用于檢測和定量組織中的靶分子的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及制備用于組織的至少一種標(biāo)準(zhǔn)分子的稀釋范圍的方法，所述方法包括對組織進(jìn)行研磨，向其加入所述標(biāo)準(zhǔn)分子，對得到的混合物進(jìn)行調(diào)制并切片，然后對所述組織的切片進(jìn)行分析。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)范圍來檢測和定量至少一種組織中的至少一種靶分子的方法。
【專利說明】用于檢測和定量組織中的靶分子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于組織的分子的稀釋范圍的制備，以及這樣的稀釋范圍在例如通過質(zhì)譜術(shù)定量所述組織中的所述分子中的應(yīng)用。本發(fā)明的稀釋范圍考慮到了待定量分子在目標(biāo)組織中的特異性行為。更具體來說，本發(fā)明提供了一種方法，其使得能夠通過使用質(zhì)譜成像、尤其是MALDI成像，直接在組織表面上檢測和/或定量靶分子。本發(fā)明還涉及用于驗(yàn)證檢測和/或定量方法的方法，以及用于控制檢測和/或定量方法的質(zhì)量和/或可重復(fù)性的方法。
[0002]總的來說，本發(fā)明適用于其中對組織中的分子進(jìn)行檢測和/或定量是有用/必需的所有領(lǐng)域。例如，本發(fā)明適用于藥學(xué)領(lǐng)域，用于研究藥物在不同生物組織中的分布和藥物動力學(xué)。類似地，本發(fā)明適用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，例如用于在給定時(shí)刻檢測、鑒定和追蹤病理組織中的給定生物標(biāo)志物。本發(fā)明還適用于農(nóng)業(yè)化學(xué)領(lǐng)域，例如用于評估分子例如植物檢疫產(chǎn)品在植物中的毒性和降解。
【背景技術(shù)】
[0003]目前，各種技術(shù)被用于檢測和鑒定樣品、尤其是組織中的分子。例如，質(zhì)譜術(shù)是廣為人知并在化學(xué)和生物化學(xué)分析中用于檢測和鑒定樣品中的目標(biāo)分子的技術(shù)。經(jīng)過一些年，目前，已開發(fā)出使用質(zhì)譜術(shù)的分子成像例如MALDI成像，其使得能夠直接在生物組織的切片上將目標(biāo)分子的分布可視化。MALDI成像，由于其非常高的靈敏度，能夠直接在組織表面上同時(shí)將非常大量的不同分子的分布可視化。在藥學(xué)領(lǐng)域中，這種技術(shù)使得能夠例如比較分子在不同治療時(shí)間時(shí)在不同器官中的分布。
[0004]然而，在需要在時(shí)刻t時(shí)對由此檢測到的分子進(jìn)行定量的情形中，這種成像技術(shù)必須與基于常規(guī)或儀器方法的定量化學(xué)分析相結(jié)合。該第二定量步驟是操作和解譯誤差的來源。此外，它不允許將目標(biāo)分子的存在與其在組織中的定量分布直接相關(guān)聯(lián)。
[0005]此外，取決于進(jìn)行檢測的組織，給定濃度的給定分子不發(fā)出相同強(qiáng)度的信號。類似地，給定組織中濃度相同的兩種不同分子表現(xiàn)出不同的信號強(qiáng)度。
[0006]這種現(xiàn)象可以由對每種分子和每種組織來說特異性的組織消光系數(shù)(TEC)或組織效應(yīng)或甚至離子抑制效應(yīng)的存在來解釋。TEC表示與給定分子在惰性分析支持物上的信號相比，來自于所述分子的信號強(qiáng)度隨著組織和/或其在組織中的位置而變的損失或增益。TEC依賴于許多因素，尤其是組織的性質(zhì)(動物或植物)、化學(xué)環(huán)境、組織是否進(jìn)行化學(xué)處理等。這種TEC的存在使得在分析期間、尤其是在質(zhì)譜術(shù)中，解譯由組織中的分子發(fā)出的信號強(qiáng)度變得困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提出了一種方法，所述方法使得能夠制備用于給定組織的給定分子的稀釋范圍或標(biāo)準(zhǔn)范圍。使用來自于破碎后組織的目標(biāo)組織的重構(gòu)物的切片來制備本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)范圍。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，給定分子在這樣的重構(gòu)組織和相應(yīng)的完整組織中的表現(xiàn)相同。在通過質(zhì)譜術(shù)進(jìn)行分析的情形中，重構(gòu)組織中分子的質(zhì)譜與相應(yīng)的完整組織中同樣濃度的同一分子的質(zhì)譜基本上一致。類似地，在通過熒光進(jìn)行分析的情形中，由重構(gòu)組織中的標(biāo)記分子發(fā)出的熒光信號的強(qiáng)度，與相應(yīng)的完整組織中相同濃度的同一標(biāo)記分子發(fā)出的熒光信號的強(qiáng)度基本上一致。此外，通過將本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)范圍用于給定組織中給定分子的定量分析，不需考慮TEC。在所述組織中所述分子的分析中獲得的信號，可以直接與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)范圍的信號相關(guān)聯(lián)。
[0008]本發(fā)明還提出了用于檢測和/或定量組織中的靶分子的方法，而不論檢測方法是何種方法，尤其是通過電離、放射活性或熒光進(jìn)行檢測。例如，本發(fā)明的方法使用質(zhì)譜術(shù)或質(zhì)譜成像，其允許直接在所述組織的切片上自動獲取與所述分子的質(zhì)譜相關(guān)的信號，以便重構(gòu)所述靶分子在所述組織中的分布和量的圖像。為此，根據(jù)本發(fā)明，使用靶分子或表現(xiàn)出相似物理化學(xué)特征的分子的稀釋范圍，所述稀釋范圍通過使用從與待分析的組織相一致的組織重構(gòu)的組織的切片來產(chǎn)生。然后通過與來自于所述稀釋范圍的結(jié)果進(jìn)行直接比較，可以對所述組織中的分子進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
