用于光學(xué)分析和特異性分離生物學(xué)樣品的裝置和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于證實(shí)液態(tài)樣品中的細(xì)胞的方法，具有下列步驟：i)通過(guò)多孔薄膜過(guò)濾液態(tài)樣品，該薄膜適合保留待證實(shí)的細(xì)胞，其中，載體(1)的至少一部分區(qū)域設(shè)計(jì)成透明的支承體(3)并且薄膜以這樣的方式平面地布置在透明的支承體(3)上，使得待證實(shí)的細(xì)胞保留在薄膜表面的至少一部分上，并且至少一部分的樣品液體經(jīng)過(guò)薄膜，ii)施加液態(tài)的光學(xué)介質(zhì)，該光學(xué)介質(zhì)具有與支承體基本上相同的折射率，iii)光學(xué)檢測(cè)薄膜的至少一部分面以便探測(cè)待證實(shí)的細(xì)胞。
【專利說(shuō)明】用于光學(xué)分析和特異性分離生物學(xué)樣品的裝置和方法
[0001]本發(fā)明涉及一種用于證實(shí)液態(tài)樣品內(nèi)的細(xì)胞的方法以及裝置，所述裝置可用于實(shí)施該方法。
[0002]顯微術(shù)是分析化學(xué)中的廣泛流行的方法。尤其在“生命科學(xué)”中，顯微術(shù)是不可缺少的工具，以便表示例如組織和細(xì)胞的特征。已建立目標(biāo)載體作為待檢查的介質(zhì)與待成像的顯微鏡構(gòu)件之間的“接口”。它在此是26*76mm(IS08255-2)的、厚度為I至1.5mm的玻片。目標(biāo)例如在更薄的層中(組織薄片，液體膜)施加到目標(biāo)載體上并且大多情況下以蓋玻片(通常18mm*18_ ；0.16mm厚)覆蓋。
[0003]過(guò)濾技術(shù)同樣是廣為流行的尤其是用于不同大小的固體或液體分離的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，
[0004]在結(jié)合顯微術(shù)和過(guò)濾技術(shù)時(shí)，過(guò)濾器殘?jiān)o接過(guò)濾過(guò)程通過(guò)顯微技術(shù)檢查。為此，過(guò)濾介質(zhì)，例如過(guò)濾器薄膜必須從過(guò)濾器裝置中提取并且放置在目標(biāo)載體上。該過(guò)程尤其在較薄的薄膜(例如IOym厚度，25mm直徑)中需要較高的實(shí)驗(yàn)技巧并且非常耗時(shí)。若該過(guò)程要每日且成本低廉地例如實(shí)驗(yàn)在醫(yī)學(xué)診斷中，例如在檢查從血樣中過(guò)濾出的腫瘤細(xì)胞時(shí)必須開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單且廉價(jià)的溶液，該溶液也由未經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的人員實(shí)施。尤其是分離所選擇的單獨(dú)細(xì)胞，例如循環(huán)腫瘤細(xì)胞，(circulatmg tumor cells mCTCs)或用于下列分子診斷的檢查的細(xì)胞集合體(Zellveri^nden)基于科學(xué)的進(jìn)步在領(lǐng)域上今后越來(lái)越重要。
