有核紅細(xì)胞分析系統(tǒng)和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于分析血液樣本、更具體來(lái)說(shuō)用于進(jìn)行有核紅細(xì)胞(nRBC)分析的系統(tǒng)和方法。所述系統(tǒng)和方法借助于熒光染色和熒光觸發(fā)策略來(lái)篩查血液樣本以便鑒定所述血液樣本內(nèi)的含核粒子。因此，來(lái)自未溶解紅細(xì)胞(RBC)和溶解RBC的片段的干擾被大致上消除。所述系統(tǒng)和方法還使得能夠開(kāi)發(fā)適用于測(cè)定含有易碎白細(xì)胞(WBC)的樣本的相對(duì)溫和的試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)和方法包括：(a)用專有細(xì)胞膜可透性熒光染料染色血液樣本；(b)使用熒光觸發(fā)器篩查所述血液樣本的含核粒子；并且(c)使用光散射和熒光發(fā)射的測(cè)量結(jié)果來(lái)區(qū)分nRBC與WBC。
【專利說(shuō)明】有核紅細(xì)胞分析系統(tǒng)和方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)根據(jù)美國(guó)法典35篇119條(e)款要求題為用于分析有核紅細(xì)胞的方法(Method For Analyzing Nucleated Red Blood Cells)并在 2011 年 5 月 4 日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/482，545的權(quán)益，所述臨時(shí)專利申請(qǐng)的全部公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式并入本文。
[0003]本申請(qǐng)還涉及2012年 4月26日提交的、代理人案卷號(hào)為ADDV-016 (11040US01)、題為“白細(xì)胞分析系統(tǒng)和方法(WHITE BLOOD CELL ANALYSIS SYSTEM AND METHOD)”的申請(qǐng)?zhí)杧x/xxx，XXX ;和2012年4月26日提交的、代理人案卷號(hào)為ADDV-018 (11042US01) /題為“嗜堿性粒細(xì)胞分析系統(tǒng)和方法(BASOPHIL ANALYSIS SYSTEM AND METHOD) ”的申請(qǐng)?zhí)杧x/XXX，xxx,這些申請(qǐng)的全部公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]本發(fā)明涉及血液學(xué)系統(tǒng)和方法。更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及用于分析血液樣本以鑒定、分類和/或定量血液樣本中的有核紅細(xì)胞(nRBC)的系統(tǒng)和方法。
【背景技術(shù)】
[0005]有核紅細(xì)胞常存在于胎兒中和新生兒外周血液中。然而，nRBC被視為對(duì)成人而言是異常的。成人外周血流中存在nRBC通常表明存在嚴(yán)重的骨髓應(yīng)激。研究已顯示在血流中出現(xiàn)nRBC與病?；颊叩闹囟燃膊‰A段和/或不良預(yù)后高度相關(guān)。因此，對(duì)臨床診斷來(lái)說(shuō)，準(zhǔn)確鑒定和定量nRBC已變得日益重要。
[0006]因?yàn)閚RBC與白細(xì)胞(WBC)共有眾多類似性，所以nRBC在血液樣本中的濃度通常被報(bào)道為血液樣本中的總WBC的百分比(即nRBC%=nRBC/WBCX 100%)。分析nRBC的傳統(tǒng)方法包括:⑴根據(jù)大小來(lái)使nRBC與WBC分離；⑵借助于光散射區(qū)別nRBC與WBC ;或(3)在溶解并用細(xì)胞膜不透性熒光染料染色之后，借助于熒光發(fā)射檢測(cè)來(lái)分析nRBC。
[0007]以上所列的每一項(xiàng)技術(shù)都已被證實(shí)在臨床實(shí)踐中存在缺點(diǎn)。舉例而言，在快速血液學(xué)測(cè)量中難以完全消除溶解的紅細(xì)胞(RBC)的片段。因?yàn)镽BC的片段和nRBC的核可能在尺寸和光散射特征方面是類似的，所以基于大小和/或光散射的分析有時(shí)具有誤導(dǎo)性。同時(shí)，基于熒光發(fā)射的分析可能受以下各項(xiàng)的不利影響:(I)樣本“溶解不足”以致細(xì)胞膜不透性染料不能到達(dá)nRBC的核；⑵樣本“溶解過(guò)度”以致WBC的核被染色并干擾nRBC計(jì)數(shù)；
(3)存在易碎淋巴細(xì)胞以致WBC出乎意料地對(duì)溶解試劑過(guò)度敏感(從而得到假陽(yáng)性)；和/或(4)存在溶解抗性nRBC以致nRBC出乎意料地對(duì)溶解試劑不敏感(從而得到假陰性)。實(shí)際上，溶解過(guò)度或溶解不足通常是歸結(jié)于血液樣本之間的血細(xì)胞膜剛性的變化。因此，對(duì)已知光散射和/或熒光發(fā)射檢測(cè)技術(shù)的依賴性可能導(dǎo)致對(duì)nRBC的分析不準(zhǔn)確和不可靠，由此妨礙對(duì)病?；颊叩恼_診斷和治療。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0008] 本文提供用于分析血液樣本、更具體來(lái)說(shuō)進(jìn)行nRBC分析的系統(tǒng)和方法。所述系統(tǒng)和方法借助于用細(xì)胞膜可透性熒光染料進(jìn)行熒光染色來(lái)篩查血液樣本。接著使用熒光觸發(fā)策略來(lái)鑒定、區(qū)分和分離血液樣本內(nèi)的含核粒子(例如nRBC和WBC)與非含核粒子(例如RBC和/或RBC片段)。因此，來(lái)自未溶解RBC和溶解RBC的片段的干擾可在隨后分析之前被大致上消除。舉例而言，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)和方法包括:(a)用專有細(xì)胞膜可透性熒光染料染色血液樣本；(b)使用熒光觸發(fā)器篩查所述血液樣本的含核粒子；并且接著(c)使用光散射和熒光發(fā)射的測(cè)量結(jié)果來(lái)區(qū)分nRBC與WBC。