[0009]本發(fā)明還提出了對使用組織切片檢測和/或定量組織中的靶分子的方法進(jìn)行驗(yàn)證的方法。對于給定組織和給定分子來說，本發(fā)明的驗(yàn)證方法使得能夠不依賴于組織效應(yīng)，檢查在所述組織的切片上直接獲得的所述分子的分析結(jié)果是否代表所述組織。
[0010]本發(fā)明還提出了用于控制使用組織切片檢測和/或定量組織中的靶分子的方法的質(zhì)量和/或可重復(fù)性的方法。這樣的方法使得能夠追蹤實(shí)驗(yàn)可變性和/或?qū)⑵淇紤]在內(nèi)，尤其是通過將為每個(gè)分析獲得的值相對于該質(zhì)量對照進(jìn)行歸一化，以便例如在不同分析之間對目標(biāo)化合物進(jìn)行相對定量。
[0011]因此，本發(fā)明的主題是制備用于組織的至少一種標(biāo)準(zhǔn)分子的稀釋范圍的方法，所述方法包括下列步驟:
[0012]( i )對組織進(jìn)行研磨以獲得組織勻漿物；
[0013](ii)將所述標(biāo)準(zhǔn)分子與來自于步驟(i)的第一組織勻漿物樣品混合，所述標(biāo)準(zhǔn)分子具有第一已知濃度；
[0014](iii)調(diào)制從步驟(ii)獲得的第一組織勻漿物樣品，以便能夠?qū)λ稣{(diào)制過的組織勻漿物樣品進(jìn)行切片；
[0015](iv)使用來自于步驟(i)的至少一個(gè)第二組織勻漿物樣品和與第一濃度不同的第二已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)分子，重復(fù)步驟(ii)和(iii)；
[0016](V)分析從步驟(iii)獲得的每個(gè)調(diào)制過的組織勻漿物樣品的至少一個(gè)切片，以便為所述標(biāo)準(zhǔn)分子的每種濃度，獲得代表所述組織中標(biāo)準(zhǔn)分子的量的信號。
[0017]本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于任何生物組織，不論是動物還是植物?！敖M織” 一般應(yīng)該被理解為是同一來源的細(xì)胞集合，它們聚集在一起成為對同一功能有貢獻(xiàn)的功能性集合體。在某些情形中，組織可以被理解為器官或器官的一部分。
[0018]標(biāo)準(zhǔn)分子可以是肽、多肽、蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、脂類、代謝物、小分子例如藥物等。更通常地，標(biāo)準(zhǔn)分子可以是任何藥學(xué)活性分子、生物學(xué)活性分子或其他活性分子。取決于步驟(V)中必須進(jìn)行的分析，標(biāo)準(zhǔn)分子可以是未標(biāo)記的或標(biāo)記的，尤其是放射性標(biāo)記的或用熒光分子例如GFP (綠色熒光蛋白)標(biāo)記的。
[0019]在研磨步驟(i )中，可以將組織破碎以便形成在一定程度上細(xì)的勻漿物，尤其是液體、半液體、糊狀物等。組織勻漿物可能不是均質(zhì)的，并且可以例如包括不同尺寸的組織碎片。如果需要，可以向獲得的勻漿物添加均質(zhì)化溶液、尤其是水性溶液，以便稀釋所述勻漿物并使其致密性下降?？梢栽谘心ゲ襟E上游、下游或期間添加均質(zhì)化溶液。
[0020]可以通過任何手段、尤其是手動或機(jī)械手段進(jìn)行研磨。例如，通過使用攪拌機(jī)剪切或使用研杵壓碎來獲得組織勻漿物。
[0021]根據(jù)本發(fā)明，在步驟(i)中使用的組織有利地是器官，例如腎、肝等?？梢允褂猛暾鞴倩騼H僅所述器官的一部分來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)范圍而沒有任何差別?？梢詫⒔M織研磨，然后細(xì)分成至少與將要產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)范圍中的稀釋點(diǎn)一樣多的組織勻漿物樣品。也可以在研磨前進(jìn)行所述組織的分割，將每個(gè)樣品單獨(dú)研磨。還可以為標(biāo)準(zhǔn)范圍的每個(gè)稀釋點(diǎn)使用一個(gè)或多個(gè)不同的完整或不完整的器官，每次用于產(chǎn)生同一系列稀釋的器官是相同性質(zhì)和來源的。例如，為了產(chǎn)生大鼠肝中的分子的包含4個(gè)稀釋點(diǎn)或濃度的標(biāo)準(zhǔn)范圍，對于每種濃度使用新的大鼠肝。
[0022]產(chǎn)生至少兩種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)分子制備物。例如，將標(biāo)準(zhǔn)分子以不同的已知濃度在增溶溶液(水性或含有溶劑)中制成懸液。然后向每個(gè)組織勻漿物樣品加入相同量的溶液，其各自具有不同且已知濃度的所述標(biāo)準(zhǔn)分子。在另一個(gè)實(shí)例中，將標(biāo)準(zhǔn)分子在增溶溶液中制成懸液，向每個(gè)組織勻漿物樣品加入不同量的所述溶液，使得從步驟(ii)獲得的每個(gè)組織勻漿物樣品具有不同且已知濃度的所述標(biāo)準(zhǔn)分子。優(yōu)選地，稀釋范圍包含2至10個(gè)稀釋點(diǎn)。
[0023]有利的是，在調(diào)制步驟(iii)之前提供均質(zhì)化步驟，以便獲得標(biāo)準(zhǔn)分子在組織勻漿物樣品中的均勻分布。可以例如使用混合器例如渦旋混合器來完成該均質(zhì)化步驟。
[0024]在實(shí)施方式中，連續(xù)地執(zhí)行步驟(i)、(ii)和視情況而定的均質(zhì)化步驟；顯然，可以同時(shí)地進(jìn)行所有或一部分這些步驟。例如，使用含有標(biāo)準(zhǔn)分子的溶液對組織進(jìn)行研磨。
[0025]調(diào)制步驟(iii)由以下構(gòu)成:對組織勻漿物樣品進(jìn)行處理和/或塑形以使其可以被切割，以便獲得所述勻漿物的至少一個(gè)切片。
[0026]例如，調(diào)制包括將組織勻漿物樣品冷凍的步驟。為此，將組織勻漿物樣品例如置于任何形狀的模具中，然后通過任何適合的技術(shù)將整體冷凍。例如，將所述模具浸沒在液氮中以便引起所有物質(zhì)的即時(shí)冷凍，然后保持在-18°C直至切割步驟。