[0005]因此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種光學(xué)分析和特異性分離生物學(xué)樣品的裝置和方法，該裝置和方法可以通過(guò)具有高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)方法使用并且簡(jiǎn)單地構(gòu)造，簡(jiǎn)單地操作以及是成本低廉的。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題尤其是一種用于光學(xué)分析并且特異性分離生物學(xué)樣品的裝置和方法，該裝置和方法很好地適合之后的顯微檢查。在此，應(yīng)當(dāng)可以使用具有標(biāo)準(zhǔn)緊固件的標(biāo)準(zhǔn)裝置的設(shè)備，以便可以大批量簡(jiǎn)單地且廉價(jià)地在過(guò)濾殘?jiān)蠈?shí)施例如光照顯微或熒光顯`微檢查。尤其是本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，能夠?qū)崿F(xiàn)在(循環(huán))腫瘤細(xì)胞(CTC)的獲得和檢查中的使用。
[0006]本發(fā)明涉及一種按權(quán)利要求1所述的方法和按權(quán)利要求11所述的裝置。
[0007]在按本發(fā)明的過(guò)濾過(guò)程中，通過(guò)過(guò)濾器，例如過(guò)濾器薄膜過(guò)濾懸浮液。在此將滲透物擠壓通過(guò)過(guò)濾器并且將保留物保留在過(guò)濾器表面上(或也在細(xì)孔和過(guò)濾器的空穴中)。因此，在過(guò)濾過(guò)程中，通過(guò)該過(guò)濾器存在滲透物的現(xiàn)行流動(dòng)方向，因此會(huì)涉及在過(guò)濾器的上游區(qū)域和下游區(qū)域，在該上游區(qū)域內(nèi)保留保留物(其包含作為主要組成部分的細(xì)胞)，保留物會(huì)被壓入該下游區(qū)域內(nèi)并且例如在此聚集。與現(xiàn)行流動(dòng)方向無(wú)關(guān)地，在例外情況下，例如在回沖過(guò)濾器時(shí)也可以使流動(dòng)方向反向。
[0008]為了將滲透物擠壓通過(guò)過(guò)濾器，可以產(chǎn)生壓差，其中，然后在過(guò)濾器上游存在比下游更高的壓力。這可以通過(guò)下列方式實(shí)現(xiàn):在過(guò)濾器上游設(shè)置過(guò)壓、在過(guò)濾器下游設(shè)施低壓或由這兩種方式構(gòu)成的組合。為阻止?jié)B透物流過(guò)過(guò)濾器(減小到零)，可以將壓差設(shè)定為零。這與過(guò)濾器在空間中的定向無(wú)關(guān)。此外對(duì)于特殊情況，在過(guò)濾器上的流動(dòng)方向垂直地走向或具有垂直的分量(也就是說(shuō)順著或逆著地心引力的方向)還要考慮，過(guò)濾器上的水柱有助于壓差。[0009]對(duì)于按本發(fā)明的方法的一些應(yīng)用優(yōu)選的是，過(guò)濾物在過(guò)濾器上的流動(dòng)方向順著地心引力的方向延伸。由此保留的保留物位于過(guò)濾器的表面，這例如能夠?qū)崿F(xiàn)保留物(細(xì)胞)簡(jiǎn)單的再加工。
[0010]對(duì)于一定的應(yīng)用優(yōu)選的是，例如在保留物浮起時(shí)或?yàn)榱耸辜?xì)胞在過(guò)濾之后從過(guò)濾器的下側(cè)聚集在收集容器中，不是順著地心引力的方向，而是逆著地心引力的方向過(guò)濾。
[0011]本發(fā)明涉及一種用于證實(shí)在液態(tài)樣品中的細(xì)胞的方法，具有下列步驟:
[0012]i)通過(guò)多孔的薄膜過(guò)濾液態(tài)樣品，該多孔的薄膜適合保留待證實(shí)的細(xì)胞，其中，載體的至少一部分區(qū)域設(shè)計(jì)成透明的支承體并且其中，薄膜平面地這樣布置在透明的支承體上，使得待證實(shí)的細(xì)胞保留在薄膜表面的至少一個(gè)部分上，并且樣品液體的至少一部分經(jīng)過(guò)薄膜，