所述系統(tǒng)和方法使得能夠開(kāi)發(fā)適于測(cè)定含有易碎WBC的樣本的相對(duì)溫和試劑。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009]并入本文的附圖構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分。附圖連同本書(shū)面描述一起進(jìn)一步用于說(shuō)明提供的系統(tǒng)和方法的原理，并且使得相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員能夠制造和使用提供的系統(tǒng)和方法。在附圖中，相同參考數(shù)字指示相同或功能上類似的元件。
[0010]圖1A至圖1D顯示全血樣本的頻率曲線(histogram)，其顯示在溶解之后的WBC、nRBC以及RBC殘余物。
[0011]圖1A是顯示軸向光損失(ALL)的測(cè)量結(jié)果的頻率曲線。
[0012]圖1B是顯示中等角度散射(IAS)的測(cè)量結(jié)果的頻率曲線。
[0013]圖1C是顯示90°偏振側(cè)向散射(PSS)的測(cè)量結(jié)果的頻率曲線。
[0014]圖1D是顯示熒光(FLl)的測(cè)量結(jié)果的頻率曲線。
[0015]圖2是示出血液學(xué)儀器的示意圖。
[0016]圖3A至圖3F是示出對(duì)NRBC%為75%的含nRBC血液樣本的分析的細(xì)胞圖。
[0017]圖3A是描繪軸向光損失對(duì)中等角度散射的細(xì)胞圖。
[0018]圖3B是描繪90°偏振側(cè)向散射對(duì)軸向光損失的細(xì)胞圖。
[0019]圖3C是描繪90°偏振側(cè)向散射對(duì)中等角度散射的細(xì)胞圖。
[0020]圖3D是描繪FLl對(duì)軸向光損失的細(xì)胞圖。
[0021]圖3E是描繪FLl對(duì)中等角度散射的細(xì)胞圖。
[0022]圖3F是描繪FLl對(duì)90°偏振側(cè)向散射的細(xì)胞圖。
[0023]圖4A至圖4F是示出對(duì)NRBC%為1.0%的含nRBC血液樣本的分析的細(xì)胞圖。
[0024]圖4A是描繪軸向光損失對(duì)中等角度散射的細(xì)胞圖。
[0025]圖4B是描繪90°偏振側(cè)向散射對(duì)軸向光損失的細(xì)胞圖。
[0026]圖4C是描繪90°偏振側(cè)向散射對(duì)中等角度散射的細(xì)胞圖。
[0027]圖4D是描繪FLl對(duì)軸向光損失的細(xì)胞圖。
[0028]圖4E是描繪FLl對(duì)中等角度散射的細(xì)胞圖。
[0029]圖4F是描繪FLl對(duì)90°偏振側(cè)向散射的細(xì)胞圖。
[0030]圖5是示出如通過(guò)手動(dòng)門(mén)控測(cè)定的NRBC%與參考結(jié)果的相互關(guān)系的圖，其中參考結(jié)果是通過(guò)顯微鏡復(fù)查獲得。
[0031]圖6是示出如通過(guò)手動(dòng)門(mén)控測(cè)定的NRBC%與參考結(jié)果的相互關(guān)系的圖，其中參考結(jié)果是通過(guò)“CELL-DYN” Sapphire?血液學(xué)分析儀獲得。
[0032]圖7是示出如通過(guò)自動(dòng)聚類測(cè)定的NRBC%與參考結(jié)果的相互關(guān)系的圖，其中參考結(jié)果是通過(guò)顯微鏡復(fù)查獲得。
[0033]圖8是示出如通過(guò)自動(dòng)聚類測(cè)定的NRBC%與參考結(jié)果的相互關(guān)系的圖，其中參考結(jié)果是通過(guò)“CELL-DYN” Sapphire?血液學(xué)分析儀獲得。
【具體實(shí)施方式】
[0034]本文提供用于分析血液樣本、更具體來(lái)說(shuō)用于進(jìn)行nRBC分析以鑒定、分類和計(jì)數(shù)血液樣本中的nRBC的系統(tǒng)和方法。一般說(shuō)來(lái)，所公開(kāi)的系統(tǒng)和方法借助于突光染色和突光觸發(fā)策略來(lái)篩查含核事件與非含核事件的對(duì)比。因此，來(lái)自如溶解抗性紅細(xì)胞(rstRBC)的未溶解紅細(xì)胞(RBC)和RBC片段的干擾在隨后分析之前被大致上消除。換句話說(shuō)，本文所述的系統(tǒng)和方法利用至少一種熒光染料和熒光觸發(fā)系統(tǒng)來(lái)篩查含核事件，由此精確而可靠地鑒定和定量WBC和nRBC。接著，使用組合光散射信息與熒光信息來(lái)進(jìn)一步使nRBC與WBC分離。所公開(kāi)的系統(tǒng)和方法由此確保對(duì)nRBC、WBC和WBC子群體的精確計(jì)數(shù)和區(qū)別。所述系統(tǒng)和方法也使得能夠開(kāi)發(fā)適于測(cè)定含有易碎淋巴細(xì)胞(或其它易碎WBC)的樣本(包括老化樣本)的相對(duì)溫和WBC試劑。
[0035]在一個(gè)實(shí)施方案中，舉例而言，本文公開(kāi)的系統(tǒng)和方法包括:(a)用專有細(xì)胞膜可透性熒光染料染色血液樣本；(b)使用熒光觸發(fā)器篩查所述血液樣本的含核粒子；以及(C)使用光散射和熒光發(fā)射的測(cè)量結(jié)果來(lái)區(qū)分nRBC與WBC。本發(fā)明的系統(tǒng)和方法顯示超過(guò)傳統(tǒng)方法的巨大優(yōu)勢(shì)，因?yàn)閬?lái)自RBC的片段的干擾被大致上消除，并且測(cè)定結(jié)果對(duì)溶解強(qiáng)度的敏感性變得小得多。換句話說(shuō)，傳統(tǒng)nRBC分析技術(shù)對(duì)溶解強(qiáng)度高度敏感。如果溶解劑(lysing agent，或裂解劑)的強(qiáng)度太弱，那么在對(duì)WBC的分析中也會(huì)收集RBC的片段或未溶解RBC。這些RBC片段或未溶解RBC在許多方面與nRBC重疊，從而在分析nRBC時(shí)產(chǎn)生困難。另一方面，如果溶解劑的強(qiáng)度太強(qiáng)(為了更好處理RBC的片段)，那么某一百分比的淋巴細(xì)胞可遭損傷并且可被認(rèn)定為nRBC。因此，溶解劑的強(qiáng)度是WBC分析中的一個(gè)問(wèn)題。本文所述的方法的一個(gè)關(guān)鍵特征是在WBC和nRBC分析中降低了來(lái)自RBC片段或未溶解RBC的干擾。因此，可更好地耐受溶解劑的強(qiáng)度變化。即使溶解劑弱于常用溶解劑強(qiáng)度，未溶解RBC也不會(huì)干擾對(duì)nRBC的測(cè)定。
