本發(fā)明涉及對樣品、尤其是組織樣品中的蛋白進(jìn)行檢測和/或定量的改進(jìn)方法。
背景技術(shù)：
：免疫組織化學(xué)（IHC）是通過借助抗體檢測抗原，從而對組織切片上細(xì)胞中的蛋白進(jìn)行定位的方法的名稱。免疫組織化學(xué)利用了抗體特異性結(jié)合至生物組織中的抗原這一事實?？贵w可以是多克隆或單克隆來源的抗體，單克隆抗體本質(zhì)上更具特異性?？捎枚喾N方法對抗體-抗原對進(jìn)行可視化。大多數(shù)情況下，將抗體綴合至酶（特別是堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶），所述酶在發(fā)色底物（例如用于辣根過氧化物酶的DAB）或熒光團(tuán)（FITC、TRITC、AMCA等）的存在下產(chǎn)生高度著色的產(chǎn)物。對由發(fā)色或熒光方法獲得的信號的密度測定分析可分別提供半定量或定量數(shù)據(jù)，從而能夠?qū)y量到的信號水平與蛋白的表達(dá)水平或定位相關(guān)聯(lián)。這允許由解剖病理學(xué)家進(jìn)行基于顯微鏡下觀測的半定量檢測，將切片分為“陰性”或“陽性”（1+、2+或3+）。免疫組織化學(xué)通過檢測異常細(xì)胞（如那些在癌性腫瘤中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞）而廣泛用于癌癥的診斷和/或隨訪（follow-up）?，F(xiàn)已知多種癌癥的特異性標(biāo)記物，如用于結(jié)腸癌實例中的癌胚抗原（CEA）、用于Hodgkin氏病的CD15和CD30、用于肝細(xì)胞癌實例中的甲胎蛋白、作為胃腸道間質(zhì)瘤標(biāo)記物的CD117、以及作為腫瘤增殖指標(biāo)之一的Ki-67。這些分子標(biāo)記物是某些細(xì)胞事件（如增殖或細(xì)胞死亡（凋亡））的特征。免疫組織化學(xué)還廣泛用于基礎(chǔ)研究，以用于理解生物組織不同部分表達(dá)的蛋白質(zhì)和生物標(biāo)記物的分布和定位。免疫組織化學(xué)使用兩類方法：直接方法和間接方法。直接方法僅包括一個著色步驟，并且該方法基于使用直接與組織切片中的抗原進(jìn)行反應(yīng)的經(jīng)標(biāo)記的抗體。雖然這一方法簡單快速，但由于缺少信號放大因而靈敏度低。間接方法包括使用未標(biāo)記的一抗（該一抗對感興趣的抗原具特異性）、以及經(jīng)標(biāo)記的二抗（該二抗識別用于制備一抗的動物物種的IgG）。由于每個一抗與數(shù)個二抗結(jié)合而放大了信號，因此這一方法比直接檢測方案更為靈敏。傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)技術(shù)在組織抗原的最終著色前需要多個步驟，而許多潛在的問題可能影響這一過程的結(jié)果。最常遇到的問題是背景噪聲過高、抗原標(biāo)記不充分以及自發(fā)熒光問題。為了降低與一抗或二抗和樣品中存在的蛋白間的非特異性結(jié)合相關(guān)的背景噪聲，一般將樣品與封閉一抗或二抗可能結(jié)合的反應(yīng)位點的緩沖液共同孵育。最常用的封閉緩沖液為：正常血清、脫脂奶粉、牛血清白蛋白（BSA）或明膠，并且其它具有特定配方的緩沖液也是可商購的。對于分析生物樣品、特別是組織的生物樣品的技術(shù)存在需求，該技術(shù)不具有傳統(tǒng)技術(shù)特別是在背景噪聲方面的缺陷。本發(fā)明使得能夠解決這些問題；本發(fā)明特別是顯著降低了使用傳統(tǒng)免疫組織化學(xué)方法（即，使用單一抗體檢測感興趣的蛋白）時觀測到的背景噪聲。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的為有利地使用FRET伴侶對（pairofFRETpartners）來對細(xì)胞表面或組織樣品中存在的蛋白進(jìn)行定量的方法。