[0013]ii)施加液態(tài)的光學(xué)介質(zhì),該光學(xué)介質(zhì)基本上具有與支承體相同的折射率，
[0014]iii)光學(xué)檢測(cè)薄膜的至少一部分面以便探測(cè)待證實(shí)的細(xì)胞。
[0015]在支承體上可以設(shè)置薄膜。該支承體用于支承薄膜并且能夠?qū)崿F(xiàn)排出濾液。薄膜可以支承在支承體上。為此，在支承體的表面中構(gòu)造通道，以確保濾液的排出。按備選的實(shí)施形式，在支承體中也可以提供孔或細(xì)孔。支承體可以作為單獨(dú)的部分構(gòu)造在載體的凹處中，但它也可以與載體的部分區(qū)域成一整體地構(gòu)造在載體的部分區(qū)域內(nèi)。
[0016]折射率為真空光速CO與光在介質(zhì)M中的傳播速度CM的比:
[0017]n=cO/cM
[0018]折射率是無(wú)度量尺寸的數(shù)?；旧舷嗟鹊恼凵渎室馕吨?，折射率差別不大于0.1，優(yōu)選不大于0.01，更明顯優(yōu)選不大于0.001。
[0019]載體優(yōu)選基本上具有顯微術(shù)目標(biāo)載體的尺寸。
[0020]薄膜和支承體例如可以具有基本上正方形、圓形或橢圓形的底面。
[0021]通過(guò)按本發(fā)明使用與支承體的材料適配的光學(xué)介質(zhì)，明顯改善了光學(xué)檢測(cè)。
[0022]薄膜和支承體優(yōu)選選擇為，使得它們同樣具有基本上相等的折射率。
[0023]按本發(fā)明的一方面，待證實(shí)的細(xì)胞在過(guò)濾之前或之后標(biāo)記以含有第一標(biāo)記物的第一器件，用于標(biāo)記待證實(shí)的細(xì)胞。
[0024]適合用于標(biāo)記的器件包括可以使非特異性或特異性細(xì)胞著色的標(biāo)記物。非特異性的標(biāo)記物例如可以是著色劑，該著色劑使蛋白質(zhì)、核酸或另外的細(xì)胞組成部分著色。特異性的標(biāo)記物可以是例如抗體、特異性寡核苷酸、縮氨酸或另外的分子，它們與蛋白質(zhì)、核酸序列或另外的細(xì)胞特異性的結(jié)構(gòu)特異性地結(jié)合。
[0025]標(biāo)記物可以用可證實(shí)的標(biāo)記物直接地標(biāo)記，例如鉻精著色劑、熒光著色劑、同位素標(biāo)記等。備選地，也可以通過(guò)二次證實(shí)試劑(例如二次抗體或酵素-基質(zhì)-系統(tǒng))證實(shí)標(biāo)記物。
[0026]按本發(fā)明優(yōu)選的方面，在該方法中，在過(guò)濾之后，在薄膜上的細(xì)胞借助著色劑通過(guò)用相應(yīng)過(guò)程液體的培養(yǎng)來(lái)著色。為此，可以選擇使細(xì)胞或細(xì)胞組成部分著色并且從細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)已知的著色劑。這可以是活或死著色劑，使特異性細(xì)胞核或另外細(xì)胞器著色或使特異性確定細(xì)胞成分，例如核酸或蛋白質(zhì)著色的著色劑。已知的細(xì)胞著色劑是例如臺(tái)盼藍(lán)染色、DAPI和類似物。
[0027]待證實(shí)的細(xì)胞可以在薄膜上不著色或著色地還用顯微鏡分析。[0028]薄膜平面地優(yōu)選位于透明的支承體上并且至少部分地或完全地覆蓋該支承體。
[0029]按本發(fā)明的一方面，載體是用于顯微術(shù)的目標(biāo)載體，該目標(biāo)載體由玻璃或塑料，尤其是環(huán)烯烴類共聚物(COC)或聚碳酸酯構(gòu)成。優(yōu)選的COC以商品名稱TOPAS?而被熟知。
[0030]按本發(fā)明的一方面，支承體結(jié)構(gòu)化和/或是多孔的，并且由塑料、環(huán)烯烴類共聚物(COC)或聚碳酸酯，尤其是由與載體相同的材料構(gòu)成。
