狼瘡抗凝物檢測用血液凝固時間的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種血液凝固時間的測定方法，其即使對于華法林服用者、維生素K缺乏者或者肝功能不全患者的血液試樣，也不受到血液凝固因子缺乏的影響，與ISTH的推薦法相比，能夠容易且敏感度良好地進行LA檢測。一種狼瘡抗凝物檢測用血液凝固時間的測定方法，其特征在于，在血液凝固時間的測定前或者測定時，向血液試樣中添加含有血液凝固因子的緩沖液組合物來測定血液凝固時間。
【專利說明】狼瘡抗凝物檢測用血液凝固時間的測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種以檢測狼瘡抗凝物為目的，測定被檢血液試樣的血液凝固時間的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]血液凝固時間測定是測定從將由血液凝固因子的活化劑(以下，有時也簡稱為活化劑)和/或Ca2+等構(gòu)成的血液凝固時間測定用試劑添加于樣品血液或樣品血液混合物的時刻，到形成可檢測的纖維蛋白凝塊為止的時間(血液凝固時間:以下，有時也簡稱為凝血時間。另外，有時也將纖維蛋白凝塊的形成簡稱為凝固)，是為了篩選血液凝固體系異常的有無，或者測定各個血液凝固因子的活性而實施的。作為典型的例子，有凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間等的血液凝固試驗。以下，在本說明書中，有時也將血液凝固因子簡稱為凝血因子。
[0003]PT是從向被檢血漿中添加組織凝血活酶和Ca2+的混合液到凝固為止的時間，是綜合性地檢查與外源性凝血機制有關(guān)的第VII因子、第X因子、第V因子、凝血酶原、纖維蛋白原等的凝血活性的時間。另外，APTT是從向被檢血漿中添加足夠量的磷脂以及活化劑(高嶺土、無水硅酸、鞣花酸等)和適量的Ca2+到凝固為止的時間，是綜合性地檢查與內(nèi)源性凝血機制有關(guān)的第XII因子、第XI因子、前激肽釋放酶、高分子激肽原、第IX因子、第VIII因子、第X因子、第V因子、凝血酶原、纖維蛋白原等的凝血活性的時間。通常，這些血液凝固試驗中的異常是指凝血時間延長。血液凝固體系的異常反映生物體內(nèi)的出血趨勢或者血栓趨勢(血液凝固趨勢)的先兆或結(jié)果。
[0004]作為該凝血時間的延長原因，認(rèn)為是:1)血液凝固因子的缺乏或者降低；2)存在針對構(gòu)成血液凝固體系的血液成分的抗體；3 )存在針對血液凝固時間測定用試劑中的成分的抗體；4 )存在針對構(gòu)成血液凝固體系的血液成分與血液凝固時間測定用試劑中的成分的復(fù)合體的抗體；5)阻礙血液凝固反應(yīng)的藥劑的給藥等。
[0005]但是，僅進行血液凝固時間的測定時，無法鑒別凝血時間的延長原因是例如單純由于凝血因子缺乏而引起的血液凝固活性的降低，還是針對構(gòu)成血液凝固體系的成分或者血液凝固時間測定用試劑中的成分等的抗體(抑制因子)阻礙凝血反應(yīng)而引起的血液凝固活性的降低等。另一方面，因該延長原因的不同，導(dǎo)致治療方針不同，所以該延長原因的鑒別是重要的。因此，為了鑒別該延長原因，進行血液凝固補正試驗(以下，有時也稱為“混合試驗”或“Mixing text”)，S卩，向被檢血漿中添加正常血漿，將其血液凝固時間被補正(正常化)的程度制圖并進行判定(非專利文獻I)。
[0006]以往，混合試驗例如如下實施。