[0036]在本文所述的系統(tǒng)和方法中，可在單一測(cè)定中同時(shí)獲得對(duì)nRBC和WBC的定量和鑒定?；蛘?，在本文所述的系統(tǒng)和方法中，可在不分析WBC下對(duì)nRBC進(jìn)行定量和鑒定。
[0037](I)熒光染料的使用。
[0038]WBC和nRBC在其核中含有相對(duì)較高濃度的DNA。然而，成熟RBC不含有DNA。因此，選擇熒光染料來(lái)區(qū)別兩類血細(xì)胞；即，含有核酸的血細(xì)胞和不含有核酸的血細(xì)胞。染料的目的在于易于穿透到活細(xì)胞中，以高親和力結(jié)合DNA，并且在染料由適當(dāng)光源激發(fā)時(shí)以足夠斯托克斯位移(Stokes shift)發(fā)射強(qiáng)的熒光。染料在可見(jiàn)波段中的峰吸收大致上匹配光源波長(zhǎng)(在50nm光源波長(zhǎng)內(nèi)、更優(yōu)選在25nm光源波長(zhǎng)內(nèi))以適當(dāng)激發(fā)染料并獲得最佳結(jié)果。
[0039]所選熒光染料優(yōu)選:I)能夠結(jié)合核酸，2)能夠穿透WBC和nRBC的細(xì)胞膜，3)當(dāng)經(jīng)受光源時(shí)可在所選波長(zhǎng)下激發(fā)，4)在由光源激發(fā)后發(fā)射熒光，并且5)在液體中具有生物穩(wěn)定性和可溶性。染料可選自由以下組成的組:卩丫唳橙(acridine orange)、SYBRl1、SYBR綠系列染料、碘化己錠(hexidium iodide), SYTOIK SYTO12, SYTO13, SYTO14, SYTO16, SYT02KRNA選擇性SYTO、SYT024、SYT025及其任何等效物。染料用于“活化” WBC和nRBC，并且基于血液學(xué)分析儀中配置的熒光觸發(fā)器來(lái)“篩出”未溶解RBC和RBC的片段。染料通常以約
0.1ng/mL至約0.lmg/mL的濃度存在。盡管各種染料可用，但所選染料通常與血液學(xué)分析儀的激發(fā)源配對(duì)以便使用單一專有染料在意圖受鑒定、定量和/或分析的nRBC和所有WBC子群體中進(jìn)行染色并激發(fā)熒光發(fā)射。因此，單一(即專有)染料可用于同時(shí)鑒定、定量和分析nRBC以及所有WBC子群體。
[0040]在一個(gè)實(shí)施方案中，以試劑形式、以足以進(jìn)行染色并且活化每微升多達(dá)1，000X IO3個(gè)細(xì)胞的量、與以下各物組合來(lái)提供熒光染料:1)至少一種表面活性劑，2)至少一種緩沖劑，3)至少一種鹽，以及/或4)至少抗微生物劑。如“TRITON” X-100或皂素(saponin)的至少一種表面活性劑用于破壞RBC的膜，并且減小RBC的片段的大小。至少一種表面活性劑通常以約0.001%至約5%的濃度存在。如來(lái)自“TRIADINE”或“PR0CLIN”家族的抗微生物劑的至少一種抗微生物劑用于防止試劑受微生物污染。至少一種抗微生物劑的濃度應(yīng)足以持續(xù)所需保存期限來(lái)保存試劑。如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或4-(2-羥乙基)-1_哌嗪乙烷磺酸(HEPES)的至少一種緩沖劑用于調(diào)整反應(yīng)混合物的pH以控制RBC的溶解和保存WBC。至少一種緩沖劑通常以約0.01%至約3%的濃度存在。pH通常在約3至約12的范圍內(nèi)。如NaCl或Na2SO4的至少一種鹽用于調(diào)整重量摩爾滲透濃度(osmolality，重量克分子滲透濃度)以增加溶解(lysing，裂解)效應(yīng)和/或使WBC保存最優(yōu)化。至少一種鹽可以約0.01%至約3%的濃度存 在。在某些情況下，至少一種緩沖劑可充當(dāng)至少一種鹽，或至少一種鹽可充當(dāng)至少一種緩沖劑。一般說(shuō)來(lái)，較低重量摩爾滲透濃度或低張性用于加速RBC溶解。重量摩爾滲透濃度通常在約20m0sm至約250m0sm的范圍內(nèi)。
[0041]可在以約I體積份樣本對(duì)約35體積份試劑的比率混合血液樣本與試劑之后,使RBC在高于室溫的溫度(例如在約30°C至約50°C之間，如約40°C)下歷經(jīng)相對(duì)較短的時(shí)期(例如小于約25秒、小于約17秒、或甚至小于約9秒)發(fā)生溶解。用多個(gè)光學(xué)通道和至少一個(gè)熒光通道收集分析數(shù)據(jù)。
[0042]圖1A至圖1D顯示全血樣本的頻率曲線(histogram，直方圖)，其顯示在溶解之后基于光學(xué)和熒光測(cè)量結(jié)果分離WBC、nRBC和RBC殘余物。更具體來(lái)說(shuō)，圖1A是顯示基于軸向光損失(ALL)的測(cè)量結(jié)果的粒子分離的頻率曲線。圖1B是顯示基于中等角度散射(IAS)的測(cè)量結(jié)果的粒子分離的頻率曲線。圖1C是顯示基于90°偏振側(cè)向散射(PSS)的測(cè)量結(jié)果的粒子分離的頻率曲線。圖1D是顯示基于熒光(FLl)的測(cè)量結(jié)果的粒子分離的頻率曲線。在頻率曲線中，水平軸指示檢測(cè)通道的值(或通道名稱，即ALL、IAS、PSS*FL1)。垂直軸指示血液樣本的組分的計(jì)數(shù)。在頻率曲線中，線100指示RBC殘余物,線200指示W(wǎng)BC,并且線300指示nRBC。如通過(guò)比較圖1D與圖1A至圖1C所示，熒光信息而非光學(xué)測(cè)量結(jié)果顯示含核粒子(例如WBC和nRBC)與非含核粒子(RBC殘余物)之間的分離好得多。如本文所用，“RBC殘余物”與“RBC的片段”同義。