[0031]按本發(fā)明的一方面，載體和支承體整體地由一主體構(gòu)成，并且薄膜完全覆蓋載體中的凹處并且尤其是平坦地支承在支承體上凹處的區(qū)域內(nèi)。
[0032]按本發(fā)明的一方面，支承體包括構(gòu)造在面朝過(guò)濾器薄膜的一側(cè)的通道，該通道與過(guò)濾器薄膜流體接觸。通道可以構(gòu)造成在支承體和/或載體中的開(kāi)口，由此，液體遠(yuǎn)離薄膜通過(guò)支承體或載體流走或吸走。開(kāi)口例如可以設(shè)計(jì)成垂直的、從支承體或載體的上側(cè)到下側(cè)的孔。薄膜和支承體可以例如具有基本上正方形的、圓形或橢圓形的底面。開(kāi)口可以以規(guī)則的距離處于底面的邊緣上。該優(yōu)選的裝置能夠?qū)崿F(xiàn)濾液均勻的流走。同時(shí)，薄膜基本上覆蓋支承體，以便在用光學(xué)介質(zhì)填滿薄膜和支承體之間的間隙時(shí)和即使在用該介質(zhì)可能填滿薄膜細(xì)孔時(shí)也存在具有同樣折射率的光學(xué)單元，在該光學(xué)單元上可以非常好地用顯微鏡檢驗(yàn)。備選地，這些開(kāi)口也可以基本上均勻地分布在支承體的底面上。
[0033]按本發(fā)明的一方面，薄膜和支承體形成共同的接觸面，該接觸面具有多個(gè)共同的，位于接觸面的平面平行的、平坦的面內(nèi)的接觸部位，其中，尤其是薄膜具有到支承體的最大距離，小于100 μ m。薄膜優(yōu)選位于接觸部位上。
[0034]按本發(fā)明的一方面，過(guò)濾器薄膜是徑跡蝕刻過(guò)濾器薄膜，該薄膜由聚碳酸酯薄膜構(gòu)成，并且其孔徑為2-100 μ m,尤其是5-20 μ m,優(yōu)選5-10更明顯優(yōu)選約8 μ m。
[0035]按本發(fā)明的一方面，可以分離待證實(shí)的細(xì)胞。然后，分離的細(xì)胞可以進(jìn)一步表征或進(jìn)行其他功能性的檢查。
[0036]按本發(fā)明的一方面，可以通過(guò)激光顯微解剖分離待證實(shí)的細(xì)胞。優(yōu)選可以進(jìn)行光學(xué)探測(cè)，然后在相同的裝置中以前后相續(xù)的工作步驟進(jìn)行激光顯微解剖。
[0037]激光顯微解剖是用于激光輔助的顯微解剖組織和細(xì)胞的顯微學(xué)技術(shù)。在此，可以借助激光(例如紅外線或紫外線激光)從組織段中切除單個(gè)細(xì)胞或期望的區(qū)域。細(xì)胞可以與它所在的薄膜面積段共同地“切除”。然后，要么分離純的細(xì)胞，方式是它在重力影響下落入反應(yīng)容器中，要么該細(xì)胞克服重力投入這些反應(yīng)容器中或間接地從反應(yīng)容器帶粘性的蓋上取下。
[0038]按本發(fā)明的一方面，待證實(shí)的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
[0039]此外，本發(fā)明還涉及一種用于證實(shí)液態(tài)樣品中的細(xì)胞的裝置，其具有載體和液態(tài)的光學(xué)介質(zhì)，該載體適合保留待證實(shí)的細(xì)胞，其中，薄膜平面地布置在支承體上，其中，支承體布置和/或構(gòu)造在載體的凹處中，液態(tài)的光學(xué)介質(zhì)基本上具有與支承體相同的折射率，其中，至少這一個(gè)支承體是透明的。
[0040]此處,將由載體、薄膜和液態(tài)光學(xué)介質(zhì)構(gòu)成的組合(,，Kit of Parts")看作按本發(fā)明的裝置。薄膜可例如通過(guò)粘接、焊接、壓合連接或相似方式與載體和/或支承體連接。按一種優(yōu)選的實(shí)施形式，薄膜覆蓋支承體并且例如通過(guò)點(diǎn)焊在邊緣上與載體連接。