[0027]在另一個(gè)實(shí)例中，調(diào)制步驟由將所述組織勻漿物樣品包被在尤其是石蠟、樹脂或膠質(zhì)中構(gòu)成。包被應(yīng)該被理解為是指完全包圍組織勻漿物樣品的覆蓋物。包被步驟尤其可以通過使用模具來進(jìn)行。
[0028]顯然，冷凍步驟之后可以是包被步驟。
[0029]調(diào)制的選擇尤其可以取決于組織勻漿物樣品的狀態(tài)。例如，如果從步驟(ii)獲得的組織勻漿物是液體，選擇將組織勻漿物樣品冷凍以允許隨后的切割將是有利的。在勻漿物由粗研磨組織或密實(shí)糊狀物構(gòu)成的情形中，在石蠟等中包被可能足以允許它被切割。
[0030]在一種實(shí)施方式中，可以使用同一模具調(diào)制同一標(biāo)準(zhǔn)范圍的所有或一部分組織勻漿物樣品。在這種情形中，模具包含不同小室，以允許不同樣品之間的物理分隔。有利情況下，劃定小室的隔板是可移除的和/或由可以在與組織勻漿物樣品相同的條件下切割的材料制成。因此，可以從模具的內(nèi)含物產(chǎn)生切片，所述內(nèi)含物各自包含將要產(chǎn)生稀釋范圍的連續(xù)的組織勻漿物樣品。優(yōu)選地，以連續(xù)增加(或降低)的濃度將組織勻漿物樣品布置在連續(xù)的小室中。
[0031 ] 在調(diào)制后，可以在模具中或從模具剝離出，將組織勻漿物樣品無優(yōu)選性地維持在調(diào)制條件例如冷凍條件下，或者保留在確保它們的完整性得以維持的條件下(例如在約+5°C的溫度下)，直至將它們切割和/或用于分析步驟(V)中。
[0032]有利情況下，從步驟(iii)獲得的組織勻漿物樣品表現(xiàn)出與相應(yīng)的完整組織相一致的密度。類似地，有利情況下，從步驟(iii)獲得的組織勻漿物樣品表現(xiàn)出與相應(yīng)的完整組織相一致的組織消光系數(shù)(TEC)。
[0033]“密度”應(yīng)該被理解為是指組織或組織勻漿物樣品的單位體積質(zhì)量。
[0034]“完整組織”應(yīng)該被理解為是指與用于產(chǎn)生組織勻漿物樣品的組織相一致的組織，其保留所述組織的固有品質(zhì)/性質(zhì)。
[0035]分析步驟(V)在之前從調(diào)制過的勻漿物樣品產(chǎn)生的組織勻漿物樣品的切片上進(jìn)行。允許對組織切片進(jìn)行分子分析的任何技術(shù)可用于步驟(V)，例如質(zhì)譜術(shù)、經(jīng)熒光分析、放射自顯影術(shù)等。
[0036]一般來說，切片被理解為是(重構(gòu)或完整的)組織的切片。此外，可以使用與分子分析以及尤其是定量分子分析例如分光光度計(jì)或顯微鏡中的定量分子分析相容的所有切片維度。有利情況下，切片具有2 μ m至50 μ m的厚度，尤其是約20 μ m。厚度被理解為是與切片平面成直角延伸的維度。
[0037]根據(jù)本發(fā)明方法的實(shí)施方式的實(shí)例，在分析步驟之前可以對切片進(jìn)行處理。例如，可以對從以前冷凍或包被的組織勻漿物樣品獲得的切片進(jìn)行干燥。在從以前冷凍的組織勻漿物樣品獲得切片的情形中，可以對所述切片進(jìn)行低溫干燥。例如，在分析步驟之前將切片在-18 °C下放置過夜。
[0038]組織切片可以從仍然冷凍的組織勻漿物樣品或解凍后的所述樣品產(chǎn)生。為了產(chǎn)生給定的稀釋范圍，有利的是對所有組織勻漿物樣品使用相同的調(diào)制和可能的后續(xù)處理。優(yōu)選地，用于產(chǎn)生給定的標(biāo)準(zhǔn)范圍的所有切片具有基本上一致的厚度。
[0039]有利情況下，將組織勻漿物樣品的切片置于支持物例如載片上，這允許將它們導(dǎo)入分光光度計(jì)、顯微鏡等中。優(yōu)選地，對于將要進(jìn)行的分析來說，用于產(chǎn)生給定的標(biāo)準(zhǔn)范圍的所有切片被布置在一致的支持物上。
[0040]一般來說，將相同的分析條件有利地應(yīng)用于同一稀釋范圍的所有組織勻漿物樣品。分析條件應(yīng)該被理解為尤其是指施加于用于分析的裝置的設(shè)置和參數(shù)，以及樣品制備條件，例如可能的洗滌步驟、在通過分光光度法分析的情形中基質(zhì)的沉積等。
[0041]在為一系列組織勻漿物樣品的每個(gè)切片獲得代表分子的量的信號之后，可以產(chǎn)生代表稀釋范圍的校準(zhǔn)曲線。
[0042]例如，在通過質(zhì)譜術(shù)進(jìn)行分析的情形中，為所有稀釋點(diǎn)選擇與靶分子的質(zhì)譜相關(guān)的同一個(gè)信號，來繪制校準(zhǔn)曲線。信號尤其可以是所述質(zhì)譜的峰強(qiáng)度、峰面積或信噪比。
[0043]在通過放射自顯影術(shù)進(jìn)行分析的情形中，使用由例如用碳14放射性標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)分子發(fā)出的放射活性的強(qiáng)度。在通過熒光進(jìn)行分析的情形中，使用由熒光分子標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)分子的光發(fā)射強(qiáng)度。
[0044]在本發(fā)明方法的一種實(shí)施方式中，同時(shí)產(chǎn)生至少兩個(gè)不同的標(biāo)準(zhǔn)范圍。
[0045]例如，在步驟(ii)中向每個(gè)組織勻漿物樣品添加至少兩種不同的標(biāo)準(zhǔn)分子，對每種標(biāo)準(zhǔn)分子進(jìn)行步驟(V)的分析，以便為每種濃度獲得代表組織中每種標(biāo)準(zhǔn)分子的標(biāo)準(zhǔn)分子的量的信號。
[0046]向給定的組織勻漿物樣品添加給定濃度的每種標(biāo)準(zhǔn)分子，所述濃度可以與所述組織勻漿物樣品中的另一種分子的濃度不同。
[0047]本發(fā)明的稀釋范圍可用于計(jì)算在給定的置信度水平下，組織中可以檢測到的標(biāo)準(zhǔn)分子的最小量或LOD (檢測限)。為此，在稀釋范圍內(nèi)鑒定可以在檢測限內(nèi)檢測到的最小信號，即表現(xiàn)出大于或等于3的信噪比值的最小信號。
[0048]類似地，標(biāo)準(zhǔn)范圍可用于計(jì)算在給定的置信度水平下，組織中可以被定量的標(biāo)準(zhǔn)分子的最小量或LOQ (定量限)。該(信噪比)值在國際水平上被固定為必須等于LOD值的三倍(L0Q=3L0D)并且至少等于10。