[0043](2)熒光觸發(fā)器的使用。
[0044]在由光源激發(fā)熒光染料后，血細(xì)胞發(fā)射不同量級(jí)的熒光信號(hào)。熒光信號(hào)的量級(jí)差異由細(xì)胞內(nèi)部的核酸(即DNA)的量產(chǎn)生。DNA的量越大，熒光信號(hào)較高的可能性越大。此外，穿透細(xì)胞膜的功效、染料尺寸、染料與DNA之間的結(jié)合動(dòng)力學(xué)、染料與DNA之間的親和力及其它因素也會(huì)影響熒光信號(hào)。成熟RBC發(fā)射最小熒光信號(hào)，因?yàn)樵诔墒霷BC內(nèi)不存在DNA。nRBC發(fā)射非常強(qiáng)的熒光信號(hào)，不僅因?yàn)閚RBC的核內(nèi)部存在DNA，而且因?yàn)閚RBC的膜在溶解程序期間被破壞所以染色也更容易。未溶解RBC或RBC片段不發(fā)射熒光，但其可發(fā)射極弱自體熒光。如參照?qǐng)D1D所示，發(fā)射強(qiáng)得多的熒光信號(hào)的細(xì)胞是具有核的細(xì)胞，即所有WBC和nRBC(當(dāng)存在時(shí))。
[0045]因此，本文提供的系統(tǒng)和方法使用熒光觸發(fā)器來(lái)收集和分析WBC和nRBC。舉例而言，通常在來(lái)自RBC的信號(hào)與來(lái)自WBC和nRBC的信號(hào)之間設(shè)置的熒光觸發(fā)器可用于收集來(lái)自WBC和nRBC的信號(hào)供隨后分析用。
[0046](3)用于分析的多個(gè)光學(xué)通道和至少一個(gè)熒光通道的使用。
[0047]如本文所用，表述“熒光信息”意指從血液學(xué)分析儀的熒光通道收集的數(shù)據(jù)。如本文所用，表述“熒光通道”意指設(shè)置在用于測(cè)量自樣本發(fā)射的熒光的量的合適的波段下的檢測(cè)裝置，如光電倍增管。
[0048]在一個(gè)實(shí)施方案中，借助于多角度偏振散射分離技術(shù)(MAPSS)進(jìn)行血液樣本分析，其中熒光信息得以增強(qiáng)。至少一個(gè)光電二極管或至少一個(gè)光電倍增管或至少一個(gè)光電二極管與至少一個(gè)光電倍增管兩者是檢測(cè)由穿過(guò)流動(dòng)池的各血細(xì)胞散射的光所需的。兩個(gè)或更多個(gè)光電二極管用于測(cè)量度量約0°散射的ALL信號(hào)和度量低角度(例如約3°至約15° )散射的IAS信號(hào)。兩個(gè)或更多個(gè)光電倍增管用于檢測(cè)90°偏振側(cè)向散射(PSS)信號(hào)和90°去偏振側(cè)向散射(DSS)信號(hào)。對(duì)適當(dāng)波長(zhǎng)范圍內(nèi)的FLl測(cè)量來(lái)說(shuō)，取決于對(duì)光源波長(zhǎng)的選擇而需要其它光電倍增管。因此，在系統(tǒng)上捕獲的每一事件展現(xiàn)多方面的信息，如ALL、IAS ( 一個(gè)或多個(gè)通道)、PSS、DSS和熒光(一個(gè)或多個(gè)通道)。來(lái)自這些檢測(cè)通道的信息用于進(jìn)一步分析血細(xì)胞。
[0049]圖2是示出適于 血液學(xué)分析(包括流式細(xì)胞術(shù))的裝置的發(fā)光和檢測(cè)光學(xué)器件的不意圖?，F(xiàn)參照?qǐng)D2,裝置10包括光源12、用于光束彎曲的前鏡14和后鏡16、含有第一圓柱形透鏡20和第二圓柱形透鏡22的光束擴(kuò)展器模塊18、聚焦透鏡24、精細(xì)光束調(diào)整器26、流動(dòng)池28、前向散射透鏡30、靶心檢測(cè)器32、第一光電倍增管34、第二光電倍增管36和第三光電倍增管38。靶心檢測(cè)器32具有用于0°光散射的內(nèi)部檢測(cè)器32a和用于7°光散射的外部檢測(cè)器32b。
[0050]在隨后論述中，光源優(yōu)選是激光器。然而，也可使用其它光源，例如像燈(例如萊燈、氣燈)。光源12可為可商購(gòu)自Coherent, Inc.，Santa Clara, CA的垂直偏振氣冷Coherent Cube激光器?？墒褂貌ㄩL(zhǎng)在350nm至700nm的范圍內(nèi)的激光器。激光器的操作條件大致上與當(dāng)前與“CELL-DYN”自動(dòng)血液學(xué)分析儀一起使用的激光器的操作條件類似。
[0051]關(guān)于流動(dòng)池、透鏡、聚焦透鏡、精細(xì)光束調(diào)整機(jī)構(gòu)和激光聚焦透鏡的其它細(xì)節(jié)可見(jiàn)于以引用的方式并入本文的美國(guó)專利號(hào)5，631，165中，尤其在第41欄第32行至第43欄第11行。圖2中所示的前向光路系統(tǒng)包括球面平凸透鏡30和位于透鏡的后聚焦平面中的兩元件光電二級(jí)管檢測(cè)器32。在這個(gè)構(gòu)造中，兩元件光電二極管檢測(cè)器32內(nèi)的每個(gè)點(diǎn)映射來(lái)自穿過(guò)流動(dòng)池28移動(dòng)的細(xì)胞的光的一個(gè)特定收集角。檢測(cè)器32可為能夠檢測(cè)軸向光損失(ALL)和中等角度前向散射(IAS)的靶心檢測(cè)器。美國(guó)專利號(hào)5，631，165在第43欄第12-52行描述這個(gè)檢測(cè)器的各種替代物。
[0052]第一光電倍增管34(PMT1)測(cè)量去偏振側(cè)向散射(DSS)。第二光電倍增管36 (PMT2)測(cè)量偏振側(cè)向散射(PSS)，并且視所選熒光染料和所用光源而定，第三光電倍增管38(PMT3)測(cè)量自440nm至680nm的熒光發(fā)射。光電倍增管在廣泛波長(zhǎng)范圍內(nèi)收集熒光信號(hào)以增加信號(hào)強(qiáng)度。側(cè)向散射和熒光發(fā)射由二向色光束分離器40和42導(dǎo)向這些光電倍增管，所述二向色光束分離器在所需波長(zhǎng)下高效傳輸和反射以使得能夠進(jìn)行高效檢測(cè)。美國(guó)專利號(hào)5，631，165在第43欄第53行至第44欄第4行描述關(guān)于光電倍增管的各種其它細(xì)節(jié)。