本發(fā)明的目的還為實施這一方法的試劑盒；以及在用于確定乳腺癌患者能否使用抗-HER2抗體進(jìn)行治療的治療診斷（theranostic）方法的情況下，將這一方法應(yīng)用于HER2蛋白的用途。術(shù)語“FRET伴侶對”是指由能量供體熒光化合物（下文稱為“供體熒光化合物”）和能量受體化合物（下文稱為“受體化合物”）所組成的對；當(dāng)它們彼此接近并且在供體熒光化合物的激發(fā)波長下被激發(fā)時，這些化合物發(fā)出FRET（“ResonanceEnergyTransfer”）信號。術(shù)語“FRET信號”是指代表供體熒光化合物及受體化合物之間的FRET的任何可測量信號。因此，F(xiàn)RET信號可以是供體熒光化合物或受體化合物（當(dāng)受體化合物為熒光化合物時）的發(fā)光強(qiáng)度或發(fā)光壽命的變化。當(dāng)以時間分辨測量FRET信號（一般為使用稀土元素螯合物或穴狀化合物的情況）時，使用術(shù)語TR-FRET（時間分辨FRET的首字母縮寫）。本發(fā)明的第一方面涉及用于對在細(xì)胞表面表達(dá)或存在于組織樣品中的感興趣的蛋白進(jìn)行定量的方法，所述方法包括如下步驟：（i）使表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞或組織樣品與第一配體和第二配體接觸，這些配體的每一種均能夠特異性地結(jié)合至所述蛋白的結(jié)構(gòu)域，并且這些配體分別標(biāo)記有供體化合物和受體化合物，所述供體化合物和所述受體化合物二者形成FRET伴侶對；（ii）清洗所述細(xì)胞或所述組織樣品；（iii）測量由測量介質(zhì)發(fā)射的FRET信號。術(shù)語“組織樣品”優(yōu)選意指取自患者的固態(tài)組織樣品，優(yōu)選為腫瘤組織提取物。術(shù)語“定量方法”意指用于相對定量的方法，即根據(jù)存在于樣品中的感興趣的蛋白的量，所測量的信號在不同樣品中將有所不同。這一技術(shù)與傳統(tǒng)免疫組織化學(xué)方法的不同之處在于，使用了對感興趣的蛋白具有特異性的兩種配體（特別是兩種抗體），而非現(xiàn)有技術(shù)方法中的只使用一種。由于這一方法允許在均質(zhì)介質(zhì)（homogeneousmedium）中進(jìn)行測量，因此還包括清洗步驟（在使用FRET技術(shù)時通常不進(jìn)行這一步驟）。這一方法與僅當(dāng)這些配體（或抗體）彼此接近時才發(fā)射FRET信號這一事實相聯(lián)合，得到的信噪比遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)方案（即使用單一配體或抗體的方案）中觀測到的信噪比。當(dāng)在組織樣品上實施所述方法時，需要以20μm-50μm厚度切片的形式制備這一樣品的步驟。這些制備步驟為本領(lǐng)域（即免疫組織化學(xué)）技術(shù)人員所常規(guī)使用的。這些步驟可特別在于由如下內(nèi)容組成：通過用甲醛處理而固定樣品、以及在石蠟中包埋所述樣品（特別是包埋為隨后能夠在切片機(jī)上進(jìn)行切割的塊狀（blocks）形式（優(yōu)選具有約20μm-50μm的厚度））。用二甲苯對這些切片進(jìn)行處理從而去除石蠟、用乙醇并隨后用水漂洗所述切片、以及借助HIER（“熱誘導(dǎo)的表位修復(fù)（heatinducedepitoperecovery）”的首字母縮寫）技術(shù)進(jìn)行表位重建均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)?；蛘?，根據(jù)本發(fā)明的方法也可在冷凍切片上實施，所述冷凍切片優(yōu)選為20μm-50μm厚，同樣也是根據(jù)傳統(tǒng)技術(shù)制備。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法在組織樣品上實施時，優(yōu)選包括在將熒光化合物引入測量介質(zhì)之前或之后，旨在以細(xì)胞裂解物的形式對該樣品進(jìn)行均質(zhì)化的步驟。