診斷血內(nèi)寄生物的方法和設(shè)備的制作方法
【專利摘要】用于檢測(cè)血液樣品中寄生物的方法和設(shè)備。該方法包括：將血液樣品與裂解試劑相混合，以裂解紅細(xì)胞；在顆粒分析儀中測(cè)量裂解后的血液樣品中的顆粒，得到軸向光損失測(cè)量值；以及響應(yīng)于軸向光損失測(cè)量值，區(qū)分裂解后的血液樣品中的寄生物顆粒種群。在一種實(shí)施方式中，該方法包括：測(cè)量光散射；通過(guò)比較光散射測(cè)量值和軸向光損失測(cè)量值，區(qū)分寄生物顆粒種群。用于檢測(cè)血液樣品中寄生物種群的系統(tǒng)包括：用于獲得軸向光損失測(cè)量值的顆粒分析儀；以及用于通過(guò)使用軸向光損失測(cè)量值來(lái)確定寄生物顆粒種群的計(jì)算機(jī)。
【專利說(shuō)明】診斷血內(nèi)寄生物的方法和設(shè)備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)療診斷領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及用于診斷血內(nèi)寄生物感染的方法和設(shè)備。
[0002]相關(guān)申請(qǐng)
[0003]本申請(qǐng)要求2011年5月13日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/486，059的優(yōu)先權(quán)，通過(guò)引
用將其全部?jī)?nèi)容結(jié)合于本文。
【背景技術(shù)】
[0004]寄生蟲性疾病可引起死亡，全世界許多人遭受其苦。主要的寄生蟲性疾病之一是瘧疾。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WH0)，瘧疾是威及生命的寄生蟲性疾病，每年感染2億2千5百萬(wàn)人，并且殺死一百萬(wàn)人的四分之三略多。死亡者主要是兒童。該疾病的大部分受害者住在非洲的撒哈拉沙漠地區(qū)，但是在亞洲、中東、美國(guó)和歐洲也出現(xiàn)很大數(shù)量的病例。
[0005]—般有四種類型的痕原蟲會(huì)感染人:間日痕原蟲(Plasmodium vivax);三日痕原蟲(Plasmodium malariae);卵形痕原蟲(Plasmodium ovale);以及惡性痕原蟲(Plasmodium falciparum)。第五種類型的痕原寄生蟲是諾氏痕原蟲(Plasmodiumknowlesi)，其可在猴子中引起瘧疾，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其可感染人類，但是其發(fā)病率還不知道。
[0006]借助早期診斷，該疾病通過(guò)使用抗瘧疾藥物是可治療的。世界衛(wèi)生組織(WHO)建議，在治療之前，病人的感染應(yīng)該通過(guò)快速診斷試驗(yàn)(RDT)、或者通過(guò)顯微鏡血細(xì)胞檢查進(jìn)行證實(shí)。顯微鏡檢查較慢，并且是勞動(dòng)密集型，要求高度熟練的技師。RDT是典型的免疫色譜抗體試驗(yàn)，其結(jié)果表現(xiàn)為與溫度穩(wěn)定性、技師熟練要求和成本相關(guān)。
[0007]使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器通過(guò)測(cè)量白細(xì)胞對(duì)瘧疾感染的響應(yīng)來(lái)嘗試快速診斷瘧疾的感染多少是成功的。然而，難以在白細(xì)胞測(cè)量和瘧疾感染嚴(yán)重程度之間建立可靠的關(guān)系。產(chǎn)生該問(wèn)題的原因是因?yàn)?，?dāng)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞與寄生蟲起反應(yīng)時(shí)，被測(cè)量的白細(xì)胞參數(shù)是白細(xì)胞體積的變化。不幸的是，當(dāng)瘧疾寄生蟲首次感染病人時(shí)，白細(xì)胞體積不會(huì)立刻變化；一旦通過(guò)治療消滅了寄生蟲，白細(xì)胞體積也不立刻恢復(fù)正常。細(xì)胞體積變化典型地以不可量化的方式滯后于傳入或者除去瘧疾寄生蟲之后。另外，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞對(duì)瘧疾寄生蟲的生物反應(yīng)是如此復(fù)雜，以至于很難可靠地定量白細(xì)胞體積(淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的體積)與寄生蟲感染嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。
[0008]需要的是容易使用和解釋的血內(nèi)寄生物的快速診斷試驗(yàn)。本發(fā)明滿足了該需要。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明公開的主題一般涉及用于檢測(cè)血液樣品中寄生物的方法和設(shè)備。在一個(gè)方面，本申請(qǐng)說(shuō)明書公開了一種用于檢測(cè)血液樣品中寄生物顆粒種群的方法。在一種實(shí)施方式中，該方法包括下述步驟:將血液樣品與裂解試劑(lytic reagent)相混合，以便裂解紅細(xì)胞；在顆粒分析儀中測(cè)量混合后的血液樣品中的顆粒，得到軸向光損失測(cè)量值；區(qū)分混合后的血液樣品中的寄生物顆粒種群，所述種群響應(yīng)于軸向光損失測(cè)量值。在一種實(shí)施方式中，所述區(qū)分步驟包括識(shí)別混合后血液樣品中響應(yīng)于軸向光損失測(cè)量值的寄生物顆粒種群。