[0007]準(zhǔn)備相對于被檢血漿，以正常血漿的混合比例成為0%、20%、50%、80%、100%的方式添加、混合正常血漿而制備得到的試樣，進行APTT的測定。將其結(jié)果制成圖(橫軸:混合后的正常血漿的比例或者被檢血漿的比例(％)，縱軸:凝血時間(秒))，根據(jù)該圖的形狀目視鑒另O、判定凝血時間的延長原因。例如，被檢血漿缺乏凝血因子時，少量添加正常血漿(在圖1(A)為20%)時，使凝血時間大幅度縮短，接近于測定正常血漿100%時的值，因此顯示出與連接被檢血漿100%與正常血漿100%的點的直線(虛線)相比向下凸出的曲線(圖1 (A))。
[0008]被檢血漿中存在凝血因子抑制因子時，即使提高正常血漿的添加比例，該凝血因子抑制因子也使添加的正常血漿中的凝血因子失活，所以由添加正常血漿產(chǎn)生的凝血時間的改善程度小，顯示向上凸出的曲線(圖1 (B))。
[0009]作為影響血液凝固時間測定用試劑的感受性的凝血因子抑制因子，已知有狼瘡抗凝物(以下，LA)。LA被定義為一種不阻礙每個凝血因子活性地阻礙體外的磷脂依賴性凝血反應(yīng)的免疫球蛋白，而并非單一的抗體。由于凝血反應(yīng)中必須存在磷脂，所以通常很多血液凝固時間測定用試劑中含有豐富的磷脂。LA與該試劑中的磷脂反應(yīng)，將其消耗，結(jié)果阻礙凝血反應(yīng)而使凝血時間延長，所以經(jīng)常發(fā)現(xiàn)像PT、APTT這樣的凝血檢查的結(jié)果異常。但是，LA因磷脂的種類(來源、磷脂的組成等)不同而反應(yīng)強度不同，所以根據(jù)所使用的血液凝固時間測定用試劑，LA陽性.陰性的判定結(jié)果也不同。
[0010]非專利文獻1:檢查與技術(shù)，Vol.34，n0.8，2006年8月，p735_742
[0011]非專利文獻 2:Update of the guidelines for lupus anticoagulantdetection,Journal of Thrombosis and Haemostasis, 7:ppl737_1740，2009

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]作為抗凝血療法，緊急時，使用有速效性且可靜脈內(nèi)給藥的肝素，通過長期給藥來預(yù)防時，使用作為口服抗凝血藥的華法林。其中，已知華法林通過對生物體內(nèi)的維生素K的作用進行拮抗，從而抑制血液凝固因子中的第II因子(凝血酶原)、第VII因子、第IX因子、第X因子在肝臟中的生物合成。因此，對于華法林服用者、維生素K缺乏者、或者肝功能不全患者(肝硬化、暴發(fā)型肝炎、或者慢性肝炎患者等)而言，在基于以往的混合試驗的血液凝固時間的延長原因的確認(rèn)方法中，不明確是由于LA等抗磷脂抗體引起的凝血時間的延長，還是由于基于華法林的作用、維生素K的缺乏、或者肝功能不全的血液凝固因子的缺乏而引起的凝血時間的延長，難以鑒別原因。該問題在接受華法林給藥進而為LA陽性的情況下更為深刻。這是因為確認(rèn)或者懷疑LA陽性并開始抗凝血療法時，LA的檢測和其消長的監(jiān)視、追蹤是重要的，但無法正確地進行。
[0013]國際血栓止血學(xué)會(ISTH)推薦，在進行LA檢測時，為了補充不足的凝血因子，向被檢血漿中混合等量的健康者血漿后進行測定。此處，對于所使用的健康者血漿，進行二次離心處理，以使血小板數(shù)低于107/mL，且各家自行制備所有血液凝固因子的活性幾乎為100%的血漿而使用(非專利文獻2)。但是，血液凝固因子中，還有活性非常不穩(wěn)定且容易失活的血液凝固因子，所以將所有血液凝固因子的活性幾乎100%地保持地制備健康者血漿是非常困難的，存在不容易穩(wěn)定獲得的問題。另外，在健康者血漿的制備中，雖然儲留(存積)、混合的人數(shù)越多，越能夠使凝血因子活性的每個人的波動平均化，但因設(shè)備而導(dǎo)致無法確保健康者的人數(shù)，血漿提供者出現(xiàn)偏差，所以還存在批次間的品質(zhì)產(chǎn)生差別的問題。進而，使用健康者血漿的方法不僅會稀釋被檢血漿中的LA，有時也會添加健康者血漿中所含的妨礙LA測定的物質(zhì)(來自磷脂、血小板的膜破碎物等)，特別是LA呈弱陽性時，還存在可能發(fā)生假陰性化的問題。