[0041]優(yōu)選的是，載體是用于顯微術(shù)的目標(biāo)載體，該目標(biāo)載體由玻璃或由塑料，尤其是聚碳酸酯構(gòu)成，和/或支承體結(jié)構(gòu)化和/或由塑料，尤其是聚碳酸酯構(gòu)成多孔的。[0042]下列根據(jù)附圖舉例描述本發(fā)明，這些附圖簡(jiǎn)略地示出按本發(fā)明方法的實(shí)施形式。
[0043]在圖1中示出平坦的支承體I的剖面圖，該支承體例如由C0C，例如尤其是由商品名稱為T(mén)OPAS的COC組成。在支承體I中，在面朝薄膜5的上側(cè)構(gòu)造一些通道3。這些通道3貫穿支承體的表面并且可以通入(延伸通過(guò)支承體的)孔或開(kāi)口，通過(guò)孔或開(kāi)口可以從支承體的上側(cè)吸走液體。
[0044]代替通道建議也可以在支承體的上側(cè)設(shè)置突起，該突起例如設(shè)計(jì)成金字塔或截錐體并且其表面位于一平面內(nèi)，由此定義了薄膜5所放置的支承面或接觸面。按一種優(yōu)選的實(shí)施形式，支承體的表面構(gòu)造為六邊形的包(Packung),其具有150 μ m高的截錐體和300 μ m的網(wǎng)格尺寸。截錐體的間隙定義可以排出液體的通道，截錐體的截面定義用于薄膜的支承面。
[0045]載體的部分區(qū)域設(shè)計(jì)成支承體。載體優(yōu)選具有目標(biāo)載體的尺寸，如它在顯微術(shù)中所使用那樣。
[0046]薄膜的孔徑選擇為，使得待證實(shí)的細(xì)胞9不可經(jīng)過(guò)薄膜。
[0047]現(xiàn)在在圖1的第一步驟A中過(guò)濾樣品，以便待證實(shí)的細(xì)胞9位于薄膜上。
[0048]薄膜的孔徑為0.1至200 μ m。由此可以保留細(xì)胞，而細(xì)胞碎片、血小板和樣品更小的固定部分穿過(guò)過(guò)濾器(薄膜)。
[0049]薄膜的孔徑為優(yōu)選2至50 μ m,明顯優(yōu)選5至20 μ m,更明顯優(yōu)選5至10 μ m。孔徑范圍為2至50 μ m，5至20 μ m或尤其是5至10 μ m提供的優(yōu)點(diǎn)是，細(xì)胞被它保留，但部分地粘附地留在細(xì)孔中并因此特別好地粘附在薄膜上，并且可供另外的分析使用。已證實(shí)特別適合的是，孔徑為約8 μ m。
[0050]從樣品液體中要分離的細(xì)胞分離方式是，將它保留在過(guò)濾器薄膜的表面上，該表面對(duì)于要分離的固體(例如細(xì)胞)是不滲透的，但對(duì)于周圍介質(zhì)和污染要分離的固體(細(xì)胞)的固體(例如細(xì)胞碎片)是可滲透的。
[0051]在圖1的最佳步驟B中，可以標(biāo)記待證實(shí)的細(xì)胞9，以便它更好地可以與另外的細(xì)胞7區(qū)分。這例如可以通過(guò)確定抗原的免疫組化染色實(shí)現(xiàn)。若證實(shí)是腫瘤細(xì)胞，則存在大量已知的、可以用相應(yīng)的抗體標(biāo)記的腫瘤抗原。因此可以證實(shí)特異性的腫瘤細(xì)胞。相應(yīng)的抗體和染色方案對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員是已知的。
[0052]下列清單示出一些優(yōu)選的細(xì)胞特異性的抗原:
[0053]-在肝細(xì)胞癌和性腺間和性腺外生殖細(xì)胞腫瘤中的甲型胎兒蛋白(AFP)
[0054]-在多發(fā)性骨髓瘤中的本周氏蛋白
[0055]-在臨界性和非精原細(xì)胞睪丸瘤的生殖細(xì)胞腫瘤中的
[0056]Beta-HCG(beta-Untereinheit des humanen Choriongona-dotropin)