[0010]在一種實(shí)施方式中，被區(qū)分的寄生物顆粒種群包含瘧疾寄生蟲。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該方法包括:進(jìn)行至少一種光散射測(cè)量法；以及將混合后的血液樣品中的寄生物顆粒種群區(qū)分出來(lái)，所述種群響應(yīng)于軸向光損失測(cè)量值和光散射測(cè)量值。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括:計(jì)數(shù)寄生物顆粒種群中的顆粒，以便確定寄生物濃度的系數(shù)；以及將寄生物濃度的系數(shù)報(bào)告為對(duì)應(yīng)于寄生物感染的計(jì)數(shù)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，該測(cè)量是有核紅細(xì)胞(NRBC)分析的一部分。在另一個(gè)實(shí)施方式中，至少一種光散射測(cè)量值是中上角度(upper median angle)光散射測(cè)量值。
[0011]在一種實(shí)施方式中，所述區(qū)分步驟包括:將測(cè)量的至少一種光散射測(cè)量值與測(cè)量的軸向光損失測(cè)量值相比較，并且通過(guò)門控(gating)由所述比較指示的各個(gè)種群來(lái)檢測(cè)寄生物顆粒種群。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該方法還包括:計(jì)數(shù)寄生物顆粒種群中的顆粒，以便確定第一數(shù)目；計(jì)數(shù)由所述比較得到的其他顆粒種群中的所述顆粒，以便確定第二數(shù)目；以及將包含第一數(shù)目和第二數(shù)目的份數(shù)報(bào)告為寄生物感染的指示。在又一個(gè)實(shí)施方式中，寄生物顆粒種群具有比各個(gè)白細(xì)胞種群更低的至少一種光散射測(cè)量數(shù)值和更低的所述軸向光損失測(cè)量數(shù)值。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述識(shí)別步驟包括:比較至少一種光散射測(cè)量值、軸向光損失測(cè)量值、以及第三測(cè)量值，其中所述第三測(cè)量值是在所述顆粒測(cè)量期間得到的；以及通過(guò)門控(gating)由所述比較指示的各個(gè)種群來(lái)檢測(cè)寄生物顆粒種群。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第三測(cè)量值是直流(DC)測(cè)量值。
[0012]在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用血液樣品來(lái)檢測(cè)寄生物顆粒的方法包括下述步驟:將所述血液樣品與裂解試劑相混合，以便裂解紅細(xì)胞；在顆粒分析儀中測(cè)量混合后的血液樣品中的顆粒，得到至少一種光散射測(cè)量值、軸向光損失測(cè)量值、以及體積測(cè)量值；基于至少一種光散射測(cè)量值和軸向光損失測(cè)量值，區(qū)分與混合后血液樣品中的寄生物顆粒對(duì)應(yīng)的第一顆粒種群；基于體積測(cè)量值，區(qū)分與受到所述寄生物顆粒影響的白細(xì)胞對(duì)應(yīng)的第二顆粒種群；以及報(bào)告響應(yīng)于被區(qū)分的第一顆粒種群和第二顆粒種群的寄生物感染。在一種實(shí)施方式中，包括下述步驟:基于至少一種光散射測(cè)量值和軸向光損失測(cè)量值來(lái)區(qū)分與混合后血液樣品中的寄生物顆粒對(duì)應(yīng)的第一顆粒種群；并且/或者識(shí)別與受寄生物顆粒影響的白細(xì)胞對(duì)應(yīng)的第二顆粒種群。在另一個(gè)實(shí)施方式中，區(qū)分第二顆粒種群的步驟進(jìn)一步基于光散射測(cè)量值。
[0013]在又一個(gè)實(shí)施方式中，檢測(cè)紅細(xì)胞中寄生物的方法包括下述步驟:以一種其中寄生物被保留的方式裂解血液樣品中紅細(xì)胞；一束光定向穿過(guò)裂解后的血液樣品；根據(jù)由顆粒引起的光束測(cè)量軸向光損失；以及根據(jù)測(cè)量的軸向光損失測(cè)量值確定受感染細(xì)胞的種群。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該方法包括下述步驟:當(dāng)從光束方向測(cè)量時(shí)，在預(yù)先確定的角度范圍內(nèi)，測(cè)量被樣品中顆粒散射的光；比較當(dāng)從光束方向測(cè)量時(shí)，在預(yù)先確定的角度范圍內(nèi)被顆粒散射的光和顆粒的軸向光損失，并且通過(guò)該比較來(lái)確定受感染細(xì)胞的種群。在又一個(gè)實(shí)施方式中，將受感染細(xì)胞的種群中的顆粒的數(shù)量計(jì)數(shù)除以白細(xì)胞的數(shù)量計(jì)數(shù)。
[0014]在另一方面，本申請(qǐng)公開的主題涉及一種用于檢測(cè)血液樣品中寄生物顆粒種群的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含:用于獲得軸向光損失測(cè)量值的顆粒分析儀，該顆粒分析儀由軸向光損失測(cè)量值啟動(dòng)散射光測(cè)量；用于確定寄生物顆粒的指示種群的計(jì)算機(jī)。在一種實(shí)施方式中，顆粒分析儀可進(jìn)一步確定光散射測(cè)量值，并且計(jì)算機(jī)可將光散射測(cè)量值與軸向光損失測(cè)量值相比較，其中，光散射測(cè)量值和軸向光損失測(cè)量值的比較可定量寄生物顆粒種群。在一個(gè)實(shí)施方式中，在20-45度之間產(chǎn)生光散射測(cè)量值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]通過(guò)如下附圖，能夠更好地理解本發(fā)明的目的和特征。這些附圖并非必須按比例繪制；其重點(diǎn)反而是用于說(shuō)明本發(fā)明公開的主題的原理。當(dāng)在本公開內(nèi)部被引入時(shí)，這些與本公開有關(guān)的附圖被逐個(gè)地解釋。