[0049]本發(fā)明的稀釋范圍也可用于評估切片厚度和/或基質(zhì)性質(zhì)和/或所述基質(zhì)的沉積方式對分子的檢測和/或定量的影響。因此可以根據(jù)組織和/或分子確定最佳的切片厚度和/或最適合的基質(zhì)。
[0050]按照本發(fā)明方法獲得的稀釋范圍也可用于在組織的分析中定量所述組織中的靶分子。
[0051]因此，本發(fā)明的主題是重構(gòu)組織中標(biāo)準(zhǔn)分子的稀釋范圍在定量與所述稀釋范圍的重構(gòu)組織相一致的目標(biāo)組織中的靶分子中的應(yīng)用。
[0052]類似地，本發(fā)明的主題是用于檢測和定量至少一種目標(biāo)組織中的至少一種靶分子的方法，所述方法包括下列步驟:
[0053]a)分析目標(biāo)組織的切片，以便獲得代表所述切片中靶分子的量的信號；
[0054]b)使用與目標(biāo)組織相一致的重構(gòu)組織中標(biāo)準(zhǔn)分子的稀釋范圍，來確定所述組織中革巴分子的量。
[0055]可以通過使用與目標(biāo)組織相一致的組織產(chǎn)生組織勻漿物，按照上面描述的步驟(i )至(V )來獲得所使用的稀釋范圍。
[0056]組織被理解為是至少一種生物組織(植物或動物)的至少一部分。
[0057]在一種實(shí)施方式中，可以對包含生物體內(nèi)的許多組織、尤其是許多相鄰組織的組織樣品中的至少一種靶分子進(jìn)行定量。例如，組織樣品切片可以由完整動物的切片或動物的一部分(包括至少一種器官或至少一個(gè)器官部分)的切片構(gòu)成。尤其是，對完整動物的切片進(jìn)行的分析，可以使得能夠在同一樣品上比較一種或多種靶分子在所述動物的不同組織中的分布。在這種情形中，為了確定組織樣品的每種組織中給定靶分子的量，使用對所考慮的組織來說特異性的所述靶分子的稀釋范圍。
[0058]分析靶分子的步驟a)可以通過任何分析方法來進(jìn)行，例如質(zhì)譜術(shù)以及尤其是通過使用直接質(zhì)譜術(shù)(MS )或串聯(lián)質(zhì)譜術(shù)(MSn、MRM、SRM)、經(jīng)熒光分析、放射自顯影術(shù)等。
[0059]本發(fā)明的方法可以有利地與質(zhì)譜術(shù)一起使用。在這種情形中，可以使用不同的電離源MALDI (基質(zhì)輔助激光解吸電離)、LDI (激光解吸電離)、LESA (液體提取表面分析)、LAESI (激光消融電噴霧電離)、DESI (電噴霧解吸電離)、NanoDESI等，以及不同類型的分析儀TOF (飛行時(shí)間)、Orbitrap、FTICR (傅里葉變換離子回旋共振)等。這種成像技術(shù)使得能夠在為組織樣品獲得的對應(yīng)于靶分子在所述組織樣品中的空間分布的離子密度圖上直接定量靶分子。事實(shí)上，可以將在所述離子密度圖上獲得的信號轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的稀釋范圍。[0060]某些質(zhì)譜技術(shù)例如MALDI或ME-SMS要求將待分析的組織樣品的切片首先用包含在UV中有吸收的有機(jī)小分子的基質(zhì)進(jìn)行覆蓋。這種基質(zhì)允許樣品上存在的分子的解吸和電離。
[0061]不論所選擇的基質(zhì)如何，都可使用本發(fā)明的方法。這些基質(zhì)采取固體形式(在樣品上結(jié)晶)或液體形式，被稱為是離子性或非離子性的?；|(zhì)的選擇根據(jù)待分析的物質(zhì)系列來進(jìn)行。它們往往在溶劑-水性溶液混合物中即時(shí)制備。
[0062]可以使用數(shù)種基質(zhì)沉積方法，尤其是使用移液器手動沉積，這使得可以將準(zhǔn)確體積的基質(zhì)直接沉積在組織上。也可以通過噴霧或氣化來沉積基質(zhì)，使用機(jī)器人或人工將基質(zhì)直接噴霧或氣化在組織樣品上。類似地，可以設(shè)想通過微滴進(jìn)行沉積，由此通過壓電、聲學(xué)或注射泵系統(tǒng)將基質(zhì)以斑點(diǎn)形式施加到組織樣品。還可以通過篩網(wǎng)來沉積基質(zhì)，以便沉積固體形式的基質(zhì)。
[0063]有利情況下，對實(shí)驗(yàn)參數(shù)例如質(zhì)量范圍和/或激光強(qiáng)度進(jìn)行設(shè)置，以便在強(qiáng)度、靈敏度和分辨率方面優(yōu)化靶分子的檢測。
[0064]下一個(gè)步驟是獲取道標(biāo)所述切片中靶分子的量的信號。
[0065]在分析由獲取質(zhì)譜構(gòu)成的情形中，可以使用不同的光譜特征，例如步驟b)中的信號，尤其是質(zhì)譜的峰強(qiáng)度、信噪比(S/N)、峰面積等。顯然，用于定量靶分子的光譜特征與用于制備標(biāo)準(zhǔn)范圍的光譜特征相同。并且，更通常地，被考慮用于定量靶分子的信號特征與用于制備標(biāo)準(zhǔn)范圍的信號特征相同。
[0066]此外，在某些情況下，可以根據(jù)通過所述技術(shù)確定的歸一化因子對一種或多種光譜特征進(jìn)行歸一化。
[0067]例如，在本發(fā)明的方法使用MALDI類型的質(zhì)譜成像的情形中，提供了評估基質(zhì)在樣品上沉積的均勻性的步驟。在實(shí)踐中，與所使用的基質(zhì)相對應(yīng)的信號可以提供關(guān)于所述基質(zhì)的沉積的質(zhì)量/均勻性的信息。然后可以將樣品表面上的基質(zhì)缺陷與所考慮的樣品中未檢測到來自于靶分子的信號或該信號的強(qiáng)度損失相關(guān)聯(lián)。
[0068]可以按照定性判據(jù)，通過使用光學(xué)顯微鏡觀察在樣品表面上沉積的均勻性，和/或按照定量判據(jù)，通過追蹤樣品上信號相對于基質(zhì)本身的變差，來進(jìn)行基質(zhì)均勻性的評估。
[0069]對于定性判據(jù)來說，必需確保基質(zhì)盡可能均勻地沉積在所考慮的表面上，以致沒有不含基質(zhì)的區(qū)域并且它的結(jié)晶是最佳的。
[0070]為了定量評估基質(zhì)沉積的均勻性，基質(zhì)被認(rèn)為是在樣品分析時(shí)，將其信號以與來自于靶分子的信號相同的方式進(jìn)行檢測的特定分子。然后將來自于基質(zhì)分子的信號與其參比信號進(jìn)行比較。在這種情形中，基質(zhì)的參比信號對應(yīng)于在參比基質(zhì)沉積物上、也就是說在樣品上和特異性用于測定基質(zhì)的參比信號的分析支持物上，由基質(zhì)發(fā)出的信號。