[0014]因此，迫切期望開發(fā)一種血液凝固時間的測定方法，該方法即使對于華法林服用者、維生素K缺乏者或者肝功能不全患者，也不受血液凝固因子的缺乏的影響，與上述ISTH的推薦法相比，可容易且敏感度良好地進行LA檢測。
[0015]本發(fā)明人等進行了深入的研究，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過在將特定的血液凝固因子而不是健康者血漿添加于被檢試樣(例如血漿)后測定血液凝固時間,從而即使不使用健康者血漿，也能夠簡便且敏銳地測定檢測用的血液凝固時間，從而完成了本發(fā)明。
[0016]S卩，本發(fā)明提供一種LA檢測用血液凝固時間的測定方法，其特征在于，在血液凝固時間的測定前或者測定時，向血液試樣中添加含有血液凝固因子的緩沖液組合物來測定血液凝固時間。
[0017]另外，本發(fā)明提供一種輔助試劑，其以含有血液凝固因子的緩沖液組合物為主成分，且與狼瘡抗凝物檢測用血液凝固時間測定用試劑組合使用。
[0018]進而，本發(fā)明提供一種狼瘡抗凝物檢測用血液凝固時間測定用試劑盒，其含有以下的(A)、(B)。
[0019](A)活化部分凝血活酶時間測定用試劑或者稀釋拉塞爾蛇毒時間測定用試劑
[0020](B)以含有血液凝固因子的緩沖液組合物為主成分的輔助試劑。
[0021]根據(jù)本發(fā)明方法，即使來自華法林服用者、維生素K缺乏者或者肝功能不全患者(肝硬化、暴發(fā)型肝炎、或者慢性肝炎患者等)的血液試樣等缺乏維生素K依賴性凝血因子(FI1、FVI1、FIX、以及FX)，也能夠簡便且敏銳地確認(rèn)LA的有無。因此，能夠決定具有LA的患者的正確治療方針。另外，由于不需要準(zhǔn)備健康者血漿，所以也能夠消除以往成為問題的健康者血漿的批次間差別、難以穩(wěn)定獲得的問題。此外，本發(fā)明方法特別值得一提之處是，能夠簡便且敏銳地檢測目前為止即使利用健康者血漿的混合試驗也可能漏檢的LA。這是無法根據(jù)將以往的健康血漿的添加置換為各個血漿成分的添加這樣的單純構(gòu)思來預(yù)測的、完全預(yù)料不到的效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是表示基于以往方法的混合試驗的結(jié)果的模式圖。圖1 (A)表示凝血因子缺乏癥的圖形，圖1 (B)表示凝血因子抑制因子型的圖形，圖1 (C)表示凝血時間的延長原因不明確時的圖形。
[0023]圖2是表示分別以未處理血漿A和添加正常血漿的血漿A為樣本時的混合試驗的結(jié)果的圖。
[0024]圖3是表示分別以未處理血漿B和添加正常血漿的血漿B為樣本時的混合試驗的結(jié)果的圖。
[0025]圖4是表示以添加有輔助試劑1-4的血漿A為樣本時的混合試驗的結(jié)果的圖。
[0026]圖5是表不以添加有輔助試劑1-4的血衆(zhòng)B為樣本時的混合試驗的結(jié)果的圖。
【具體實施方式】
[0027]本發(fā)明的LA檢測用血液凝固時間的測定方法的特征在于，在血液凝固時間的測定前或者測定時，向血液試樣中添加含有血液凝固因子的緩沖液組合物。
[0028]本發(fā)明方法所使用的血液試樣優(yōu)選全血或者血漿，通常，向從被檢者采集的血液中加入枸櫞酸鈉等抗凝血劑來制備。在這些血液試樣中，對于將以往難以進行LA檢測的來自被檢者的血液試樣作為對象的情況，本發(fā)明方法特別有用。作為這樣的血液試樣,可舉出來自華法林服用者、維生素K缺乏者、肝功能不全患者的血液試樣。