[0016]圖1A是本【技術(shù)領(lǐng)域】已知的細(xì)胞計(jì)數(shù)器的實(shí)施方式的示意圖，圖1B是一個(gè)紅細(xì)胞組的顯微照片，其中一些紅細(xì)胞被瘧原蟲感染；
[0017]圖2是描述本發(fā)明方法的實(shí)施方式中各步驟的程序框圖的實(shí)施方式；
[0018]圖3A和圖3B分別顯示了被間日瘧原蟲(P.vivax)感染的病人和未感染病人的RUMALS對(duì)ALL的實(shí)例繪圖；
[0019]圖4A和圖4B分別顯示了被間日瘧原蟲感染的病人和未感染病人的RLALS對(duì)ALL的實(shí)例繪圖；
[0020]圖5A和5B分別顯示了被P.vivax感染的病人的寄生物負(fù)載測(cè)量和CMC測(cè)量以及寄生物_顆粒_種群％隨治療時(shí)間的實(shí)例繪圖；
[0021]圖6A和6B分別顯示了被P.vivax感染的病人的寄生物負(fù)載測(cè)量和CMC測(cè)量以及寄生物_顆粒_種群％隨治療時(shí)間的實(shí)例繪圖；
[0022]圖7A和圖7B描繪了為被P.vivax感染的病人的血液樣品分別繪制的RLALS對(duì)ALL和RUMALS對(duì)ALL的繪圖；
[0023]圖7C是被P.vivax感染的病人的血液樣品的RUMALS和ALL的散點(diǎn)圖，包括在ALL上的I維直方圖(histogram)；
[0024]圖7D和7E描繪了對(duì)于來(lái)自與圖7A和7B所示被P.vivax感染的相同病人的血液樣品進(jìn)行繪制的細(xì)胞體積(V)分別對(duì)旋轉(zhuǎn)光散射(RLSn)和不透度(OP)的圖；
[0025]圖8A、圖8B和8C描繪了來(lái)自被P.vivax感染的病人的RLALS對(duì)ALL的散點(diǎn)圖，該病人用抗痕疾食物進(jìn)行治療；以及
[0026]圖9A和9B描繪了具有惡性瘧原蟲的病人的RUMALS對(duì)ALL和RLALS對(duì)ALL的散點(diǎn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面的描述參考的是顯示本發(fā)明公開主題的特定實(shí)施方式的附圖。其他實(shí)施方式是可以的并且在不脫離本公開主題的精神和范圍的情況下可對(duì)這些實(shí)施方式做出變型。因此，下述【具體實(shí)施方式】并不意味著限制本公開的主題。相反，本發(fā)明公開的主題范圍在附后的權(quán)利要求中被限定。本申請(qǐng)通過(guò)引用將已轉(zhuǎn)讓給本申請(qǐng)受讓人的US7，256，048的全部?jī)?nèi)容結(jié)合于本文。
[0028]為說(shuō)明目的，簡(jiǎn)易言之，參見圖1A，本【技術(shù)領(lǐng)域】已知的細(xì)胞分析儀10包括光源14，其可產(chǎn)生朝向流動(dòng)池26中窗口 22的狹窄定向光束18。在各種非限制性實(shí)施方式中，光源是激光或激光二極管。載流液體30載有來(lái)自血液樣品的單個(gè)細(xì)胞穿過(guò)流動(dòng)池26，借此允許每個(gè)單個(gè)細(xì)胞34與光束18相互作用。
[0029]多個(gè)光電傳感器被定位于鄰接流動(dòng)池26,從而在多個(gè)角度記錄細(xì)胞34穿過(guò)流動(dòng)池26時(shí)的散射光強(qiáng)度。一個(gè)光電傳感器38被直接設(shè)置在光束18的路徑中。這個(gè)光電傳感器38可測(cè)量軸向光損失(Axial Light Loss，ALL)。設(shè)置三組光電傳感器42、46、48用于當(dāng)從光束18的路徑測(cè)量時(shí)，在三個(gè)預(yù)先確定的角度范圍收集被細(xì)胞散射的光。選擇這些角度用于更好地區(qū)分各種血液組分比如紅細(xì)胞和白細(xì)胞。盡管這些命名多少是隨意的，但在一種實(shí)施方式中，這些預(yù)先確定的角度范圍分別是小于10° (被稱為低角度光散射(LowAngle Light Scatter, LALS))(光檢測(cè)器42);從大約10。至大約20。(被稱為中低角度光散射(Lower Median Angle Light Scatter,LMALS))(光檢測(cè)器 46);從大約 20° 至大約42° (被稱為中上角度光散射(Upper Median Angle Light Scatter, UMALA))(光檢測(cè)器48)；以及用于UMALS和LMALS (分別為光檢測(cè)器46和光檢測(cè)器48)信號(hào)的稱作MALS (中等角度光散射，Median Angle Light Scatter)的檢測(cè)器總體47 (10。-42° )。來(lái)自這些檢測(cè)器的信號(hào)被傳輸?shù)教幚砥?未顯示)，進(jìn)行數(shù)字化、分析，并且結(jié)果被展示。
[0030]每次細(xì)胞34穿過(guò)在光源14和光電傳感器38之間的光束路徑18時(shí)，沿光束路徑18定向的傳感器光電傳感器38可測(cè)量來(lái)自光束18的光損失量。該ALL是穿過(guò)流動(dòng)池26的細(xì)胞或者顆粒34的體積和吸光度的指示。光損失越大，細(xì)胞或者顆粒34就越大，并且其吸光度也越大。檢測(cè)的LALS、LMALS、以及UMALS光可提供有關(guān)顆?；蛘呒?xì)胞的結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)。
[0031]細(xì)胞或者顆粒尺寸的另一種指示是流動(dòng)池26中在電極52和電極56之間的電流量。當(dāng)顆粒進(jìn)入流動(dòng)池10的窗口區(qū)22時(shí)，在電極52和電極56之間的電流隨著細(xì)胞或者顆粒34阻斷電流流動(dòng)而變化。電流量的降低與細(xì)胞或者顆粒34的大小有關(guān)。該電流可以是直流電(DC)，也可以是分別由DC或者RF源(未顯示)供應(yīng)的射頻(RF)電流。RF對(duì)DC的比率由函數(shù)f (RF，DC)給出，并且被稱為不透度。在一種實(shí)施方式中，不透度由如下表達(dá)式提供:
[0032]不透度=f(RF/DC)
[0033]其中f是函數(shù)，可處理數(shù)據(jù)的變換和換算。
[0034]另外，在一些實(shí)施方式中，來(lái)自電流測(cè)定的脈沖可以被用于啟動(dòng)來(lái)自光檢測(cè)器的數(shù)據(jù)收集。
[0035]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在瘧疾感染中，存在可通過(guò)ALL表征的顆粒種群。該ALL是較小的尺寸和吸光度的指示。這些通過(guò)ALL測(cè)量時(shí)較小尺寸的顆粒種群的存在是寄生物感染的暗示。因此，通過(guò)簡(jiǎn)單地測(cè)量裂解的血液樣品中的ALL，人們能夠快速使用該技術(shù)來(lái)篩選病人種群。圖1B是紅細(xì)胞載玻片的顯微照片，其中一些紅細(xì)胞被瘧原蟲感染。瘧原蟲表現(xiàn)為紅細(xì)胞中的黑暗顆粒。在裂解工序后，寄生物被保留，并且將通過(guò)測(cè)量裂解顆粒的特性比如大小、密度、光散射和吸光度而變得明顯。用這樣的方式將寄生物與其他細(xì)胞群區(qū)別開來(lái)。
[0036]雖然在篩選瘧疾感染中可以單獨(dú)使用ALL定量檢測(cè)，但通過(guò)測(cè)量ALL和UMALS，并且例如通過(guò)繪圖來(lái)比較彼此相對(duì)的數(shù)值，能夠計(jì)算出瘧疾感染的定量測(cè)量。在該方法的一種實(shí)施方式(圖2)中，來(lái)自病人的血液樣品首先被裂解(步驟10)，以便除去紅細(xì)胞。
[0037]裂解步驟包括:在一種實(shí)施方式中，通過(guò)稀釋14yL抗凝血的全血樣品(外周血)
與614 μ L等滲血液稀釋劑COULTERki DxH Diluent? (佛羅里達(dá)州邁阿密市貝克曼考爾特公司的產(chǎn)品)形成2%溶液；在一種實(shí)施方式中，將稀釋后的樣品按5:1與125 μ L裂解試劑相混合。在添加裂解試劑之后大約9秒鐘，用鞘液(sheath fluid) COULTER" DxHDiluent?將樣品混合物輸送至流動(dòng)池。裂解試劑的一個(gè)實(shí)施方式是含有用于裂解紅細(xì)胞的下述活性組分的水溶液:在一種實(shí)施方式中，36g/L氯化十二烷基三甲銨(50%溶液)、3.6g/L十四基三甲基溴化銨，pH為約4。
[0038]樣品然后通過(guò)血液分析儀進(jìn)行分析(步驟14)。在一種實(shí)施方式中，血液分析儀是貝克曼考爾特公司的DxH800血液分析儀，參見，例如轉(zhuǎn)讓給本申請(qǐng)受讓人的US8，094, 299，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本文。該分析儀可以被構(gòu)造得用于當(dāng)每個(gè)血細(xì)胞穿過(guò)流動(dòng)池時(shí)測(cè)量DC和/或RF電流、以及數(shù)種光信號(hào)，包括ALL、LALS, LMALS,以及UMALS。在一種實(shí)施方式中，通過(guò)檢測(cè)ALL顆?；蛘咂渌麊?dòng)手段來(lái)啟動(dòng)計(jì)數(shù)(步驟18)。然后檢驗(yàn)顆粒以便參見對(duì)應(yīng)于ALL的顆粒含量。
[0039]如果期望進(jìn)行定量，在一種實(shí)施方式中，分析儀被構(gòu)造成當(dāng)ALL光電傳感器38產(chǎn)生電脈沖(步驟18)時(shí)、并且當(dāng)直流電不指示顆粒時(shí)可采取有角度的光散射測(cè)量。在一種實(shí)施方式中，UMALS和ALL被測(cè)量(步驟26)并進(jìn)行比較(在一種實(shí)施方式中，被繪圖)(步驟30)。通過(guò)使用該技術(shù)，通過(guò)分析儀區(qū)分新的顆粒種群(其被稱為寄生物顆粒種群，如下所述)(步驟34)并且與測(cè)量的其他種群分離。然后確定寄生物顆粒種群的大小，以便指示瘧疾感染的存在和嚴(yán)重程度。
[0040]在一種實(shí)施方式中，為了幫助通過(guò)分析儀將該寄生物顆粒種群與測(cè)量的其他種群區(qū)分開，在測(cè)定種群之前，使用非線性函數(shù)來(lái)轉(zhuǎn)換UMALS測(cè)量值(步驟38)。被轉(zhuǎn)換的數(shù)值被稱為旋轉(zhuǎn)UMALS (RUMALS)，并且由函數(shù)f (DC, UMALS)給出。在一種實(shí)施方式中，RUMALS由如下表達(dá)式提供:
[0041]RUMALS= (C)ARCTAN (DC/UMALS)
[0042]其中(C)是換算系數(shù)，(DC)是直流電數(shù)值?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他轉(zhuǎn)換類型來(lái)達(dá)到相同的效果。
[0043]通過(guò)引起DC/UMALS比率值的對(duì)數(shù)壓縮，該反正切函數(shù)可嘗試著使通過(guò)直流電值和UMALS值指示的體積測(cè)量值互不相關(guān)，所述DC/UMALS比率與這些物理量的轉(zhuǎn)換函數(shù)成正t匕。該轉(zhuǎn)換的結(jié)果在受感染個(gè)體的RUMALS對(duì)ALL的曲線圖中被顯示，如圖3A所示。寄生物顆粒種群被顯示在圖的左下角。這與在未感染個(gè)體的樣品的RUMALS對(duì)ALL的繪圖(圖3B)中的左下區(qū)相反。在該圖中左下角幾乎是空的。
[0044]在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用LALS測(cè)量而不是UMALS。在一種實(shí)施方式中，為了幫助通過(guò)分析儀將該寄生物顆粒種群與測(cè)量的其他種群區(qū)分開，在測(cè)定種群之前，使用非線性的函數(shù)來(lái)轉(zhuǎn)換LALS測(cè)量值。在另一個(gè)實(shí)施方式中，如同就UMALS而論所示的那樣，可以通過(guò)使用反正切ARCTAN函數(shù)和LALS測(cè)量值來(lái)轉(zhuǎn)換LALS測(cè)量值。該轉(zhuǎn)化值被稱為旋轉(zhuǎn)LALS(RLALS)，并且由函數(shù)f (DC，LALS)給出。在一種實(shí)施方式中，RLALS由如下表達(dá)式提供:
[0045]RLALS= (C)ARCTAN (DC/LALS)
[0046]其中(C)是比例常數(shù)，(DC)是直流電電流。在受感染個(gè)體和未感染個(gè)體中測(cè)量和轉(zhuǎn)化的結(jié)果分別如圖4A和圖4B所示?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的轉(zhuǎn)換類型來(lái)達(dá)到相同的效果。
[0047]在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用作為L(zhǎng)AMLS和UMALS之和的MALS測(cè)量值。在一種實(shí)施方式中，為了幫助通過(guò)分析儀將該寄生物顆粒種群與測(cè)量的其他種群區(qū)分開，在測(cè)定種群之前，使用非線性的函數(shù)來(lái)轉(zhuǎn)換MALS測(cè)量值。該轉(zhuǎn)化值被稱為旋轉(zhuǎn)MALS (RMALS)，并且由函數(shù)f (DC，MALS)給出。在一種實(shí)施方式中，RLALS由如下表達(dá)式提供:
[0048]旋轉(zhuǎn)MALS=f (Log (MALS) /DC)
[0049]其中f是函數(shù)，可處理數(shù)據(jù)的變換和換算?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它轉(zhuǎn)換類型來(lái)達(dá)到相同的效果。
[0050]新的種群被稱為寄生物顆粒種群，因?yàn)樵诹呀釸BC血細(xì)胞的工序之后，由于檢測(cè)特性，在獨(dú)特的區(qū)域中，寄生物、被寄生的紅細(xì)胞將保留，并且被與其他細(xì)胞類型比如白血球、有核紅細(xì)胞、碎片、血小板、以及其他細(xì)胞組分區(qū)別開來(lái)。在瘧疾感染中出現(xiàn)的該寄生物顆粒種群可通過(guò)ALL測(cè)量進(jìn)行表征，并且能夠通過(guò)使用至少一種附加的UMALS、LALS、或DC電流的測(cè)量參數(shù)而被進(jìn)一步區(qū)分或者計(jì)數(shù)。
[0051]寄生物顆粒種群的定量允許進(jìn)行兩種附加的計(jì)算。第一個(gè)計(jì)算被稱為“寄生物_顆粒種群％”，并且是被歸一化成白細(xì)胞計(jì)數(shù)的寄生物顆粒含量的相對(duì)測(cè)量。該參數(shù)由下述方程式給出:
[0052]寄生物_顆粒_種群％=(寄生物_顆粒種群事件計(jì)數(shù)/WBC事件計(jì)數(shù))100%。
[0053]第二個(gè)參數(shù)痕疾濃度系數(shù)(Coefficientof Malaria Concentration,CMC)(或者寄生物濃度系數(shù))被計(jì)算為每μ L中寄生物顆粒種群的絕對(duì)計(jì)數(shù)。
[0054]兩個(gè)研究已經(jīng)評(píng)估了這兩個(gè)新參數(shù)CMC和寄生物顆粒種群％的能力，以便評(píng)估這兩個(gè)參數(shù)將未感染樣品與受感染樣品區(qū)分開來(lái)的能力。通過(guò)使用曲線下面積(AUC)統(tǒng)計(jì)技術(shù)(其中AUC數(shù)值越接近一個(gè)數(shù)值,則鑒別指標(biāo)(discriminator)就越好),一個(gè)具有139個(gè)正常樣品和89個(gè)感染樣品的研究發(fā)現(xiàn)寄生物_顆粒_種群％的AUC數(shù)值為0.98，并且CMC的AUC數(shù)值為0.98。具有相同的89個(gè)感染樣品和1680個(gè)正常或者未感染樣品的第二個(gè)研究發(fā)現(xiàn)寄生物_顆粒_種群％的AUC數(shù)值為0.94，CMC的AUC數(shù)值為0.96。因此，兩個(gè)研究都顯示這兩個(gè)參數(shù)為較好的痕原蟲感染鑒別指標(biāo)(discriminator)。
[0055]結(jié)果是，兩個(gè)參數(shù)都能夠被用于跟蹤治療的效果。圖5和圖6跟蹤了與在被治療瘧疾的病人中的寄生物負(fù)荷(菱形)手工計(jì)數(shù)相比較CMC隨時(shí)間的下降(正方形)(圖5A和圖6A)和RBC_碎片％隨時(shí)間的下降(正方形)(圖5B和圖6B)。如同能夠看到的那樣，CMC和RBC_碎片％的值非常好地跟蹤寄生物負(fù)荷的手工測(cè)量。還可以看到，該治療導(dǎo)致寄生物感染在四天治療周期內(nèi)幾乎100倍的降低。
[0056]實(shí)施例
[0057]在一種實(shí)施方式中，通過(guò)使用貝克曼考爾特公司DxHSOO?血液分析儀(貝克曼考爾特公司，Brea,加利福尼亞州)分析了 1761個(gè)全部血細(xì)胞計(jì)數(shù)(complete bloodcell count, CBC)樣品。(參見 “Sensitive detection and accurate monitoring ofPlasmodium vivax parasites on routine complete blood count using automaticblood analyzer (DxH800a)(俥用自動(dòng)血液分析儀(DxH800n)(靈敏檢測(cè)并目精確監(jiān)控常規(guī)全血細(xì)胞計(jì)數(shù)上的間日瘧原蟲寄生物)”，H.K.Lee et al.，Int.Jnl.Lab.Hem.24，201-207)。該采集包括來(lái)自52例間日瘧原蟲瘧疾病人的123個(gè)血液樣品、1504個(gè)非瘧疾樣品和134個(gè)來(lái)自正常健康個(gè)體的樣品。