[0071]通過這些附加步驟來驗(yàn)證來自于靶分子的信號并將所述信號進(jìn)行歸一化，以將可能影響所述信號的光譜特征的基質(zhì)沉積的質(zhì)量變差考慮在內(nèi)。
[0072]在希望追蹤靶分子的存在隨時(shí)間、能夠在不同樣品之間變化的基質(zhì)沉積的質(zhì)量而變化的趨勢的情形中，這種將基質(zhì)效應(yīng)包含在內(nèi)的做法可能是特別有利的。
[0073]可以使用與靶分子相一致的標(biāo)準(zhǔn)分子來產(chǎn)生所使用的標(biāo)準(zhǔn)范圍。也可以使用與靶分子不同并具有相似的物理化學(xué)性質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)分子。還可以使用同位素標(biāo)記的靶分子作為制備稀釋范圍的標(biāo)準(zhǔn)分子。[0074]取決于所使用的分析方法，靶分子可以被標(biāo)記。例如，在熒光分析的情形中，用熒光分子標(biāo)記靶分子。類似地，在通過放射自顯影術(shù)進(jìn)行分析的情形中，靶分子被放射性標(biāo)記。
[0075]本發(fā)明的方法可用于分析所有類型的分子，例如肽、多肽、蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、脂類、代謝物等，并且總的來說用于分析任何藥學(xué)活性分子或其他活性分子，尤其是在通過質(zhì)譜術(shù)進(jìn)行分析的情形中，用于分析任何可以被離子化的分子。
[0076]在靶分子是高分子量蛋白質(zhì)的情形中，可以對靶分子進(jìn)行酶解預(yù)處理，以便將其分裂成許多肽。然后對從所述酶解消化獲得的代表所述蛋白質(zhì)的至少一種肽進(jìn)行檢測和定量。例如，可以使用胰蛋白酶，以便將靶蛋白分裂成許多以前鑒定過的肽。
[0077]類似地，可以在檢測步驟之前用至少一種溶劑和/或至少一種去污劑處理待分析的組織，以便消除造成背景噪音的分子。例如，在氯仿中洗滌使得可以去除某些類型的脂類。在乙醇中洗滌，就其本身而言，允許更好地檢測低質(zhì)量分子。有利情況下，這兩種洗滌使得可以去除某些分子、尤其是脂質(zhì)分子，從而有利于直接在組織樣品上檢測新的離子。
[0078]本發(fā)明的方法也可用于同時(shí)或不同時(shí)地對同一組織和/或包含許多組織的同一組織樣品上的至少兩種不同的靶分子進(jìn)行定量。于是使用不同的稀釋范圍，每種稀釋范圍對所考慮的靶分子和所考慮的組織而言是特異性的。
[0079]類似地，通過用質(zhì)譜術(shù)進(jìn)行分析，可以在不同組織或包含許多組織的組織樣品上同時(shí)檢測和定量同一靶分子。在這樣的情形中，對于每種樣品組織例如完整動物切片中的器官來說，使用在相應(yīng)組織/器官中為所述靶分子產(chǎn)生的稀釋范圍。
[0080]本發(fā)明還提出了用于從組織切片檢測和/或定量所述組織中的至少一種靶分子的方法的驗(yàn)證方法，所述驗(yàn)證方法包括下列步驟:
[0081](x)對與必須應(yīng)用檢測和/或定量方法的組織相一致的組織進(jìn)行研磨，以獲得組織勻漿物；
[0082](xi)將標(biāo)準(zhǔn)分子與來自于步驟(X)的至少兩個(gè)組織勻漿物樣品混合，對于所述至少兩個(gè)組織勻漿物樣品來說，所述標(biāo)準(zhǔn)分子具有相同的已知濃度；
[0083](xii)調(diào)制從步驟(xi)獲得的組織勻漿物樣品，以便能夠?qū)λ稣{(diào)制過的組織勻漿物樣品進(jìn)行切片；
[0084](xiii)分析從步驟(xii)獲得的每個(gè)調(diào)制過的組織勻漿物樣品的至少一個(gè)切片，以便為每個(gè)切片獲得代表所述標(biāo)準(zhǔn)分子的信號；
[0085](xiv)將為每個(gè)切片獲得的信號進(jìn)行相互比較。
[0086]這樣的方法使得能夠尤其是在檢測和/或定量方法的上游，檢查給定的重構(gòu)組織、也就是說調(diào)制過的組織勻漿物是否代表相應(yīng)的完整組織。這種方法使得能夠尤其是利用LOD來評估本發(fā)明的檢測和/或定量方法對給定分子和給定樣品的靈敏度。
[0087]有利情況下，在至少三個(gè)組織勻漿物樣品上進(jìn)行步驟(xi)。
[0088]有利情況下，步驟(xiv)中進(jìn)行的信號比較使得可以通過計(jì)算以小數(shù)值和百分率給出的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD來評估給定組織中給定分子的檢測和/或定量的可重復(fù)性。
[0089]顯然，如上為制備稀釋范圍所解釋的產(chǎn)生組織勻漿物、調(diào)制、制備標(biāo)準(zhǔn)分子、分析等的所有具體方式，如組織和/或標(biāo)準(zhǔn)分子的性質(zhì)，均可以適用于驗(yàn)證方法的實(shí)施。
[0090]本發(fā)明還提出了從目標(biāo)組織的切片檢測和/或定量所述組織中的至少一種靶分子的方法的質(zhì)量和/或可重復(fù)性的控制方法，所述控制方法包括下列步驟:
[0091](XX)對與所述目標(biāo)組織相一致的組織進(jìn)行研磨，以獲得組織勻漿物；
[0092](xxi)將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)分子與來自于步驟(XX)的組織勻漿物樣品混合；
[0093](xxii)調(diào)制從步驟(xxi)獲得的組織勻漿物樣品，以便能夠?qū)λ稣{(diào)制過的組織勻漿物樣品進(jìn)行切片；
[0094](xxiii)對于待分析的目標(biāo)組織的每個(gè)切片，對來自于步驟(xxii)的調(diào)制過的組織勻漿物樣品的切片同時(shí)進(jìn)行分析，以便每次獲得代表來自于步驟(xxii)的調(diào)制過的組織勻漿物樣品的切片中的標(biāo)準(zhǔn)分子的信號和代表所述目標(biāo)組織中的靶分子的信號；
[0095](xxiv)比較為來自于步驟(xxii)的調(diào)制過的組織勻漿物樣品的每個(gè)切片獲得的信號。
[0096]因此，根據(jù)本發(fā)明，含有一種或多種化合物的摻雜組織(尤其是器官、血液、血漿、血清、尿液、植物組織等)的切片，可用作在檢測和/或定量研究的情形中執(zhí)行的每種分析的質(zhì)量對照，和/或用于監(jiān)測分析儀器的性能。
[0097]目標(biāo)組織應(yīng)該被理解為是將要進(jìn)行檢測和/或定量的組織。