這一步驟優(yōu)選在將熒光化合物（第一配體、第二配體以及任選的標(biāo)記試劑）引入測量介質(zhì)之后、對FRET信號進(jìn)行測量之前實施。這樣的處理可以是機(jī)械的，并可選自于應(yīng)用超聲波（聲波處理）、冷凍/解凍循環(huán)、使用機(jī)械研磨機(jī)，任選地與低滲裂解緩沖液或含有去污劑的裂解緩沖液（如RIPA緩沖液）共用。此外，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法在組織樣品上實施時，測量介質(zhì)中第一配體和第二配體的終濃度被確定為優(yōu)選大于10nM、優(yōu)選10nM-150nM或20nM-80nM、優(yōu)選30nM-60nM。術(shù)語“終濃度”意味著將所有試劑引入測量介質(zhì)后，這些化合物在測量介質(zhì)中的濃度。這些濃度范圍顯著高于TR-FRET類型分析中正常使用的濃度（其中，熒光配體的終濃度為1納摩爾的量級，即小于10nM）。所述方法還可在附著的細(xì)胞、或甚至懸浮的細(xì)胞上實施。然而，在后一種情況下，為實施所述清洗步驟，將需要至少一個離心步驟。優(yōu)選根據(jù)測量介質(zhì)中存在的生物材料（細(xì)胞或組織）的量，對FERT信號進(jìn)行歸一化。由此，在一個具體實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括在清洗步驟前，將所述細(xì)胞或所述組織樣品與用于DNA的熒光標(biāo)記的試劑（例如Hoechst33342）進(jìn)行孵育，并根據(jù)這一標(biāo)記試劑的發(fā)光所對應(yīng)的信號對所述FRET信號進(jìn)行歸一化。在一個優(yōu)選的實施方式中，第一配體和第二配體為識別感興趣的蛋白的抗體。這里，應(yīng)在廣義上理解術(shù)語“抗體”，該術(shù)語“抗體”包括免疫球蛋白家族的任何蛋白、或包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，以及特異性結(jié)合至感興趣的蛋白的位點。因此所述抗體可以是Fab或Fab′片段、單鏈抗體、或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用傳統(tǒng)技術(shù)制備對需要確定其表達(dá)的蛋白具有特異性的抗體。還可商購獲得多種抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員會注意對識別感興趣的蛋白上不同表位的抗體進(jìn)行選擇，從而能夠?qū)⑺隹贵w同時結(jié)合至該蛋白?？墒褂闷渌潴w代替抗體。由此，在本發(fā)明的一個具體實施方式中，第一配體為感興趣的蛋白的已知配體（如激動劑或拮抗劑）且不是抗體；第二配體為抗體。這里再次重申，優(yōu)選第一配體的結(jié)合位點與抗體的結(jié)合位點不同。若感興趣的蛋白為G蛋白偶聯(lián)受體，本領(lǐng)域技術(shù)人員將可參考Okuno等公開的數(shù)據(jù)庫（GLIDA:GPCRliganddatabaseforchemicalgenomicsdrugdiscoverydatabaseandtoolsupdate.Nucl.AcidsRes.，36（suppl_1），D907-912）來尋找能夠用于本發(fā)明所述方法的配體。感興趣的蛋白可以是任何由測量介質(zhì)中存在的細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)。本方法特別適合研究膜蛋白，如離子通道、受體，特別是G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）、受體酪氨酸激酶（RTK），例如EGFR（HER1）、HER2、HER3、HER4。所述方法特別有益于確定組織樣品、特別是腫瘤樣品中HER2蛋白的表達(dá)，從而確定能否對有關(guān)患者使用抗-HER2類型治療，特別是使用結(jié)合至HER2蛋白的抗體，如曲妥珠單抗（赫賽?。