該非瘧疾樣品包括509個(gè)來(lái)自白細(xì)胞減少癥的病人的血液樣品。一旦在診斷的時(shí)候提取瘧疾的血液樣品，則在27個(gè)病人中提取，并且從25個(gè)病人中提取2-6次。通過(guò)顯微鏡檢查進(jìn)行瘧疾感染的診斷。[0058]篩選有核紅細(xì)胞(nRBC)的散點(diǎn)圖來(lái)檢測(cè)瘧疾信號(hào)。如果檢測(cè)到間日瘧原蟲信號(hào)，就評(píng)定五個(gè)不同的散點(diǎn)圖以便將樣品的瘧疾組分與細(xì)胞碎片區(qū)分開來(lái)。圖7A和圖7B描繪了對(duì)于來(lái)自患瘧疾病人的血液樣品的nRBC篩選圖(RLALS和RUMALS分別對(duì)ALL的繪圖)，其描繪了瘧疾種群(箭頭所示)和nRBC及白細(xì)胞。圖7C是被間日瘧原蟲感染的病人的血液樣品的RUMALS和ALL的散點(diǎn)圖，包括在ALL上的I維直方圖。通過(guò)將峰值與最小值相比較，人們能夠區(qū)分分開的種群。
[0059]一旦在樣品中檢測(cè)到痕疾細(xì)胞，對(duì)該樣品進(jìn)行五份差示繪圖(five partdifferential plots, 5H)繪圖)(圖7D和圖7Ε),以便進(jìn)一步將痕疾種群(再次通過(guò)箭頭指出)與其他細(xì)胞區(qū)分開來(lái)。該5Η)繪圖能夠區(qū)分5個(gè)主要的種群淋巴細(xì)胞(LY)、單核細(xì)胞(MO)、嗜中性白細(xì)胞(NE)、嗜曙紅細(xì)胞(EO)和嗜堿細(xì)胞(BA)，加上非白細(xì)胞種群。5H)繪圖被表示為5PD1和5PD2。在5PD1中，顯示的旋轉(zhuǎn)光散射(RLSn)(沿著X軸做曲線圖)相對(duì)于體積(V)繪制，如圖7D所示。在該實(shí)施例中使用的旋轉(zhuǎn)光散射是旋轉(zhuǎn)中等角度光散射(Rotated Median Angle Light Scatter, RMALS)。在 5PD2 中，顯不的是沿著 X 軸繪制的不透度(0P)，相對(duì)于沿著Y軸繪制的體積(V)，如圖7E所示。該五份差示散點(diǎn)圖可幫助區(qū)分瘧疾顆粒和細(xì)胞碎片。
[0060]圖8A、圖8B和8C描繪了來(lái)自瘧疾病人的RLALS對(duì)ALL散點(diǎn)圖，該病人用抗瘧疾食物進(jìn)行治療。初始的血液樣品含有664個(gè)寄生物/ μ L，并且圖8Α顯示了瘧疾組分(箭頭)。在治療兩天后，瘧原蟲的濃度下降至86個(gè)寄生物/y L，如圖SB的瘧疾種群所示。在治療12天后，寄生物的濃度是0，并且從圖SC中看不見該種群。在12天后，普通的顯微鏡檢查也未能檢測(cè)出瘧疾寄生物。
[0061]因此，如同在前一段落中討論的那樣，來(lái)自該技術(shù)的一個(gè)測(cè)量結(jié)果是間日瘧原蟲信號(hào)的大小與寄生物負(fù)荷相關(guān)。因此，有可能計(jì)數(shù)顆粒的數(shù)量，并且由此得出就每單位體積的寄生物數(shù)目而言的寄生物負(fù)荷計(jì)數(shù)。結(jié)果是，人們能夠主動(dòng)地跟蹤治療的結(jié)果，并且能夠更精確地預(yù)測(cè)使用抗瘧疾的治療的結(jié)果。
[0062]該研究顯示了該血細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)能夠被經(jīng)濟(jì)并快速地用于血內(nèi)寄生物試驗(yàn)和疾病治療的監(jiān)控。所有52個(gè)瘧疾樣品(100%)都在nRBC散點(diǎn)圖上顯示出特異性特征，并且容易識(shí)別。1509個(gè)樣品中的一個(gè)(0.07%)顯示出不規(guī)則的信號(hào)，其通過(guò)進(jìn)行5PD (五份差示)繪圖容易被顯示為不是瘧疾感染的結(jié)果。
[0063]因此，該方法的靈敏度是100%，并且特異性也是100%，這使其成為非常強(qiáng)有力的技術(shù)。還應(yīng)該注意，雖然在該實(shí)施例中的大多數(shù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)涉及間日瘧原蟲瘧疾感染，但該技術(shù)還可檢測(cè)其他瘧原蟲比如惡性瘧原蟲的存在(圖9A和9B)。
[0064]應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的附圖和說(shuō)明書已經(jīng)被簡(jiǎn)化，以便顯示為與清楚理解本發(fā)明相關(guān)的組成成分。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，這些組成成分以及其他組成成分是可預(yù)期的。然而，因?yàn)檫@些組成成分已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并且因?yàn)樗鼈儾粫?huì)易于更好地理解本發(fā)明，故在此未提供這樣的組成成分的討論。應(yīng)該理解，提供這些圖是用于說(shuō)明的目的，并且不作為構(gòu)建圖。省略的細(xì)節(jié)和變型或者可替代實(shí)施方式是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的認(rèn)識(shí)范圍內(nèi)。
[0065]可預(yù)期地，在本發(fā)明的某些方面，單一的組分可以被多個(gè)組分代替，并且多個(gè)組分可以被單一的組分代替，以便提供組成成分或者結(jié)構(gòu)、或者執(zhí)行給定的函數(shù)。除了這樣的代替不會(huì)被操作以便實(shí)施本發(fā)明的特定實(shí)施方式之外，這樣的代替應(yīng)被認(rèn)為在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0066]在此提供的實(shí)施例是用于顯示本發(fā)明的潛在的和特異性的實(shí)施方式。應(yīng)能預(yù)期至IJ，實(shí)施例主要是為了對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員說(shuō)明本發(fā)明的目的。在不脫離本發(fā)明精神的情況下，此處所述的這些示意圖或者操作可以有各種變化。例如，在某些情況下，可以以不同的順序進(jìn)行方法中的步驟或者操作，或者可以加入、刪除或者改進(jìn)操作。
