué)底物，所述末端連接可被酶切掉以產(chǎn)生帶電荷的化合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的凝血測(cè)量傳感器，其中所述具有一個(gè)可被酶切掉以產(chǎn)生帶電荷的化合物的末端連接的化學(xué)底物試劑是電流型凝血酶底物且所述酶是凝血酶。
【文檔編號(hào)】G01N33/86GK103620054SQ201280023394
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月16日
【發(fā)明者】W.舒曼恩, E.J.弗倫克 申請(qǐng)人:斯沃奇集團(tuán)研究及開(kāi)發(fā)有限公司