[0098]有利情況下，步驟(xxiii)通過將待分析的目標(biāo)組織切片和摻雜/調(diào)制的組織勻漿物樣品的切片沉積在同一個(gè)支持物上，尤其是在同一個(gè)載片上來進(jìn)行。因此，相同的支持物制備條件(例如所使用的基質(zhì)、基質(zhì)的沉積質(zhì)量)和分析條件適用于兩個(gè)切片。
[0099]可以例如使用相應(yīng)的加權(quán)平均值對步驟(xxiv)中獲得的信號的變差進(jìn)行歸一化，以將參數(shù)例如基質(zhì)效應(yīng)的變差考慮在內(nèi)。
[0100]這樣的方法可用于例如通過將來自于一個(gè)切片與來自于另一個(gè)切片的信號進(jìn)行簡單比較來進(jìn)行分子的相對定量，用于及時(shí)監(jiān)測分子的的生物可利用性趨勢等。
[0101]因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提出用于對目標(biāo)組織中的至少一種靶分子進(jìn)行相對定量的方法，所述方法包括下列步驟:
[0102](xxx)對與所述目標(biāo)組織相一致的組織進(jìn)行研磨，以獲得組織勻漿物；
[0103](xxxi)將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)分子與來自于步驟(xxx)的組織勻漿物樣品混合；
[0104](xxxii)對從步驟(xxxi)獲得的組織勻漿物樣品進(jìn)行調(diào)制，以便能夠?qū)λ稣{(diào)制過的組織勻漿物樣品進(jìn)行切片；
[0105](xxxiii)對于待分析的目標(biāo)組織的每個(gè)切片,對來自于步驟(xxxii)的調(diào)制過的組織勻漿物樣品的切片同時(shí)進(jìn)行分析，以便每次獲得代表來自于步驟(xxxii)的調(diào)制過的組織勻漿物樣品的切片中的標(biāo)準(zhǔn)分子的信號和代表所述目標(biāo)組織中的靶分子的信號；
[0106](xxxiv)對于待分析的目標(biāo)組織的每個(gè)切片，計(jì)算來自于所述目標(biāo)組織中的靶分子的信號與來自于重構(gòu)組織中的標(biāo)準(zhǔn)分子的信號的比率；
[0107](xxxv)比較為所述目標(biāo)組織的每個(gè)切片獲得的比率，以獲得所述靶分子的相對定量。
[0108]顯然，如上為制備稀釋范圍制備所解釋的產(chǎn)生組織勻漿物、調(diào)制、制備標(biāo)準(zhǔn)分子、分析等的所有具體方式，如組織和/或標(biāo)準(zhǔn)分子的性質(zhì)，均可以適用于實(shí)施本發(fā)明的控制質(zhì)量和/或可重復(fù)性的方法、相對或絕對定量方法以及本發(fā)明的用于評估組織中可以檢測到的和/或組織中可以被定量的靶分子的最小量的方法。
[0109]根據(jù)本發(fā)明，出于定量的目的，可以利用合并有所有或一部分這些因素的計(jì)算機(jī)程序來進(jìn)行源數(shù)據(jù)的歸一化，即，來自于組織中靶分子的信號與來自于一致的重構(gòu)組織中標(biāo)準(zhǔn)分子的稀釋范圍的相應(yīng)濃度之間的關(guān)聯(lián)性。
[0110]有利情況下，在通過質(zhì)譜術(shù)進(jìn)行成像的情形中，在處理圖像時(shí)，該計(jì)算機(jī)程序或數(shù)據(jù)重新處理軟件可以通過基質(zhì)效應(yīng)或通過標(biāo)準(zhǔn)品(同位素或非同位素的)對這些值進(jìn)行加權(quán)。
[0111]有利情況下，本發(fā)明的計(jì)算機(jī)程序可以將目標(biāo)組織上靶分子的強(qiáng)度與重構(gòu)組織上標(biāo)準(zhǔn)分子的強(qiáng)度進(jìn)行比較以便獲得比率，使得能夠通過比較為它們各自獲得的比率，來進(jìn)行不同組織之間目標(biāo)化合物的相對定量。
[0112]因此，本發(fā)明的另一個(gè)主題是一種計(jì)算機(jī)可讀數(shù)據(jù)介質(zhì)，其包含能夠被計(jì)算機(jī)執(zhí)行的指令，例如讀取從質(zhì)譜術(shù)分析獲得的原始數(shù)據(jù)，和/或確定校準(zhǔn)曲線，和/或通過后者對所述原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化以便獲得靶分子的定量值。有利情況下，這些能夠被計(jì)算機(jī)執(zhí)行的指令適合于使計(jì)算機(jī)系統(tǒng)至少執(zhí)行本發(fā)明的定量方法的步驟b)和/或用于控制檢測/定量方法的質(zhì)量/可重復(fù)性的方法的步驟(xxiv)，以及視情況而定使用步驟(xxiv)的結(jié)果進(jìn)行的加權(quán)步驟，如本發(fā)明的相對定量方法的步驟(xxxiv)和/或步驟(XXXV)。
[0113]有利情況下，數(shù)據(jù)介質(zhì)包含至少兩種不同組織中至少一種靶分子的至少一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)范圍。優(yōu)選地，在生物樣品例如完整動物的切片的情形中，數(shù)據(jù)庫包含所述樣品的不同組織中至少一種靶分子的稀釋范圍。
[0114]數(shù)據(jù)介質(zhì)還可以包含質(zhì)譜成像中使用的至少一種基質(zhì)的參比信號的數(shù)據(jù)庫。因此，當(dāng)通過成像執(zhí)行數(shù)據(jù)介質(zhì)來分析樣品時(shí)，可以將基質(zhì)效應(yīng)考慮在內(nèi)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0115]圖1A和1B。具有多個(gè)區(qū)室的模具的實(shí)施方式的示意圖(圖1A)，所述模具可以在執(zhí)行本發(fā)明的制備稀釋范圍的方法時(shí)使用，每個(gè)區(qū)室能夠接收摻雜有特定濃度的標(biāo)準(zhǔn)分子的組織勻漿物樣品；以及調(diào)制過并在模具中冷凍后從模具剝離出的組織勻漿物樣品的示意圖(圖1B)，每個(gè)組織勻漿物樣品通過隔板與相鄰的樣品隔開。
[0116]圖2:按照本發(fā)明的制備方法獲得的組織(腎)中標(biāo)準(zhǔn)分子(普萘洛爾)的校準(zhǔn)曲線，其代表普萘洛爾的濃度(μ g/g - X軸)隨質(zhì)譜術(shù)中由普萘洛爾發(fā)出的強(qiáng)度(y軸)的變化。