[0067]此外，在此描述的本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】是為說(shuō)明本發(fā)明目的，而不是為限制本發(fā)明的目的。在不脫離權(quán)利要求中描述的發(fā)明的情況下，在本發(fā)明的原理和范圍內(nèi)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以預(yù)期進(jìn)行細(xì)節(jié)、材料和組成成分、步驟、結(jié)構(gòu)、和/或份數(shù)的次序的各種改變。
[0068]在不背離如權(quán)利要求所述的本發(fā)明精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可對(duì)在此所描述的實(shí)施方式進(jìn)行變化、改變、以及其他的操作。因此，本發(fā)明不受在前說(shuō)明書的描述所限，反而受下述權(quán)利要求的精神和范圍所限定。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)血液樣品中寄生物顆粒種群的方法，包括下述步驟: a)將所述血液樣品與裂解試劑相混合，以便裂解紅細(xì)胞； b)測(cè)量來(lái)自光源的光損失以獲得軸向光損失測(cè)量值，所述光損失由裂解后的血液樣品中的顆粒穿過(guò)顆粒分析儀時(shí)所引起；以及 c)響應(yīng)于軸向光損失測(cè)量值，使用計(jì)算機(jī)將裂解后的血液樣品中的寄生物顆粒種群與其他種群區(qū)分開來(lái)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括:測(cè)量來(lái)自光源的光散射以獲得光散射測(cè)量值，所述光散射由裂解后的血液樣品中的顆粒穿過(guò)顆粒分析儀時(shí)所引起；以及響應(yīng)于光散射測(cè)量值和軸向光損失測(cè)量值，使用計(jì)算機(jī)將裂解后的血液樣品中的寄生物顆粒種群區(qū)分出來(lái)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，被區(qū)分的寄生物顆粒種群包含被瘧疾寄生物感染的細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法還包括: a)計(jì)數(shù)所述寄生物顆粒種群中的所述顆粒，以便確定寄生物濃度的系數(shù)；以及 b)將寄生物濃度的系數(shù)報(bào)告為對(duì)應(yīng)于寄生物感染的計(jì)數(shù)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法還包括下述步驟:在用抗瘧疾藥物治療期間，通過(guò)周期地測(cè)量所獲得的病人血液樣品中的寄生物濃度來(lái)確定治療的效果。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，至少一種光散射測(cè)量值是中上角度光散射測(cè)量值。`
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述區(qū)分包括: a)使用計(jì)算機(jī)，比較測(cè)得的至少一種光散射測(cè)量值和測(cè)得的軸向光損失測(cè)量值；以及 b)通過(guò)門控由所述比較指示的各個(gè)種群來(lái)檢測(cè)寄生物顆粒種群。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法還包括: a)使用計(jì)算機(jī)對(duì)所述寄生物顆粒種群中的所述顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)，以便確定第一數(shù)目； b)使用計(jì)算機(jī)對(duì)其他顆粒種群中的所述顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)，以便確定第二數(shù)目；以及 c)將包含第一數(shù)目和第二數(shù)目的分?jǐn)?shù)報(bào)告為寄生物感染的指示。
9.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，與各個(gè)白細(xì)胞種群相比，所述寄生物顆粒種群具有較低的所述至少一種光散射測(cè)量值和較低的所述軸向光損失測(cè)量數(shù)值。
10.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述區(qū)分包括: a)比較至少一種光散射測(cè)量值、軸向光損失測(cè)量值、以及第三測(cè)量值，其中第三測(cè)量值是在所述顆粒測(cè)量期間得到的；以及 b )通過(guò)門控由所述比較指示的各個(gè)種群來(lái)檢測(cè)寄生物顆粒種群。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，第三測(cè)量值是直流(DC)測(cè)量值。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括:通過(guò)使用計(jì)算機(jī)對(duì)血液樣品進(jìn)行5H)繪圖，將寄生物感染與其他疾病區(qū)分開來(lái)。