[0057]-在乳腺癌(Mammakarzinom)或卵巢癌(Ovarialkarzinom)中的CAl5-3
[0058]-在膜腺癌(Pankreaskarziom)中的CA19-9 和 CA50
[0059]-在卵巢癌(Ovarialkarzinom)中的CA-125
[0060]-在甲狀腺髓樣癌中的降鈣素
[0061]-在結(jié)腸癌、胰臟癌以及肺癌中的癌胚抗原(CEA)
[0062]-在所有肺癌(Bronchialkarzinoms)的變體中的細(xì)胞角質(zhì)蛋白-21-片段(CYFRA21-1)和 Serpin B4 (SCC)[0063]-HER-2/ 新型
[0064]-HPV-抗體或HPV-抗原
[0065]-在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的高香草酸
[0066]-在類癌中的5-羥吲哚乙酸
[0067]-在生殖細(xì)胞腫瘤中的兒茶酚胺、香草扁桃的嗜鉻細(xì)胞瘤的乳酸脫氫酶(LDH)
[0068]-乳酸脫氫酶同工酶(LDH-1)在生殖細(xì)胞腫瘤中的；但一個(gè)常規(guī)測(cè)定還未在目前的指南中建議
[0069]-MAGE 抗原
[0070]-在嗜鉻細(xì)胞瘤中的腎上腺素
[0071]-在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)或在乳腺癌中的MUCl
[0072]-在小細(xì)胞肺癌(SCLC)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤以及精原生殖細(xì)胞腫瘤中的NSE
[0073]-在精原生殖細(xì)胞腫瘤中的胎盤(pán)堿性磷酸酶(PLAP)
[0074]-在前列腺癌(Prostatakarzinom)中的PSA
[0075]-在乳頭狀或?yàn)V泡狀甲狀腺癌中各種濃度的甲狀腺球蛋白(Tg)
[0076]-胸苷激酶
[0077]-細(xì)胞角質(zhì)蛋白，例如細(xì)胞角質(zhì)蛋白8，18，19
[0078]因此，通過(guò)標(biāo)記可以探測(cè)特異性的細(xì)胞種類。因此，例如可以在血樣中區(qū)分待證實(shí)的腫瘤細(xì)胞與白血球。
[0079]但作為補(bǔ)充或備選，細(xì)胞也以非特異性的著色劑(它在不同種類細(xì)胞之間不區(qū)分)標(biāo)記，例如活著色劑(例如熒光素)或死著色劑(例如臺(tái)盼藍(lán))。由此可以選擇例如活著的或死的細(xì)胞用于另外的分析。
[0080]在圖1的另一個(gè)步驟C中，施加具有與支承體基本上相等折射率的液態(tài)的光學(xué)介質(zhì)11。
[0081 ] 這樣施加液態(tài)的光學(xué)介質(zhì)11，使得它填充一些在薄膜5和支承體3之間的間隙，這些間隙例如通過(guò)支承體3中的通道結(jié)構(gòu)定義。此外，液態(tài)的光學(xué)介質(zhì)11也填充薄膜5的細(xì)孔，優(yōu)選也覆蓋薄膜5的表面和位于其上的、薄層中的細(xì)胞。
[0082]由此，明顯改善了由支承體3和薄膜5構(gòu)造的裝置的光學(xué)成像特性，這能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞在薄膜上更好的且簡(jiǎn)化的光學(xué)探測(cè)。