[0117]圖3:—條加權(quán)的直線，其示出了使用重構(gòu)并摻雜有同一濃度的普萘洛爾的腎組織類型的質(zhì)量對照測量到的MSI的分析可變性。
實(shí)施例
[0118]設(shè)備和方法
[0119]設(shè)各
[0120]使用來自于Sigma-Aldrich的普萘洛爾來產(chǎn)生1.10_1(lmOl/μ I的普萘洛爾溶液。
[0121]精確量取6份不同子體積的該溶液，將其各自添加到組織勻漿物樣品中，以便在樣品中獲得 0,2.8,5.6,11.2,22.4 和 44.8 μ g/g 的濃度(表 I)。
[0122]組織勻漿物樣品
[0123]使用來自于Charles River (法國)的體重為25_40g的雄性Swiss類型的小鼠。
[0124]為了制備稀釋范圍，從對照小鼠(也就是說沒有經(jīng)歷任何特定治療)取出兩個(gè)腎臟。使用解剖刀將兩個(gè)腎臟在事先滅菌并置于冰上的容器中進(jìn)行機(jī)械研磨。在獲得腎臟勻漿物后，將所述勻漿物大致分配在6個(gè)1.5ml管中，并對6個(gè)組織勻漿物樣品中的每個(gè)進(jìn)行稱重(表1)。
[0125]向每個(gè)組織勻漿物樣品加入特定子體積的普萘洛爾溶液之一。
[0126]下面的表1給出了 6個(gè)腎臟勻漿物樣品的所有具體數(shù)據(jù)。
[0127]表1:制備用于產(chǎn)生代表腎臟中的普萘洛爾的稀釋范圍的腎臟勻漿物樣品。
【權(quán)利要求】
1.用于定量至少一種組織中的至少一種靶分子的方法，所述方法包括下列步驟: a)分析組織切片，以便獲得代表所述切片中靶分子的量的信號； b)使用用于所述組織的標(biāo)準(zhǔn)分子的稀釋范圍來確定所述組織中靶分子的量，所述稀釋范圍按照下列步驟獲得: (i)對與必須應(yīng)用檢測和定量方法的組織相一致的組織進(jìn)行研磨，以獲得組織勻漿物； (ii)將所述標(biāo)準(zhǔn)分子與來自于步驟(i)的第一組織勻漿物樣品混合，所述標(biāo)準(zhǔn)分子具有第一已知濃度； (iii)調(diào)制從步驟(ii)獲得的第一組織勻漿物樣品，以便能夠?qū)λ鼋M織勻漿物樣品進(jìn)行切片； (iv)使用來自于步驟(i)的至少一個(gè)第二組織勻漿物樣品和與第一濃度不同的第二已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)分子，重復(fù)步驟(i i )和(i i i ); (V)分析從步驟(iii)獲得的每個(gè)調(diào)制過的組織勻漿物樣品的至少一個(gè)切片，以便為所述樣品分子的每種濃度，獲得代表所述組織中標(biāo)準(zhǔn)分子的量的信號。
2.權(quán)利要求1的定量方法，其中調(diào)制組織勻漿物樣品的步驟(iii)，由對所述組織勻漿物樣品進(jìn)行冷凍和/或包被構(gòu)成。
3.權(quán)利要求1和2之一的定量方法，其中分析步驟(V)由經(jīng)質(zhì)譜術(shù)分析或經(jīng)熒光分析或經(jīng)放射自顯影術(shù)分析構(gòu)成。
4.權(quán)利要求1至3之一的定量方法，其還包括下面的步驟: (vi)在調(diào)制步驟(iii)之前，對來自于步驟(ii)的組織勻漿物樣品和標(biāo)準(zhǔn)分子進(jìn)行均質(zhì)化。
5.權(quán)利要求1至5之一的定量方法，其中從步驟(iii)獲得的組織勻漿物樣品表現(xiàn)出與相應(yīng)的完整組織相一致的密度和/或組織消光系數(shù)。
6.前述權(quán)利要求之一的定量方法，其中對所述組織中至少兩種不同的靶分子同時(shí)進(jìn)行檢測和定量，對于制備標(biāo)準(zhǔn)范圍的步驟(ii)來說，使用至少兩種不同的標(biāo)準(zhǔn)分子產(chǎn)生每種靶分子的標(biāo)準(zhǔn)范圍，所述至少兩種不同的標(biāo)準(zhǔn)分子添加到每個(gè)組織勻漿物樣品中；對每種標(biāo)準(zhǔn)分子進(jìn)行步驟(V)的分析，以便為每種濃度獲得代表所述組織中每種標(biāo)準(zhǔn)分子的量的信號；并且對于每種靶分子，使用相應(yīng)的稀釋范圍來進(jìn)行確定靶分子的量的步驟b)。
7.前述權(quán)利要求之一的定量方法，其中對至少兩種不同組織進(jìn)行分析，對每種組織進(jìn)行制備標(biāo)準(zhǔn)范圍的步驟(i)至(V)，以便為每種組織獲得代表所述標(biāo)準(zhǔn)分子的信號，對于每種組織，使用相應(yīng)的稀釋范圍進(jìn)行確定靶分子的量的步驟b)。
8.前述權(quán)利要求之一的定量方法，其中所述靶分子是蛋白質(zhì)、肽、多肽、氨基酸、核酸、脂類、藥物、藥學(xué)活性分子或生物活性分子或代謝物。
9.前述權(quán)利要求之一的定量方法，其中被分析的組織是動物生物組織或植物生物組織。
10.前述權(quán)利要求之一的定量方法，其中步驟a)由經(jīng)質(zhì)譜術(shù)分析構(gòu)成，與所述靶分子的質(zhì)譜相關(guān)的信號對應(yīng)于所述質(zhì)譜的峰強(qiáng)度、峰面積或信噪比。
11.前述權(quán)利要求之一的定量方法，其中用于制備所述稀釋范圍的標(biāo)準(zhǔn)分子對應(yīng)于所述靶分子。
12.前述權(quán)利要求之一的定量方法，其中使用質(zhì)譜成像，來自于所述靶分子的信號強(qiáng)度能夠同時(shí)使述靶分子在所述組織切片中的分布和濃度可視化。
13.前述權(quán)利要求之一的定量方法，其中在完整動物的切片上直接檢測和定量所述靶分子，以便利用每種組織特異性的稀釋范圍同時(shí)比較所述靶分子在所述動物的不同組織中的分布。
14.用于從組織切片檢測和/或定量所述組織中的至少一種靶分子的方法的驗(yàn)證方法，所述驗(yàn)證方法包括下列步驟: (x)對與必須應(yīng)用檢測和/或定量方法的組織相一致的組織進(jìn)行研磨，以獲得組織勻漿物； (xi)將標(biāo)準(zhǔn)分子與來自于步驟(X)的至少兩個(gè)組織勻漿物樣品混合，對于所述至少兩個(gè)組織勻漿物樣品來說，所述標(biāo)準(zhǔn)分子具有相同的已知濃度； (xii)調(diào)制從步驟(xi)獲得的組織勻漿物樣品，以便能夠?qū)λ鼋M織勻漿物樣品進(jìn)行切片； (xiii)分析從步驟(xii)獲得的每個(gè)組織勻漿物樣品的至少一個(gè)切片，以便為每個(gè)切片獲得代表所述組織中的標(biāo)準(zhǔn)分子的信號； (xiv)將從每個(gè)切片獲得的信號進(jìn)行相互比較。