[0029]作為血液凝固時間的測定手段，S卩，血液凝固時間測定用試劑，只要是對LA顯示感受性的磷脂依賴性的血液凝固時間測定用試劑或測定手段即可，可以使用測定凝血酶原時間(PT )、活化部分凝血活酶時間(APTT )、稀釋PT (dPT )、稀釋APTT (dAPTT )、高嶺土凝血時間(KCT)、以及稀釋拉塞爾蛇毒時間(dRVVT)等的公知的試劑。這些試劑中，例如，測定凝血酶原時間(PT)的試劑的主成分是鈣和組織凝血活酶，測定活化部分凝血活酶時間(APTT)的試劑的主成分是磷脂、接觸因子活化劑(高嶺土、無水硅酸、鞣花酸等陰性帶電體)以及鈣，測定高嶺土凝血時間(KCT)的試劑的主成分是高嶺土和鈣，測定稀釋拉塞爾蛇毒時間(dRVVT)的試劑的主成分是拉塞爾蛇毒、磷脂。這些成分可以適當(dāng)?shù)刈鳛楠毩⒌脑噭┦褂茫蛘咦鳛楸换旌隙傻脑噭┦褂?。另外，作為上述試劑，均可以使用市售品。作為PT測定用試劑,例如市售有C0AGPIA (注冊商標(biāo))PT-S (SEKISUI MEDICAL公司制)、ThrombocheckPT Plus (Sysmex 公司制)、以及 STA 試劑 Series PT (Roche Diagnostics 公司制)等。作為APTT測定用試劑，例如市售有C0AGPIA (注冊商標(biāo))APTT-N (SEKISUI MEDICAL公司制)、ThrombocheckAPTT-SLA (Sysmex 公司制)、APTT Liquid RD 以及 PTT LA 試劑“RD” (RocheDiagnostics公司制)等。作為試劑的形態(tài)，可舉出使用時被溶解的干燥形態(tài)、或者溶液形態(tài)。
[0030]也可以將這些試劑中的I種以上與本發(fā)明的含有血液凝固因子的緩沖液組合物(輔助試劑)組合而制成試劑盒。
[0031]在這些血液凝固時間測定用試劑中，PT、APTT或者dRVVT在LA檢測敏感度方面優(yōu)選。另外，測定PT或者APTT時，優(yōu)選采用正常血漿與被檢血漿的混合試驗。測定dRVVT時，特別是也可以不進行混合試驗。
[0032]作為本發(fā)明所使用的含有血液凝固因子的緩沖液組合物，可舉出含有被認(rèn)為被檢血液試樣缺乏的血液凝固因子中的至少I種的緩沖液組合物，優(yōu)選含有選自FI1、FVII,FVII1、FIX、FX、FXI以及FXII中的I種或2種以上的緩沖液組合物，進一步優(yōu)選至少含有選自FI1、FVI1、FIX以及FX中的I種或2種以上的緩沖液組合物。此外，測定PT時，優(yōu)選含有選自FI1、FVII以及FX中的I種或2種以上的緩沖液。測定APTT時，優(yōu)選含有選自FI1、FVII1、FIX、FX、FXI以及FXII中的I種或2種以上的緩沖液組合物，特別優(yōu)選含有選自FIX和FX中的I種或2種以上的緩沖液組合物。另外，測定dRVVT時，優(yōu)選含有選自FII和FX中的I種或2種以上的緩沖液組合物。應(yīng)予說明，向被檢試樣中添加本發(fā)明的緩沖液組合物時，試樣被該緩沖液組合物稀釋，試樣中的血液凝固因子濃度降低而影響凝血時間時，可以根據(jù)所使用的試劑，預(yù)選使上述緩沖液組合物中含有需要填補的血液凝固因子。例如，在APTT、dAPTT以及KCT中，可以預(yù)先含有FVII1、FXI以及FXII，在PT中，可以預(yù)先含有FVII，在dRVVT中，可以預(yù)先含有FX。