[0053]當(dāng)通過(guò)使用浸潰收集系統(tǒng)測(cè)量熒光時(shí)，在光電倍增管34、36和38處的靈敏性得以增強(qiáng)。浸潰收集系統(tǒng)是借助于折射率匹配層使第一透鏡30光學(xué)連接于流動(dòng)池28，從而使得能夠在寬泛角度上收集光的收集系統(tǒng)。美國(guó)專利號(hào)5，631，165在第44欄第5_31行描述這個(gè)光學(xué)系統(tǒng)的各種其它細(xì)節(jié)。
[0054]集光器44是一種用于高分辨率顯微術(shù)中的具有足夠用于受衍射限制的成像的像差校正的光學(xué)透鏡系統(tǒng)。美國(guó)專利號(hào)5，631，165在第44欄第32-60行描述這個(gè)光學(xué)系統(tǒng)的各種其它細(xì)節(jié)。
[0055]圖2中所示的其它部件(即狹縫46、場(chǎng)透鏡48和第二狹縫50)的功能描述于美國(guó)專利號(hào)5，631，165第44欄第63行至第45欄第26行中。插入光電倍增管的光路中以改變所檢測(cè)光的波長(zhǎng)或偏振化或波長(zhǎng)與偏振化兩者的光學(xué)濾光片52或56和偏光器52或56也描述于美國(guó)專利號(hào)5，631，165第44欄第63行至第45欄第26行中。適用于本文中的光學(xué)濾光片包括帶通濾光片和長(zhǎng)通濾光片。
[0056]光電倍增管34、36和38檢測(cè)側(cè)向散射(在軸近似垂直于入射激光光束的錐體中散射的光)或熒光(在與入射激光光束的波長(zhǎng)不同的波長(zhǎng)下自細(xì)胞發(fā)射的光)。
[0057]盡管以上參考美國(guó)專利號(hào)5，631，165的所選部分，但美國(guó)專利號(hào)5，631，165以引用的方式整體并入本文。
[0058]收集的光學(xué)和熒光信息可接著用于區(qū)分(或區(qū)別)nRBC與WBC(和WBC子群體)。舉例而言，二維細(xì)胞圖(例如顯示PSS對(duì)ALL ；ALL對(duì)IAS ;和/或FLl對(duì)ALL/IAS/PSS的細(xì)胞圖)可用于鑒定和區(qū)分粒子。
[0059]圖3A至圖3F是示出對(duì)NRBC%為75%的含nRBC血液樣本的分析的細(xì)胞圖。更具體來(lái)說(shuō)，圖3A是描繪軸向光損失對(duì)中等角度散射的細(xì)胞圖。圖3B是描繪90°偏振側(cè)向散射對(duì)軸向光損失的細(xì)胞圖。圖3C是描繪90°偏振側(cè)向散射對(duì)中等角度散射的細(xì)胞圖。圖3D是描繪FLl對(duì)軸向光損失的細(xì)胞圖。圖3E是描繪FLl對(duì)中等角度散射的細(xì)胞圖。圖3F是描繪FLl對(duì)90 °偏振側(cè)向散射的細(xì)胞圖。從細(xì)胞圖獲得的NRBC%值是80.7 (如使用PSS對(duì)ALL，通過(guò)手動(dòng)門(mén)控所測(cè)定)和76.3 (如通過(guò)用MATLAB軟件進(jìn)行的自動(dòng)聚類分析所測(cè)定)。
[0060]圖4A至圖4F是示出對(duì)NRBC%為1.0%的含nRBC的血液樣本的分析的細(xì)胞圖。更具體來(lái)說(shuō)，圖4A是描繪軸向光損失對(duì)中等角度散射的細(xì)胞圖。圖4B是描繪90°偏振側(cè)向散射對(duì)軸向光損失的細(xì)胞圖。圖4C是描繪90°偏振側(cè)向散射對(duì)中等角度散射的細(xì)胞圖。圖4D是描繪FLl對(duì)軸向光損失的細(xì)胞圖。圖4E是描繪FLl對(duì)中等角度散射的細(xì)胞圖。圖4F是描繪FLl對(duì)90°偏振側(cè)向散射的細(xì)胞圖。從細(xì)胞圖獲得的NRBC%值是1.2(如使用PSS對(duì)ALL，通過(guò)手 動(dòng)門(mén)控所測(cè)定)和1.2 (如通過(guò)用MATLAB軟件進(jìn)行的自動(dòng)聚類分析所測(cè)定)O
[0061]在使用總計(jì)136個(gè)含有nRBC的樣本的研究中，手動(dòng)顯微鏡復(fù)查與“CELL-DYN” Sapphire?血液學(xué)分析儀結(jié)果兩者均用作用于定量nRBC的參照。試劑中包括濃度為3 μ g/mL的吖啶橙。血液樣本與試劑以I體積份樣本對(duì)35體積份試劑的比率混合。在40°C的溫度下持續(xù)25秒時(shí)期孵育混合物。應(yīng)用9秒的樣本測(cè)量持續(xù)時(shí)間，其中FLl用作唯一觸發(fā)器。收集各樣本的ALL、IAS、PSS和FLl測(cè)量結(jié)果。使用手動(dòng)門(mén)控(PSS對(duì)ALL、或PSS對(duì)IAS)與利用MATLAB軟件進(jìn)行的自動(dòng)聚類分析兩者分析數(shù)據(jù)。由本發(fā)明方法獲得的結(jié)果與參考結(jié)果之間的nRBC%關(guān)聯(lián)如圖5-8中所示加以報(bào)道。
[0062]舉例而言，圖5比較結(jié)果(通過(guò)手動(dòng)門(mén)控獲得)與參考結(jié)果，其中參考結(jié)果是通過(guò)顯微鏡復(fù)查獲得。如所示，本發(fā)明的系統(tǒng)和方法根據(jù)斜率和R2公式產(chǎn)生結(jié)果:Y=1.0404Χ ；(R2=0.968)。
[0063]圖6比較結(jié)果(通過(guò)手動(dòng)門(mén)控獲得)與參考結(jié)果，其中參考結(jié)果是通過(guò)“CELL-DYN”Sapphire?血液學(xué)分析儀獲得。如所示，本發(fā)明的系統(tǒng)和方法根據(jù)斜率和R2公式產(chǎn)生結(jié)果:Y=1.1004Χ ； (R2=0.956)。
[0064]圖7比較結(jié)果(通過(guò)自動(dòng)聚類獲得)與參考結(jié)果，其中參考結(jié)果是通過(guò)顯微鏡復(fù)查獲得。如所示，本發(fā)明的系統(tǒng)和方法根據(jù)斜率和R2公式產(chǎn)生結(jié)果:Υ=1.0215Χ ；(R2=0.963)。