13.一種使用血液樣品來(lái)檢測(cè)寄生物顆粒的方法，包括下述步驟: a)將所述血液樣品與裂解試劑相混合，以便裂解紅細(xì)胞； b)在顆粒分析儀中測(cè)量裂解后的血液樣品中的顆粒，得到由顆粒引起的來(lái)自光源的散射光的光散射測(cè)量值、由顆粒引起的來(lái)自光源的光強(qiáng)度降低的軸向光損失測(cè)量值、以及每一個(gè)顆粒的體積測(cè)量值； C)基于至少一種光散射測(cè)量值和軸向光損失測(cè)量值，使用計(jì)算機(jī)區(qū)分與裂解后的血液樣品中的寄生物顆粒對(duì)應(yīng)的第一顆粒種群； d)基于體積測(cè)量值，使用計(jì)算機(jī)區(qū)分與受到所述寄生物顆粒影響的白細(xì)胞對(duì)應(yīng)的第二顆粒種群；以及 e)響應(yīng)于經(jīng)識(shí)別的第一顆粒種群和第二顆粒種群，報(bào)告寄生物感染。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述識(shí)別第二顆粒種群進(jìn)一步基于由第二顆粒種群引起的光散射測(cè)量值。
15.一種檢測(cè)紅細(xì)胞中寄生物的方法，包括下述步驟: a)裂解血液樣品中的未感染紅細(xì)胞； b)使一束光定向穿過(guò)裂解后的血液樣品； c)測(cè)量由寄生物顆粒種群引起的來(lái)自光束的軸向光損失； d)響應(yīng)于測(cè)得的軸向光損失，確定寄生物顆粒種群的測(cè)量值。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法還包括下述步驟: a)在從光束方向上測(cè)量的預(yù)先確定的角度范圍內(nèi)，測(cè)量由樣品中顆粒引起的散射光； b)將由顆粒引起的在從光束方向上測(cè)量的預(yù)先確定的角度范圍內(nèi)的散射光與顆粒的軸向光損失進(jìn)行比較；以及 c)由所述比較來(lái)確定受感染細(xì)胞的種群。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法還包括下述步驟:在用抗瘧疾藥物治療期間，通過(guò)周期地測(cè)量獲得的病人血液樣品中的寄生物濃度來(lái)確定治療的效果。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，用寄生物顆粒種群中的顆粒的數(shù)量計(jì)數(shù)除以白細(xì)胞的數(shù)量計(jì)數(shù)。
19.一種檢測(cè)血液樣品中寄生物顆粒種群的系統(tǒng)，其包括: a)用于裂解紅細(xì)胞的裂解溶液； b)用于獲得每個(gè)被裂解紅細(xì)胞的軸向光損失測(cè)量值的顆粒分析儀；以及 b)從軸向光損失測(cè)量值來(lái)確定寄生物顆粒種群的計(jì)算機(jī)， 其中較低軸向光損失測(cè)量值的出現(xiàn)是寄生物種群顆粒的指示。
20.如權(quán)利要求19所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述顆粒分析儀可獲得光散射測(cè)量值；以及響應(yīng)于光散射測(cè)量值與軸向光損失測(cè)量值的比較，所述計(jì)算機(jī)可確定寄生物顆粒的種群。
21.如權(quán)利要求20所述的系統(tǒng)，其特征在于，在20-45度之間獲得光散射測(cè)量值。
22.如權(quán)利要求19所述的系統(tǒng)，其特征在于，還包括下述步驟:由寄生物種群計(jì)數(shù)的測(cè)定來(lái)確定血液樣品中的寄生物濃度。
23.如權(quán)利要求22所述的系統(tǒng)，其特征在于，還包括下述步驟:周期地提取附加的血液樣品并且確定寄生物濃度，從而測(cè)量抗寄生物藥物治療對(duì)血液樣品源的效果。
24.如權(quán)利要求19所述的系統(tǒng)，其特征在于，還包括下述步驟:通過(guò)對(duì)血液樣品進(jìn)行5PD繪圖來(lái)將寄生物感染與另一疾病相區(qū)分。
25.一種使用血液樣品來(lái)檢測(cè)寄生物顆粒的方法，包括下述步驟: a)將所述血液樣品與裂解試劑相混合，以便裂解紅細(xì)胞；b)在顆粒分析儀中測(cè)量裂解后的血液樣品中的顆粒，以得到由顆粒引起的來(lái)自光源的散射光的光散射測(cè)量值； C)在顆粒分析儀中測(cè)量裂解后的血液樣品中的顆粒，以得到顆粒的體積測(cè)量值； d)響應(yīng)于光散射測(cè)量值和體積測(cè)量值，使用計(jì)算機(jī)區(qū)分與裂解后的血液樣品中的寄生物顆粒對(duì)應(yīng)的第一顆粒種群； e)響應(yīng)于光散射測(cè)量值和體積測(cè)量值，使用計(jì)算機(jī)區(qū)分與裂解后的血液樣品中的白細(xì)胞顆粒對(duì)應(yīng)的第二顆粒種群；以及 f)響應(yīng)于經(jīng)識(shí)別的第一顆粒種群和第二顆粒種群，報(bào)告寄生物感染。
26.一種使用血液樣品來(lái)檢測(cè)寄生物顆粒的方法，包括下述步驟: a)將所述血液樣品與裂解試劑相混合，以便裂解紅細(xì)胞； b)在顆粒分析儀中測(cè)量裂解后的血液樣品中的顆粒，以得到顆粒不透度的測(cè)量值； c)在顆粒分析儀中測(cè)量裂解后的血液樣品中的顆粒，以得到顆粒的體積測(cè)量值； d)響應(yīng)于不透度測(cè)量值和體積測(cè)量值，使用計(jì)算機(jī)區(qū)分與裂解后的血液樣品中的寄生物顆粒對(duì)應(yīng)的第一顆粒種群； e)響應(yīng)于不透度測(cè)量值 和體積測(cè)量值，使用計(jì)算機(jī)區(qū)分與裂解后的血液樣品中的白細(xì)胞顆粒對(duì)應(yīng)的第二顆粒種群；以及 f)響應(yīng)于經(jīng)識(shí)別的第一顆粒種群和第二顆粒種群，報(bào)告寄生物感染。
【文檔編號(hào)】G01N21/53GK103620386SQ201280023830
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月13日
【發(fā)明者】韓慶子, 陸久留, J.S.賴?yán)? M.A.羅斯曼, R.西蒙-洛佩斯 申請(qǐng)人:貝克曼考爾特公司