[0083]這通過(guò)提供薄膜載體塑料在UVA范圍內(nèi)(例如337nm)的良好的透明度得以簡(jiǎn)化(例如 337nm).[0084]在探測(cè)之前，這樣地通過(guò)液態(tài)的光學(xué)介質(zhì)11具有與薄膜載體的折射率至少近似相同的折射率(n=l，533)的液態(tài)光學(xué)介質(zhì)11填充在支承體3和薄膜5之間的流體通道，使得生物學(xué)的樣品在薄膜表面上仍與光學(xué)介質(zhì)接觸。具有預(yù)定的折射率的相應(yīng)光學(xué)介質(zhì)的制造對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知。光學(xué)介質(zhì)(例如蔗糖溶液)的折射率可以用折射計(jì)確定并且溶液通過(guò)稀釋相應(yīng)地調(diào)節(jié)。優(yōu)選光學(xué)介質(zhì)的成分的蒸汽壓力可忽略。
[0085]在圖1的步驟D中，細(xì)胞的光學(xué)分析優(yōu)選從背面通過(guò)約Imm厚的載體塑料進(jìn)行。這例如可以通過(guò)反向顯微鏡實(shí)現(xiàn)。箭頭在此是指，探測(cè)細(xì)胞9的方向。
[0086]然后，在圖1的最佳步驟E中，借助激光顯微解剖分離檢測(cè)到的待證實(shí)的細(xì)胞。
[0087]箭頭在此是指細(xì)胞9 (和可能的其上具有細(xì)胞的、薄膜的部分面)通過(guò)激光與薄膜脫離并且由樣品容器13收集的方向。分離的細(xì)胞可以進(jìn)行另外的測(cè)試。
[0088]按本發(fā)明的方法特別適合用于與激光顯微解剖的這種組合，因?yàn)楣鈱W(xué)介質(zhì)的使用能實(shí)現(xiàn)特別精確的工作。
[0089]備選地，細(xì)胞也可以保留在薄膜上并在此進(jìn)行其他的測(cè)試，例如用EPISP0T或ELISP0T(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn))方法。在此，通過(guò)免疫化學(xué)方式，在薄膜上證實(shí)由細(xì)胞分泌的物質(zhì)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于證實(shí)液態(tài)樣品中的細(xì)胞的方法，該方法具有下列步驟: i)通過(guò)多孔薄膜過(guò)濾所述液態(tài)樣品，該薄膜適合保留待證實(shí)的細(xì)胞(9)，其中，載體的至少一部分區(qū)域設(shè)計(jì)成透明的支承體(1)，并且，所述薄膜(5)以這樣的方式平面地布置在所述透明的支承體(1)上，使得待證實(shí)的細(xì)胞(9)保留在所述薄膜的表面的至少一部分上，所述樣品液體的至少一部分經(jīng)過(guò)所述薄膜(5)， ?)施加液態(tài)的光學(xué)介質(zhì)(11)，所述光學(xué)介質(zhì)(11)基本上具有與所述支承體相同的折射率， iii)光學(xué)檢測(cè)所述薄膜(5)的至少一部分面以便探測(cè)待證實(shí)的細(xì)胞(9)。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述過(guò)濾之前或之后以包含第一標(biāo)記物、用于標(biāo)記所述待證實(shí)的細(xì)胞的第一器件標(biāo)記所述待證實(shí)的細(xì)胞(9)。
3.按前述權(quán)利要求之一所述的方法，其中，所述載體是用于所述顯微術(shù)的目標(biāo)載體，所述目標(biāo)載體由玻璃或塑料，尤其是環(huán)烯烴類共聚物構(gòu)成，和/或所述支承體(1)結(jié)構(gòu)化，和/或由塑料，尤其是由相同的材料構(gòu)成多孔的。
4.按前述權(quán)利要求之一所述的方法，其中，所述載體和所述支承體(1)整體地由一主體構(gòu)成，所述薄膜(5)完全覆蓋所述支承體(1)并且尤其是平坦地支承在所述支承體上。