[0065]圖8比較結(jié)果(通過(guò)自動(dòng)聚類獲得)與參考結(jié)果，其中參考結(jié)果是通過(guò)“CELL-DYN”Sapphire?血液學(xué)分析儀獲得。如所示，本發(fā)明的系統(tǒng)和方法根據(jù)斜率和R2公式產(chǎn)生結(jié)果:Y=1.0800Χ (R2=0.950)。
[0066]也基于聚類的平均位置和分布差異系數(shù)計(jì)算nRBC與淋巴細(xì)胞之間的巴特查里亞距離(Bhattacharyya distance, BD)。如果BD超過(guò)3,那么聚類分離被視為“良好”,并且如果BD大于2且小于或等于3，那么聚類分離被視為“可接受”。對(duì)于136個(gè)樣本，測(cè)試的平均BD值是4.64± 1.89，在2.10至11.95的范圍內(nèi)。觀察到在超過(guò)85%(116/136)的含有nRBC的樣本中，nRBC與淋巴細(xì)胞之間良好分離(其中BD超過(guò)3)。
[0067]與測(cè)量nRBC的傳統(tǒng)方法難以使“溶解過(guò)度”與“溶解不足”平衡不同，本文所述的方法保存WBC且提供nRBC與淋巴細(xì)胞(最接近nRBC的WBC子群體)之間的最佳分離。此外，來(lái)自RBC的片段的干擾被大致上消除。
[0068]其它實(shí)施方案
[0069]在另一實(shí)施方案中，提供一種用于對(duì)已用熒光染料染色的血液樣本進(jìn)行有核紅細(xì)胞(nRBC)分析的血液學(xué)分析儀，其中所述熒光染料是細(xì)胞膜可透性和核酸結(jié)合性的。所述分析儀包括被定位來(lái)激發(fā)血液樣本內(nèi)的粒子的激發(fā)源。所述分析儀也包括多個(gè)檢測(cè)器，包括:(1)軸向光損失檢測(cè)器，其被定位來(lái)測(cè)量所激發(fā)血液樣本的軸向光損失；(2)中等角度散射檢測(cè)器，其被定位來(lái)測(cè)量所激發(fā)血液樣本的中等角度散射；(3)側(cè)向散射檢測(cè)器，其被定位來(lái)測(cè)量所激發(fā)血液樣本的90°側(cè)向散射；以及(4)熒光檢測(cè)器，其被定位來(lái)測(cè)量自所激發(fā)血液樣本發(fā)射的熒光。所述分析儀也包括處理器，其被配置來(lái):(a)接收來(lái)自多個(gè)檢測(cè)器的(I)軸向光損失、(2)中等角度散射、(3)90°側(cè)向散射和(4)熒光的測(cè)量結(jié)果，并且
(b)基于發(fā)射高于熒光閾值的熒光的粒子的所有四種測(cè)量結(jié)果對(duì)血液樣本進(jìn)行nRBC差異分析。側(cè)向散射檢測(cè)器可為偏振側(cè)向散射檢測(cè)器，其被定位來(lái)測(cè)量所激發(fā)血液樣本的90°偏振側(cè)向散射。所述血液學(xué)分析儀可進(jìn)一步包括去偏振側(cè)向散射檢測(cè)器，其被定位來(lái)測(cè)量所激發(fā)血液樣本的90°去偏振側(cè)向散射。處理器可進(jìn)一步被配置來(lái)預(yù)篩查接收的測(cè)量結(jié)果以排除對(duì)不滿足熒光閾值的任何粒子的考慮。軸向光損失檢測(cè)器可測(cè)量在0°散射下的軸向光損失。中等角度散射檢測(cè)器可測(cè)量在約3°至約15°下的光角度散射。多個(gè)檢測(cè)器可包括一個(gè)或多個(gè)光電倍增管。激發(fā)源可為被配置來(lái)在對(duì)應(yīng)于熒光染料的波長(zhǎng)下發(fā)射光的激光器?？蛇x擇熒光染料以與激發(fā)源對(duì)應(yīng)。
[0070]血液學(xué)分析儀可進(jìn)一步包括用于以試劑稀釋血液樣本的孵育子系統(tǒng)。試劑可包括熒光染料和溶解劑。試劑可替代地包含(a)至少一種表面活性劑，(b)至少一種緩沖劑或至少一種鹽，(C)至少一種抗微生物劑，以及(d)熒光染料。孵育子系統(tǒng)可被配置來(lái)持續(xù)小于約25秒、小于約17秒和/或小于約9秒的時(shí)期孵育血液樣本與試劑。孵育子系統(tǒng)可被配置來(lái)在范圍從約30°C至約50°C的溫度，如約40°C的溫度下孵育血液樣本與試劑。
[0071]在另一實(shí)施方案中，提供一種用自動(dòng)血液學(xué)分析儀進(jìn)行有核紅細(xì)胞nRBC分析的方法。所述方法包括以下步驟:(a)用試劑稀釋全血的樣本，其中所述試劑包括紅細(xì)胞(RBC)溶解劑和細(xì)胞膜可透性核酸結(jié)合熒光染料；(b)在范圍從約30°C至約50°C的溫度下持續(xù)小于約25秒的孵育期孵育步驟(a)的所稀釋血液樣本；(c)將來(lái)自步驟(b)的所孵育樣本遞送至血液學(xué)分析儀中的流動(dòng)池；(d)當(dāng)所述孵育樣本橫穿過(guò)所述流動(dòng)池時(shí)，用激發(fā)源激發(fā)來(lái)自步驟(c)的所述孵育樣本；(e)收集來(lái)自所述激發(fā)樣本的多個(gè)光散射信號(hào)和熒光發(fā)射信號(hào)；以及(f)基于步驟(e)中收集的所有信號(hào)進(jìn)行nRBC分析，同時(shí)基于熒光發(fā)射信號(hào)排除對(duì)所述稀釋血液樣本內(nèi)不滿足熒光閾值的任何粒子的考慮。
[0072]試劑可包括:(a)至少一種表面活性劑，(b)至少一種緩沖劑或至少一種鹽，(C)至少一種抗微生物劑，以及(d)至少一種熒光染料。激發(fā)源的波長(zhǎng)可為約350nm至約700nm?？赏ㄟ^(guò)帶通濾光片或長(zhǎng)通濾光片在約360nm至約750nm的波長(zhǎng)下收集熒光發(fā)射。多個(gè)光散射信號(hào)可包括:(I)軸向光損失，(2)中等角度散射，以及(3)90°側(cè)向散射。多個(gè)光散射信號(hào)可包括:(I)軸向光損失，(2)中等角度散射，(3)90°偏振側(cè)向散射，以及(4)90°去偏振側(cè)向散射。