℉erceptin）TM）進(jìn)行治療。對此，將獲得的代表HER2表達(dá)的值與參比閾值相比較，高于所述參比閾值時傾向于對患者進(jìn)行抗-HER2類型治療。在第二方面，本發(fā)明因此涉及對能夠以結(jié)合至HER2蛋白的抗體進(jìn)行治療處理的癌癥患者進(jìn)行選擇的方法，該方法包括實施本發(fā)明所述的定量方法，其中所述蛋白為HER2。完全出乎意料地，本發(fā)明所述的方法使得能夠在“HercepTestTM陰性”患者（即，這一測試的結(jié)果使得不適合以曲妥珠單抗抗體對其進(jìn)行治療的患者（患者分類為0、1+、或2+））中明確地檢測HER2蛋白。由此，在一個對于臨床觀點而言特別有益的實施方式中，對HER2蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析結(jié)果為陰性（0、1+、以及2+）的患者的組織樣品實施本發(fā)明所述的方法。這一方法對于已進(jìn)行激素化學(xué)療法的患者十分有價值，特別是當(dāng)該激素化學(xué)療法并未改善該患者的狀況時更是如此。在一個優(yōu)選的實施方式中，感興趣的蛋白不同于以同二聚體形式組成性且專一性（constitutivelyandexclusively）表達(dá)的受體。當(dāng)感興趣的蛋白為EGFR（HER1）受體時，以FRET伴侶標(biāo)記的配體之一可以是抗-EGFR抗體，而另一配體可以是EGF或抗-EGFR抗體（抗-EGFR抗體可商購獲得）。當(dāng)感興趣的蛋白結(jié)構(gòu)為HER2蛋白時，第一配體和第二配體優(yōu)選為對HER2蛋白具有特異性的抗體，特別是其表位位于該受體胞外結(jié)構(gòu)域的抗體。如上所述，優(yōu)選這些表位是不同的。在第三方面，本發(fā)明涉及用于實施本發(fā)明所述的方法的試劑盒。該試劑盒包含第一配體和第二配體，這些配體的每一種均能夠特異性地結(jié)合至感興趣的膜蛋白的結(jié)構(gòu)域，并且這些配體分別標(biāo)記有供體化合物和受體化合物，所述供體化合物和所述受體化合物二者形成FRET伴侶對。這些配體的技術(shù)特征如上所述。對于使用傳統(tǒng)IHC測試（HercepTestTM）判斷不適合對其進(jìn)行抗-HER2類型治療的患者，本發(fā)明所述的用于對HER2蛋白進(jìn)行定量的試劑盒具有可觀的治療優(yōu)勢。因此該試劑盒（其中的配體為HER2蛋白特異性抗體）是特別優(yōu)選的。具體實施方式以能量供體或受體化合物標(biāo)記抗體通過傳統(tǒng)綴合技術(shù)，利用反應(yīng)基團(tuán)以熒光供體或受體化合物對配體或抗體進(jìn)行標(biāo)記。熒光供體或受體化合物通常以“官能化”的形式出售，即，其具有能夠與待標(biāo)記化合物（在這一情況下為配體）上存在的官能團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)。典型地，供體或受體熒光化合物上存在的反應(yīng)基團(tuán)是親電（electrophilic）基團(tuán)或親核（nucleophilic）基團(tuán)；所述基團(tuán)分別在合適的親核基團(tuán)或親電基團(tuán)存在下能形成共價鍵。例如，以下列出了親電/親核基團(tuán)對以及當(dāng)其成對出現(xiàn)時所形成的共價鍵類型：親電基團(tuán)親核基團(tuán)鍵類型丙烯酰胺硫醇硫醚酰鹵胺/苯胺酰胺（carboxamides）醛胺/苯胺亞胺醛或酮肼腙醛或酮羥胺肟烷基磺酸鹽/酯硫醇硫醚酸酐胺/苯胺酰胺芳基鹵化物硫醇硫醚芳基鹵化物胺芳基胺氮丙啶硫醇硫醚碳二亞胺羧酸N-酰基脲或酸酐活化的酯*胺/苯胺酰胺鹵代乙酰胺硫醇硫醚鹵代三嗪胺/苯胺氨基三嗪酰亞胺酯（imidoesters）胺/苯胺脒異氰酸鹽/酯胺/苯胺脲異硫氰酸鹽/酯胺/苯胺硫脲馬來酰亞胺硫醇硫醚磺酸酯胺/苯胺烷基胺磺酰鹵胺/苯胺磺胺*：術(shù)語“活化的酯”意味著式COY的基團(tuán)，其中Y為：·離去