[0033]此處，作為緩沖液，可以適當(dāng)使用HEPES等的Good緩沖液等公知的緩沖液。緩沖液的PH只要是不使緩沖液組合物中含有的血液凝固因子失活的pH即可，優(yōu)選pH6?9，更優(yōu)選pH6.5?8.0。另外，緩沖液的濃度只要可保持保存中的緩沖能力即可，優(yōu)選5mM?IOOmM,更優(yōu)選 5mM ?50mM。
[0034]就該緩沖液組合物中的血液凝固因子的濃度而言，作為向血液試樣中添加該緩沖液組合物后的血液凝固因子的濃度，優(yōu)選0.Ο?υ/mL~10U/mL的范圍，進一步優(yōu)選0.1U/mL~5U/mL的范圍。血液試樣與緩沖液組合物的混合比例只要考慮緩沖液組合物中的血液凝固因子的濃度而適當(dāng)設(shè)定即可。作為基于緩沖液組合物的血液試樣的稀釋倍率，優(yōu)選3倍以下，更優(yōu)選2倍以下。
[0035]應(yīng)予說明，可以向該緩沖液組合物中適當(dāng)添加公知的物質(zhì)作為血液凝固因子的穩(wěn)定化劑。例如，可以添加日本特公平06-050999號公報中公開的甘氨酰甘氨酸、甘氨酰甘氨酰甘氨酸等。另外，也可以以不損害本發(fā)明的效果為限度地適當(dāng)添加保存劑、離子強度調(diào)節(jié)劑等。
[0036]在本發(fā)明方法中，在血液凝固時間的測定前或者測定時，向血液試樣中添加含有上述血液凝固因子的緩沖液組合物。此處，在血液凝固時間的測定前添加緩沖液組合物，相當(dāng)于血液試樣的前處理。即，向血液試樣中添加上述緩沖液組合物，對血液試樣進行前處理，接著使用血液凝固測定用試劑測定血液凝固時間。另一方面，在血液凝固時間的測定時添加，相當(dāng)于對血液凝固測定用試劑的一部分添加上述緩沖液組合物來測定血液凝固時間。這些添加時期中，從容易確保緩沖液組合物中含有的凝血因子的保存穩(wěn)定性的方面考慮，優(yōu)選在血液凝固時間的測定前向血液試樣中添加上述緩沖液組合物。
[0037]作為血液凝固時間的測定方法，例如可以優(yōu)選通過使用如下方法來檢測凝固，SP，向血液試樣中添加含有鈣和磷脂的試劑(血液凝固時間測定用試劑)而發(fā)生血液凝固反應(yīng)，以物理方式測定與該血液凝固反應(yīng)相伴而發(fā)生變化的透射光變化或者散射光變化等光學(xué)變化、測定試樣的粘度。
[0038]作為鈣，優(yōu)選使用無機酸與鈣的鹽。作為這樣的鈣鹽，可舉出氯化鈣等。另外，作為無機酸與鈣的鹽以外的鈣 鹽，可舉出乳酸鈣。血液凝固時間測定用試劑中的鈣的濃度可以根據(jù)血液凝固時間測定法的種類而適當(dāng)設(shè)定。例如，對于APTT測定法而言，優(yōu)選為20mM~25mM左右，對于PT測定法而言，優(yōu)選為IOmM~12.5mM。
[0039]作為磷脂，可以優(yōu)選使用以往以來血液凝固時間測定用試劑所使用的磷脂。磷脂的脂肪酸側(cè)鏈沒有特別限定，但是優(yōu)選棕櫚酸、油酸、硬脂酸。作為該磷脂，可舉出磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿等。另外，磷脂也可以是來自牛腦、兔腦、人胎盤、大豆等的天然磷脂，或者通過基因重組而制成的磷脂。測定試樣中的磷脂的濃度例如優(yōu)選在APTT試劑中為I μ g/mL~200 μ g/mL,在PT試劑中為10 μ g/mL~300 μ g/mL,在dRVVT測定試劑中為 I Ii g/mL ~300 μ g/mL。
[0040]血液凝固時間測定用試劑的pH可以通過考慮與本發(fā)明的緩沖液組合物混合時的pH而適當(dāng)設(shè)定，作為該測定用試劑本身的pH，優(yōu)選pH6.0~8.0，更優(yōu)選為pH7.0~7.6，可以使用以往的血液凝固時間測定用試劑所使用的緩沖劑來適當(dāng)調(diào)節(jié)。作為該緩沖劑，例如可舉出HEPES或者TRIS等，但并不限定于此。