15.用于評估組織 中可以檢測到的靶分子的最小量的方法，通過所述方法，從按照下列步驟獲得的所述靶分子的特異性稀釋范圍和所述組織，鑒定到表現(xiàn)出大于或等于3的信噪比值的可以檢測到的最小信號: (i)對組織進(jìn)行研磨，該組織與將要評估可以檢測到最小量靶分子的組織相一致，以獲得組織勻漿物； (?)將標(biāo)準(zhǔn)分子與來自于步驟(i)的第一組織勻漿物樣品混合，所述標(biāo)準(zhǔn)分子具有第一已知濃度； (iii)調(diào)制從步驟(ii)獲得的第一組織勻漿物樣品，以便能夠?qū)λ鼋M織勻漿物樣品進(jìn)行切片； (iv)使用來自于步驟(i)的至少一個(gè)第二組織勻漿物樣品和與第一濃度不同的第二已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)分子，重復(fù)步驟(i i )和(i i i ); (V)分析從步驟(iii)獲得的每個(gè)調(diào)制過的組織勻漿物樣品的至少一個(gè)切片，以便為所述標(biāo)準(zhǔn)分子的每種濃度，獲得代表所述組織中標(biāo)準(zhǔn)分子的量的信號。
16.用于評估組織中可以被定量的靶分子的最小量的方法，通過所述方法，從按照下列步驟獲得的所述靶分子的特異性稀釋范圍和所述組織，鑒定到表現(xiàn)出大于或等于最小可檢測信號的信噪比值的3倍的信噪比值的最小信號: (i)對組織進(jìn)行研磨，該組織與將要評估可以被定量最小量靶分子的組織相一致，以獲得組織勻漿物； (ii)將標(biāo)準(zhǔn)分子與來自于步驟(i)的第一組織勻漿物樣品混合，所述標(biāo)準(zhǔn)分子具有第一已知濃度； (iii)調(diào)制從步驟(ii)獲得的第一組織勻漿物樣品，以便能夠?qū)λ鼋M織勻漿物樣品進(jìn)行切片； (iv)使用來自于步驟(i)的至少一個(gè)第二組織勻漿物樣品和與第一濃度不同的第二已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)分子，重復(fù)步驟(i i)和(i i i); (V)分析從步驟(iii)獲得的每個(gè)調(diào)制過的組織勻漿物樣品的至少一個(gè)切片，以便為所述標(biāo)準(zhǔn)分子的每種濃度，獲得代表所述組織中標(biāo)準(zhǔn)分子的量的信號。
17.用于從目標(biāo)組織的切片檢測和/或定量所述組織中的至少一種靶分子的方法的質(zhì)量和/或可重復(fù)性的控制方法，所述控制方法包括下列步驟: (XX)對與所述目標(biāo)組織相一致的組織進(jìn)行研磨，以獲得組織勻漿物； (XXi)將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)分子與來自于步驟(XX)的組織勻漿物樣品混合； (xxii)調(diào)制從步驟(xxi)獲得的組織勻漿物樣品，以便能夠?qū)λ稣{(diào)制過的組織勻漿物樣品進(jìn)行切片； (xxiii)對于待分析的目標(biāo)組織的每個(gè)切片，對來自于步驟(xxii)的調(diào)制過的組織勻漿物樣品的切片同時(shí)進(jìn)行分析，以便每次獲得代表來自于步驟(xxii)的調(diào)制過的組織勻漿物樣品的切片中的標(biāo)準(zhǔn)分子的信號和代表所述目標(biāo)組織中的靶分子的信號； (xxiv)對由來自于步驟(xxii)的調(diào)制過的組織勻漿物樣品的每個(gè)切片獲得的信號進(jìn)行比較。
18.用于對目標(biāo)組織中的至少一種靶分子進(jìn)行相對定量的方法，所述方法包括下列步驟: (XXX)對與所述目標(biāo)組織相一致的組織進(jìn)行研磨，以獲得組織勻漿物； (XXXi)將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)分子與來自于步驟(XXX)的組織勻漿物樣品混合； (XXXii)對從步驟(XXXi)獲得的`組織勻漿物樣品進(jìn)行調(diào)制，以便能夠?qū)λ稣{(diào)制過的組織勻漿物樣品進(jìn)行切片； (xxxiii )對于待分析的目標(biāo)組織的每個(gè)切片，對來自于步驟(xxxii )的調(diào)制過的組織勻漿物樣品的切片同時(shí)進(jìn)行分析，以便每次獲得代表來自于步驟(xxxii)的調(diào)制過的組織勻漿物樣品的切片中的標(biāo)準(zhǔn)分子的信號和代表所述目標(biāo)組織中的靶分子的信號； (xxxiv)對于待分析的目標(biāo)組織的每個(gè)切片，計(jì)算來自于所述目標(biāo)組織中的靶分子的信號與來自于重構(gòu)組織中的標(biāo)準(zhǔn)分子的信號的比率； (XXXV)對由所述目標(biāo)組織的每個(gè)切片獲得的比率進(jìn)行比較，以獲得所述靶分子的相對定量。
19.計(jì)算機(jī)可讀數(shù)據(jù)介質(zhì)，其包含能夠被計(jì)算機(jī)執(zhí)行的指令，所述指令適合于使計(jì)算機(jī)系統(tǒng)執(zhí)行權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)的方法的步驟b)和/或權(quán)利要求17的步驟(xxiv)和/或權(quán)利要求18的步驟(xxxiv)和/或步驟(XXXV)。
20.權(quán)利要求18的計(jì)算機(jī)可讀數(shù)據(jù)介質(zhì)，其包含用于至少兩種不同組織的至少一種標(biāo)準(zhǔn)分子的稀釋范圍的數(shù)據(jù)庫。
21.權(quán)利要求18或19的計(jì)算機(jī)可讀數(shù)據(jù)介質(zhì)，其包含質(zhì)譜成像中使用的至少一種基質(zhì)的參比信號的數(shù)據(jù)庫。
【文檔編號】G01N1/28GK103688151SQ201280026907
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月31日
【發(fā)明者】喬納森·斯陶貝爾, 大衛(wèi)·博內(nèi)爾 申請人:Ima生物科技公司