基團(tuán)，選自于琥珀酰亞胺氧基（-OC4H4NO2）和磺基琥珀酰亞胺氧基（-OC4H3NO2-SO3H）基團(tuán)；·未取代或取代的芳基氧基，所述取代為至少一個親電取代，如硝基、氟代、氯代、氰基或三氟甲基取代，從而形成活化的芳基酯；·以碳二亞胺基團(tuán)活化的羧酸，形成酸酐-OCORa或-OCNRaNHRb，其中Ra和Rb相同或不同，并選自于C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基、C1-C6烷氧基和環(huán)己基；·3-二甲氨基丙基或N-嗎啉基乙基?？缮藤彨@得的供體和受體熒光化合物通常包含馬來酰亞胺官能團(tuán)或活化的酯（多數(shù)通常以NHS（N-羥基琥珀酰亞胺）基團(tuán)活化），其分別與硫醇和胺基基團(tuán)反應(yīng)，因此可用于標(biāo)記抗體。標(biāo)記的抗體通過終摩爾比（FMR）表征（FMR表示接枝至配體的標(biāo)記分子的平均數(shù)量）。當(dāng)配體是天然蛋白質(zhì)時，優(yōu)選使用蛋白質(zhì)中天然存在的官能團(tuán)中的一種：氨基末端基團(tuán)（amino-terminalgroup）、羧基末端基團(tuán)（carboxylateterminalgroup）、天冬氨酸的羧基及谷氨酸的羧基、賴氨酸的氨基、精氨酸的胍基、半胱氨酸的巰基、酪氨酸的酚基、色氨酸的吲哚環(huán)、蛋氨酸的硫醚基團(tuán)、組氨酸的咪唑基團(tuán)。若配體在天然狀態(tài)下不包含官能團(tuán)，可引入此類官能團(tuán)。引入官能團(tuán)的方法在C.Kessler，Nonisotopicprobing，BlottingandSequencing，第二版；L.J.Kricka（1995）編，AcademicpressLtd.，London，p.66-72中有具體描述。另一種用熒光化合物標(biāo)記配體的方法在于將反應(yīng)基團(tuán)（例如NHS基或馬來酰亞胺基團(tuán)）引入配體，并使其與含有官能團(tuán)的熒光團(tuán)共存，該官能團(tuán)將與所述反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)從而形成共價鍵。對經(jīng)標(biāo)記的配體對于其受體是否保持足夠的親和性進(jìn)行驗證是重要的；這可簡單地通過傳統(tǒng)結(jié)合實驗進(jìn)行控制，從而能夠?qū)?jīng)標(biāo)記的配體對于受體的親和常數(shù)進(jìn)行計算。FRET伴侶對FRET伴侶對優(yōu)選由能量供體熒光化合物和能量受體熒光化合物組成。FRET定義為由能量供體和能量受體間的偶極-偶極相互作用導(dǎo)致的非輻射性能量轉(zhuǎn)移。這一物理現(xiàn)象要求這些分子間具有能量相容性（compatibility）。這意味著供體的發(fā)射光譜必須與受體的吸收光譜至少部分重疊。根據(jù)理論，F(xiàn)RET是依賴于受體和供體分子二者的間隔距離的過程：當(dāng)這些分子彼此接近時，將發(fā)射FRET信號。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)τ糜讷@得FRET信號的供體/受體熒光團(tuán)對進(jìn)行選擇。可用于研究FRET現(xiàn)象的供體-受體對在由JosephR.Lakowicz編寫的教科書（Principlesoffluorescencespectroscopy，第二版，Kluweracademic/plenumpublishers，NY（1999））中具體描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可加以參考。由于長壽命（>0.1ms，優(yōu)選在0.5ms-6ms之間）的能量供體熒光化合物、尤其是稀土元素螯合物或穴狀化合物能夠?qū)崿F(xiàn)時間分辨的測量，即在消除由測量介質(zhì)發(fā)出的自發(fā)熒光現(xiàn)象時測量TR-FRET（時間分辨FRET）信號，因此是優(yōu)選的。