[0041]上述血液凝固時間測定用試劑中除含有上述成分以外，還可以含有以往公知的血液凝固時間測定用試劑所含的成分。作為這樣的成分，例如可舉出活化劑、蛇毒、組織因子等。作為活化劑，可舉出鞣花酸、高嶺土、硅藻土、膠體二氧化硅、無水硅酸、氧化鋁、鎂等。作為蛇毒，可舉出拉塞爾(Russell)蛇毒、Textarin蛇毒、Ecarin蛇毒等。作為組織因子，可舉出來自兔腦、來自人胎盤、來自牛腦等的天然和基因重組的組織凝血活酶。
[0042]本發(fā)明方法也可以適用于非專利文獻I記載的血液凝固補正試驗(混合試驗)。即，適用于向被檢血液試樣中添加正常血液試樣，將其血液凝固時間被補正的程度制圖來判定的方法。
[0043]更詳細(xì)而言，例如，向被檢血漿中以1:1加入作為正常血漿的Pooled NormalPlasma (Precision Biologic Inc制；以下,簡稱為PNP)或者本發(fā)明的緩沖液組合物并稀釋，將由此得到的試樣作為被檢試樣。向該被檢試樣中添加正常血漿，準(zhǔn)備以正常血漿的比例為0%、20%、50%、80%、100%的方式混合制備的試樣，進行APTT的測定。將其結(jié)果繪制成圖(橫軸:混合后的正常血漿的比例或者被檢血漿的比例(％)，縱軸:凝血時間(秒))，可以根據(jù)該圖的形狀目視判定。
[0044]如果使用本發(fā)明方法，則通過單純地進行上述緩沖液組合物的添加以外，僅進行以往的血液凝固時間的測定，從而即使是來自華法林服用者、維生素K缺乏者或者肝功能不全患者的血液試樣，也能夠正確地檢測、判定LA的有無。
[0045]含有上述血液凝固因子的緩沖液組合物可以作為與狼瘡抗凝物檢測用血液凝固時間測定用試劑組合使用的輔助試劑來使用。
[0046]另外，(A)活化部分凝血活酶時間測定用試劑或者稀釋拉塞爾蛇毒時間測定用試齊U，與(B)以含有血液凝固因子的緩沖液組合物為主成分的輔助試劑的組合，作為狼瘡抗凝物檢測用血液凝固時間測定用試劑盒有用。
[0047]實施例
[0048]通過以下實施例進一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于以下實施例。
[0049]實施例1
[0050]將被檢血漿用表I記載的輔助試劑稀釋為1:1，將得到的稀釋試劑作為樣本，實施通常的混合試驗，比較圖中曲線的形狀。
[0051]<測定項目>
[0052](I)APIT 篩選試驗
[0053]使用PTT LA試劑“RD”(Roche Diagnostics公司制)，利用血液凝固自動分析裝置STA-R (Roche Diagnostics公司制)實施測定。判定中，使用試劑的所附說明書所記載的cutoff值。該試劑是使用含有作為磷脂的腦磷脂、作為接觸因子活化劑(陰性帶電體)的二氧化硅的PTT LA試劑、和另外自制的氯化鈣溶液進行測定的試劑，能夠與本發(fā)明的含有血液凝固因子的緩沖液組合物(輔助試劑)組合用于本發(fā)明的方法。
[0054](2)dRVVT 試驗
[0055]使用LA測試“Gradipore”(醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所社制)試劑，利用血液凝固自動分析裝置STA-R實施測定。判定中，使用試劑的包裝說明書所記載的cutoff值。該試劑由含有拉塞爾蛇毒和磷脂的試劑1、含有拉塞爾蛇毒和過量磷脂的試劑2構(gòu)成，能夠與本發(fā)明的含有血液凝固因子的緩沖液組合物(輔助試劑)組合用于本發(fā)明的方法。
[0056](3)磷脂中和法試驗