[0073]在另一實(shí)施方案中，提供用于借助于自動(dòng)血液學(xué)分析儀來(lái)計(jì)數(shù)nRBC的系統(tǒng)和方法。所述系統(tǒng)和方法包括用于以下的裝置和步驟:(a)用至少一種白細(xì)胞試劑稀釋包含有核紅細(xì)胞的全血樣本；(b)在所選溫度范圍內(nèi)持續(xù)足夠時(shí)期孵育步驟(a)的所稀釋樣本以溶解紅細(xì)胞，使有核紅細(xì)胞的核暴露于所述至少一種白細(xì)胞試劑，并且使至少一種熒光染料染色有核紅細(xì)胞的核并保存白細(xì)胞；(C)以液流形式將步驟(b)的所孵育樣本遞送至流動(dòng)池；(d)當(dāng)所孵育樣本橫穿過(guò)所述流動(dòng)池時(shí)用光源激發(fā)所孵育樣本；(e)同時(shí)收集多個(gè)光學(xué)散射信號(hào)與至少一個(gè)熒光發(fā)射信號(hào)；以及(f)借助于步驟(e)中收集的光學(xué)信息和熒光信息區(qū)別和定量有核紅細(xì)胞。所述系統(tǒng)和方法進(jìn)一步包括:(I)在溶解RBC的程序期間使用至少一種熒光染料結(jié)合且染色給定血液樣本中的WBC中的核酸和nRBC的核，并且在由來(lái)自如激光光束的給定光源的光子在適當(dāng)波長(zhǎng)下激發(fā)后誘導(dǎo)熒光發(fā)射；(2)使用熒光觸發(fā)器分離和收集發(fā)射強(qiáng)的熒光的事件(即WBC和nRBC);以及(3)使用多個(gè)光學(xué)通道和至少一個(gè)熒光通道收集和分析數(shù)據(jù)來(lái)鑒定nRBC并且使nRBC與WBC分離。本文所述的系統(tǒng)和方法允許同時(shí)分析WBC與nRBC。不需要其它試劑、樣本制備或分析程序。因此，所述方法高效、劃算且切實(shí)可行地用于現(xiàn)代診斷用途。
[0074]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種或多種能夠執(zhí)行本文所述的功能性的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。舉例而言，本文論述的任何方法/分析步驟都可在具有一個(gè)或多個(gè)處理器、數(shù)據(jù)通信基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)(例如通信總線、交叉條或網(wǎng)絡(luò))、顯示器接口和/或存儲(chǔ)體或存儲(chǔ)單元的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中實(shí)施。存儲(chǔ)體或存儲(chǔ)單元可包括具有在執(zhí)行時(shí)使處理器執(zhí)行本文所述的一個(gè)或多個(gè)功能的指令(例如控制邏輯或軟件)的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)”、“計(jì)算機(jī)程序介質(zhì)”和“計(jì)算機(jī)可用介質(zhì)”用于泛指介質(zhì)，如可移動(dòng)存儲(chǔ)驅(qū)動(dòng)器、可移動(dòng)存儲(chǔ)單元、通過(guò)通信接口傳輸?shù)臄?shù)據(jù)和/或安裝在硬盤(pán)驅(qū)動(dòng)器中的硬盤(pán)。所述計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品向計(jì)算機(jī)系統(tǒng)提供計(jì)算機(jī)軟件、指令和/或數(shù)據(jù)，所述計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品也用于將所述計(jì)算機(jī)系統(tǒng)從通用計(jì)算機(jī)轉(zhuǎn)變成被編程來(lái)執(zhí)行本文所述的特定功能的專用計(jì)算機(jī)。當(dāng)適當(dāng)時(shí)，處理器、相關(guān)部件和等效系統(tǒng)以及子系統(tǒng)因此充當(dāng)用于執(zhí)行所選操作和功能的“裝置”的實(shí)例。用于執(zhí)行所選操作和功能的這類“裝置”也用于將通用計(jì)算機(jī)轉(zhuǎn)變成被編程來(lái)執(zhí)行所述所選操作和功能的專用計(jì)算機(jī)。
[0075]結(jié)論
[0076] 已出于說(shuō)明和描述目的提出本發(fā)明的以上描述。本篇描述不意圖是詳盡的或?qū)⒈景l(fā)明限于所公開(kāi)的精確形式。鑒于以上教導(dǎo)，其它修改和變化可為可能的。選擇和描述這些實(shí)施方案是為最佳地說(shuō)明本發(fā)明的原理和它的實(shí)際應(yīng)用，并且由此使得本領(lǐng)域其他技術(shù)人員能夠最佳地利用如適于所涵蓋的特定用途的各種實(shí)施方案和各種修改形式中的
【發(fā)明內(nèi)容】
。意圖將隨附權(quán)利要求解釋為包括本發(fā)明的其它替代性實(shí)施方案；包括等效結(jié)構(gòu)、部件、方法和裝置。
[0077]以上詳述涉及說(shuō)明一個(gè)或多個(gè)示例性實(shí)施方案的附圖。其它實(shí)施方案是可能的。可在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下對(duì)所述實(shí)施方案進(jìn)行修改。因此，詳述不意圖具有限制性。此外，概述和摘要章節(jié)可闡述本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)而非所有如由
【發(fā)明者】所設(shè)想的示例性實(shí)施方案，并且因此不意圖以任何方式限制本發(fā)明和隨附的權(quán)利要求。
【權(quán)利要求】
1.一種用于對(duì)已用熒光染料染色的血液樣本進(jìn)行有核紅細(xì)胞(IiRBC)分析的血液學(xué)分析儀，其中所述熒光染料是細(xì)胞膜可透性和核酸結(jié)合性的，所述分析儀包括: 激發(fā)源，其被定位來(lái)激發(fā)所述血液樣本內(nèi)的粒子； 多個(gè)檢測(cè)器，包括(I)軸向光損失檢測(cè)器，其被定位來(lái)測(cè)量所激發(fā)血液樣本的軸向光損失；(2)中等角度散射檢測(cè)器，其被定位來(lái)測(cè)量所激發(fā)血液樣本的中等角度散射；(3)側(cè)向散射檢測(cè)器，其被定位來(lái)測(cè)量所激發(fā)血液樣本的90°側(cè)向散射；以及(4)熒光檢測(cè)器，其被定位來(lái)測(cè)量從所激發(fā)血液樣本發(fā)射的熒光；以及處理器，其被配置為 (a)接收來(lái)自所述多個(gè)檢測(cè)器的(I)軸向光損失、(2)中等角度散射、(3)90°側(cè)向散射以及(4)熒光的測(cè)量結(jié)果，并且 (b)基于對(duì)發(fā)射高于熒光閾值的熒光的粒子的所有四種測(cè)量結(jié)果來(lái)進(jìn)行所述血液樣本的nRBC差異分析。