因此，通常優(yōu)選上述供體化合物來實施本發(fā)明所述的方法。鏑（Dy3+）、釤（Sm3+）、釹（Nd3+）、鐿（Yb3+）或鉺（Er3+）的配合物（complexes）是等同地適于本發(fā)明目的的稀土元素配合物，然而特別優(yōu)選銪（Eu3+）螯合物和穴狀化合物以及鋱（Tb3+）螯合物和穴狀化合物。已描述了大量稀土元素配合物，數(shù)種稀土元素配合物目前由PerkinElmer、Invitrogen和CisbioBioassays公司銷售。適于本發(fā)明目的的稀土元素螯合物或穴狀化合物的實例為：·包含一個或多個吡啶單元的鑭系元素穴狀化合物。此類稀土元素穴狀化合物已記載于例如專利EP0180492、EP0321353、EP0601113和國際申請WO01/96877中。鋱（Tb3+）穴狀化合物和銪（Eu3+）穴狀化合物特別適合于本發(fā)明的目的。鑭系元素穴狀化合物由CisbioBioassays公司銷售。通過非限定性實例的方式，可提及具有下式的銪穴狀化合物（可通過反應(yīng)基團(tuán)將其偶聯(lián)至待標(biāo)記的化合物，在此情況下，反應(yīng)基團(tuán)例如為NH2基團(tuán)）：·在專利US4761481、US5032677、US5055578、US5106957、US5116989、US4761481、US4801722、US4794191、US4637988、US4670572、US4837169和US4859777中有具體描述的鑭系元素螯合物。專利EP0403593、US5324825、US5202423和US5316909中記載了由九齒（nonadentate）配體（如三聯(lián)吡啶）形成的螯合物。鑭系元素螯合物由PerkinElmer公司銷售?！ひ部墒褂糜沈蟿ㄈ缢牡s環(huán)十二烷）形成的鑭系元素配合物，所述配合物用含有芳環(huán)的發(fā)色團(tuán)取代（如R.Poole等在Biomol.Chem，2005，3，1013-1024“Synthesisandcharacterizationofhighlyemissiveandkineticallystablelanthanidecomplexessuitableforusageincellulo”中記載的配合物）。還可使用申請WO2009/10580中記載的配合物?！み€可使用在專利EP1154991和EP1154990中描述的鑭系元素穴狀化合物?！ぞ哂邢率降匿堁罨衔铮赏ㄟ^反應(yīng)基團(tuán)將其偶聯(lián)至待標(biāo)記的化合物，在該情況下，反應(yīng)基團(tuán)例如為NH2基團(tuán)）：其合成在國際申請WO2008/063721中有描述（化合物6a，第89頁）?！碜杂贚umiphore公司的鋱穴狀化合物L(fēng)umi4-Tb，由CisbioBioassays出售?！ぞ哂邢率降膩碜杂赗esearchOrganics公司的量子染料（可通過反應(yīng)基團(tuán)將其偶聯(lián)至待標(biāo)記的化合物，在該情況下，反應(yīng)基團(tuán)為NCS）：·釕螯合物，特別是由釕離子及若干個聯(lián)吡啶組成的配合物，如三(2,2'-聯(lián)吡啶)釕(II)。·具有下式的鋱螯合物DTPA-cs124Tb，由LifeTechnologies公司出售（可通過反應(yīng)基團(tuán)R將其偶聯(lián)至待標(biāo)記的化合物），其合成在美國專利US5622821中有描述：·具有下式的鋱螯合物，其由Latva等（JournalofLuminescence1997，75：149-169）描述：特別優(yōu)選地，供體熒光化合物選自于：銪穴狀化合物、銪螯合物、鋱螯合物、鋱穴狀化合物、釕螯合物以及量子染料；特別優(yōu)選銪螯合物、銪穴狀化合物、鋱螯合物和鋱穴狀化合物。鏑（Dy3+）、釤（Sm3+）、釹（Nd3+）、鐿（Yb3+）或鉺（Er3+）的配合物也為適于本發(fā)明目的的稀土元素配合物。