[0057]使用STACL0T LACRoche Diagnostics公司制),利用血液凝固分析裝置ST4(RocheDiagnostics公司制)實施測定。判定中，使用試劑的包裝說明書所記載的cutoff值。
[0058](4)混合試驗
[0059]使用PTT LA試劑“RD”(Roche Diagnostics公司制)，利用血液凝固自動分析裝置 CP2000 (SEKISUI MEDICAL 公司制)實施測定。使用 Pooled Normal Plasma (以下 PNP，Precision Biologic Inc.)作為正常血漿。樣本混合比例設(shè)定為0%、10%、20%、50%、100%，使用CP2000的混合試驗功能，采用自動稀釋進行測定。判定如下進行:繪圖，如果向上凸出，則為陽性。難以判定的為判定保留。
[0060](5)混合試驗變型
[0061]將被檢血漿用PNP或者后述的輔助試劑1-4進行1:1稀釋，將得到的稀釋試劑放入樣本杯，置于CP2000，與(4)同樣地實施測定。判定如下進行:繪圖，如果向上凸出，則為陽性。難以判定的為判定保留。
[0062]<本發(fā)明的緩沖液組合物:輔助試劑>
[0063]將HBS (50mM HEPES pH7.5，150mM氯化鈉)作為基礎(chǔ)溶液，向其中添加表1所示的血液凝固因子，制備各輔助試劑。血液凝固因子全部使用Haematologic TechnologiesInc.的血液凝固因子。
[0064]表1
[0065]
【權(quán)利要求】
1.一種狼瘡抗凝物檢測用血液凝固時間的測定方法，其特征在于，在血液凝固時間的測定前或者測定時，向血液試樣中添加含有血液凝固因子的緩沖液組合物，測定血液凝固時間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其中，血液凝固因子是選自FI1、FVI1、FVII1、FIX、FX, FXI以及FXII中的I種或2種以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測定方法，其中，血液試樣是全血或者血漿。
4.根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項所述的測定方法，其中，在血液凝固時間的測定前，向血液試樣中添加含有血液凝固因子的緩沖液組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1?4中任一項所述的測定方法,其中,血液試樣來自選自華法林服用者、維生素K缺乏者以及肝功能不全患者中的患者。
6.根據(jù)權(quán)利要求1?5中任一項所述的測定方法，其中，血液凝固時間的測定手段為活化部分凝血活酶時間或者稀釋拉塞爾蛇毒時間。
7.一種輔助試劑，以含有血液凝固因子的緩沖液組合物為主成分，與狼瘡抗凝物檢測用血液凝固時間測定用試劑組合使用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的輔助試劑，其中，狼瘡抗凝物檢測用血液凝固時間測定用試劑被用于活化部分凝血活酶時間或者稀釋拉塞爾蛇毒時間的測定。
9.一種狼瘡抗凝物檢測用血液凝固時間測定用試劑盒，含有以下的(A)、(B): (A)活化部分凝血活酶時間測定用試劑或者稀釋拉塞爾蛇毒時間測定用試劑， (B)以含有血液凝固因子的緩沖液組合物為主成分的輔助試劑。
【文檔編號】G01N33/86GK103688177SQ201280029832
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月17日
【發(fā)明者】家子正裕, 森川千鶴, 服部惠子 申請人:學(xué)校法人東日本學(xué)園, 積水醫(yī)療株式會社