2.如權(quán)利要求1所述的血液學(xué)分析儀，其中所述側(cè)向散射檢測(cè)器是偏振側(cè)向散射檢測(cè)器，其被定位來(lái)測(cè)量所激發(fā)血液樣本的90°偏振側(cè)向散射。
3.如權(quán)利要求2所述的血液學(xué)分析儀，其進(jìn)一步包括: 去偏振側(cè)向散射檢測(cè)器,其被定位來(lái)測(cè)量所激發(fā)血液樣本的90°去偏振側(cè)向散射。
4.如權(quán)利要求1所 述的血液學(xué)分析儀，其中所述處理器進(jìn)一步被配置來(lái)預(yù)篩查所接收的測(cè)量結(jié)果以排除對(duì)不滿足所述熒光閾值的任何粒子的考慮。
5.如權(quán)利要求1所述的血液學(xué)分析儀，其中所述軸向光損失檢測(cè)器測(cè)量在0°散射下的軸向光損失。
6.如權(quán)利要求1所述的血液學(xué)分析儀，其中所述中等角度散射檢測(cè)器測(cè)量在約3°至約15°下的光角度散射。
7.如權(quán)利要求1所述的血液學(xué)分析儀，其中所述多個(gè)檢測(cè)器包括一個(gè)或多個(gè)光電倍增管。
8.如權(quán)利要求1所述的血液學(xué)分析儀，其中所述激發(fā)源是激光器。
9.如權(quán)利要求8所述的血液學(xué)分析儀，其中所述激光器被配置來(lái)在對(duì)應(yīng)于所述熒光染料的波長(zhǎng)下發(fā)射光。
10.如權(quán)利要求1所述的血液學(xué)分析儀，其中所述熒光染料被選擇來(lái)與所述激發(fā)源對(duì)應(yīng)。
11.如權(quán)利要求1所述的血液學(xué)分析儀，其進(jìn)一步包括: 孵育子系統(tǒng)，其用于以試劑稀釋所述血液樣本。
12.如權(quán)利要求11所述的血液學(xué)分析儀，其中所述試劑包括所述熒光染料和溶解劑。
13.如權(quán)利要求11所述的血液學(xué)分析儀，其中所述試劑包括(a)至少一種表面活性劑，(b)至少一種緩沖劑或至少一種鹽，(c)至少一種抗微生物劑，以及(d)所述熒光染料。
14.如權(quán)利要求11所述的血液學(xué)分析儀，其中所述孵育子系統(tǒng)被配置來(lái)在小于約25秒的時(shí)期以所述試劑孵育所述血液樣本。
15.如權(quán)利要求11所述的血液學(xué)分析儀，其中所述孵育子系統(tǒng)被配置來(lái)在小于約17秒的時(shí)期以所述試劑孵育所述血液樣本。
16.如權(quán)利要求11所述的血液學(xué)分析儀，其中所述孵育子系統(tǒng)被配置來(lái)在小于約9秒的時(shí)期以所述試劑孵育所述血液樣本。
17.如權(quán)利要求11所述的血液學(xué)分析儀，其中所述孵育子系統(tǒng)被配置來(lái)在范圍從約30°C至約50°C的溫度下以所述試劑孵育所述血液樣本。
18.如權(quán)利要求11所述的血液學(xué)分析儀，其中所述孵育子系統(tǒng)被配置來(lái)在約40°C的溫度下以所述試劑孵育所述血液樣本。
19.一種用自動(dòng)血液學(xué)分析儀進(jìn)行有核紅細(xì)胞nRBC分析的方法，所述方法包括: (a)用試劑稀釋全血的樣本，其中所述試劑包括紅細(xì)胞(RBC)溶解劑和細(xì)胞膜可透性核酸結(jié)合熒光染料； (b)在范圍從約30°C至約50°C的溫度 下在小于約25秒的孵育期孵育步驟(a)的所稀釋血液樣本； (C)將來(lái)自步驟(b)的所孵育樣本遞送至所述血液學(xué)分析儀中的流動(dòng)池； (d)當(dāng)所孵育樣本橫穿過(guò)所述流動(dòng)池時(shí)，用激發(fā)源激發(fā)來(lái)自步驟(C)的所孵育樣本； (e)收集來(lái)自所激發(fā)樣本的多個(gè)光散射信號(hào)和熒光發(fā)射信號(hào)；以及 (f)基于步驟(e)中收集的所有信號(hào)進(jìn)行nRBC分析，同時(shí)基于所述熒光發(fā)射信號(hào)排除對(duì)所稀釋血液樣本內(nèi)不滿足熒光閾值的任何粒子的考慮。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述試劑包括(a)至少一種表面活性劑，(b)至少一種緩沖劑或至少一種鹽，(C)至少一種抗微生物劑，以及(d)至少一種熒光染料。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述激發(fā)源的波長(zhǎng)是約350nm至約700nm。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中通過(guò)帶通濾光片或長(zhǎng)通濾光片在約360nm至約750nm的波長(zhǎng)下收集突光發(fā)射。
23.如權(quán)利要求19所述的方法,其中所述多個(gè)光散射信號(hào)包括:(I)軸向光損失，(2)中等角度散射，以及(3)90°側(cè)向散射。
24.如權(quán)利要求19所述的方法,其中所述多個(gè)光散射信號(hào)包括:(I)軸向光損失，(2)中等角度散射，(3)90°偏振側(cè)向散射，以及(4)90°去偏振側(cè)向散射。
【文檔編號(hào)】G01N33/00GK103975054SQ201280026426
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月4日
【發(fā)明者】吳炯, 馬里歐·科爾曼, 艾米麗·H.·林, 邁克爾·R.·布爾, 賈科莫·瓦卡 申請(qǐng)人:雅培制藥有限公司