5.按前述權(quán)利要求之一所述的方法，其中，所述支承體(1)包括在靠近所述過(guò)濾器薄膜的一側(cè)構(gòu)造的通道(3)，所述通道(3)構(gòu)造為與所述薄膜(5)流體接觸。
6.按前述權(quán)利要求之一所述的方法，其中，所述薄膜(5)和所述支承體(1)具有多個(gè)共同的位于所述接觸面的、平面平行的平坦平面內(nèi)的接觸部位，其中，尤其是所述薄膜(5)具有到平坦接觸面的小于小于100 μ m的最大距離。
7.按前述權(quán)利要求之一所述的方`法，其中，所述薄膜(5)是徑跡蝕刻過(guò)濾器薄膜，該薄膜由聚碳酸酯薄膜構(gòu)造并且包括直徑為2 μ m-100 μ m,尤其是5_10 μ m的細(xì)孔。
8.按前述權(quán)利要求之一所述的方法，其中，分離至少一個(gè)待證實(shí)的細(xì)胞(9)。
9.按權(quán)利要求8方法，其中，所述待證實(shí)的細(xì)胞(9)通過(guò)激光顯微解剖分離。
10.按前述權(quán)利要求之一所述的方法，其中，所述待證實(shí)的細(xì)胞(9)是腫瘤細(xì)胞。
11.一種用于證實(shí)液態(tài)樣品中的細(xì)胞的裝置，其具有載體、多孔的薄膜(5)和液態(tài)的光學(xué)介質(zhì)(11)，所述薄膜(5)適合保留待證實(shí)的細(xì)胞(9)，其中，載體的至少一部分區(qū)域設(shè)計(jì)成支承體(1)，并且，所述薄膜平面地布置在所述支承體(1)上，所述液態(tài)的光學(xué)介質(zhì)(11)基本上具有與所述支承體相同的折射率，其中，至少所述支承體是透明的。
12.按權(quán)利要求11所述的裝置，其中，所述載體和所述支承體(1)整體地由一主體構(gòu)成，所述薄膜(5)完全地覆蓋所述支承體并且尤其是在凹槽的區(qū)域內(nèi)平坦地支承在所述支承體上。
13.按權(quán)利要求11或12所述的裝置，其中，所述支承體(1)包括構(gòu)造在靠近所述薄膜(5)一側(cè)的通道(3)，所述通道(3)構(gòu)造為與所述過(guò)濾器薄膜流體接觸。
14.按權(quán)利要求11至13之一所述的裝置，其中，所述薄膜(5)和所述支承體⑴具有多個(gè)共同的，位于形成接觸面的、平面平行的平坦平面內(nèi)的接觸部位，其中，尤其是所述薄膜(5)具有到平坦接觸面的小于100 μ m的最大距離。
15.按權(quán)利要求14所述的裝置，其中，所述支承體在所述過(guò)濾器薄膜和所述支承體之間接觸的區(qū)域內(nèi)構(gòu)造成肋條的形狀，尤其是具有寬度在50 μ m至500 μ m范圍內(nèi)的三角形橫截面的肋條形狀，截錐形狀，棱錐形狀和/或棱柱形狀。
16.按權(quán)利要求11至15之一所述的裝置，其中，所述薄膜(5)是由聚碳酸酯薄膜構(gòu)成的徑跡蝕刻過(guò)濾器薄膜，并且包括直徑為2-100微米，尤其是8 μ m的細(xì)孔并且具有每平方厘米IO5個(gè)細(xì)孔的孔密度。
17.按權(quán)利要求11至16之一所述的裝置，其中，所述載體是用于顯微術(shù)的目標(biāo)載體，該目標(biāo)載體由玻璃或塑料構(gòu)成，尤其是由COC構(gòu)成，和/或所述支承體(1)結(jié)構(gòu)化，和/或由塑料，尤其是由相同材料構(gòu)成多孔的。
【文檔編號(hào)】G01N15/06GK103702735SQ201280035947
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2012年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月20日
【發(fā)明者】W.岡布雷科特, J.班杰特, K.弗里德里克, K.希爾陶斯基, P.波利卡, M.斯坦?jié)蔂? 申請(qǐng)人:西門(mén)子公司