受體熒光化合物可選自于由下列化合物所組成的組：別藻藍(lán)蛋白，尤其是已知的商品名為XL665的別藻藍(lán)蛋白；發(fā)光有機(jī)分子，例如羅丹明、花青素（cyanines）（例如Cy5）、方酸菁（squaraines）、香豆素、原黃素（proflavins）、吖啶、熒光素（fluoresceins）、硼-二吡咯亞甲基衍生物（以“Bodipy”的名稱出售）、已知名稱為“Atto”的熒光團(tuán)、已知名稱為“DY”的熒光團(tuán)、已知名稱為“Alexa”的化合物和硝基苯并噁二唑。受體熒光化合物優(yōu)選選自于別藻藍(lán)蛋白、羅丹明、花青素、方酸菁、香豆素、原黃素、吖啶、熒光素、硼-二吡咯亞甲基衍生物和硝基苯并噁二唑。表述“花青素”和“羅丹明”分別應(yīng)理解為“花青素衍生物”和“羅丹明衍生物”。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種可商購的此類熒光團(tuán)?！癆lexa”化合物由Invitrogen公司出售；“Atto”化合物由Atto-tec公司出售；“DY”化合物由Dyomics公司出售；“Cy”化合物由AmershamBiosciences公司出售；其它化合物由多個化學(xué)試劑供應(yīng)商（如SigmaAldrich或Acros公司）出售。受體熒光化合物也可使用如下熒光蛋白：青色熒光蛋白（AmCyan1、Midori-IshiCyan、mTFP1），綠色熒光蛋白（EGFP、AcGFP、TurboGFP，Emerald、AzamiGreen、ZsGreen），黃色熒光蛋白（EYFP、Topaz、Venus、mCitrine、YPet、PhiYFP、ZsYellow1、mBanana），橙色和紅色熒光蛋白（Orangekusibari、mOrange、tdtomato、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、mTangerine、AsRed2、mRFP1、JRed、mCherry、mStrawberry、HcRed1、mRaspberry、HcRed-Tandem、mPlim、AQ143），遠(yuǎn)紅外熒光蛋白（mKate、mKate2、tdKatushka2）。對于本發(fā)明的目的，優(yōu)選使用花青素衍生物或熒光素衍生物作為受體熒光化合物。實施例實施例1將含有hEGFR編碼序列的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至NIH/3T3細(xì)胞（不表達(dá)人EGFR受體的小鼠成纖維細(xì)胞），并在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。獲得的表達(dá)hEGFR受體的品系隨后稱為P1。類似地（區(qū)別在于用含有潮霉素的選擇培養(yǎng)基），制備表達(dá)人HER2蛋白的品系（以下稱為“H2”）。通過將P1細(xì)胞異種移植至小鼠獲得腫瘤，根據(jù)傳統(tǒng)使用的方案將所述腫瘤在甲醛中固定，隨后在石蠟中包埋。用切片機(jī)對得到的塊狀物進(jìn)行切割（厚度約20μm），得到的FFPE（甲醛固定石蠟包埋）切片在eppendorf管中4℃儲存待用。將1.2mL二甲苯替代品（substitute）加至eppendorf管中的切片，孵育5min后，對所述管進(jìn)行離心（16000RCF），通過吸液除去上清液。重復(fù)1次相同步驟，然后添加1.2mL無水乙醇。孵育3min后，對管進(jìn)行離心（16000RCF），通過吸液除去上清液。重復(fù)1次相同步驟，隨后添加1.2mL95%乙醇。孵育3min后，對所述管進(jìn)行離心（16000RCF），通過吸液除去上清液。隨后添加1.2mL50%乙醇，孵育3min后，對所述管進(jìn)行離心（16000RCF），通過吸液除去上清液。加入0.5mL10mMTRIS-HCl+EDTA緩沖液（pH9），隨后封閉所述管并水浴加熱20min。冷卻（10min）后，對所述管進(jìn)行離心（16000RCF），通過吸液除去上清液。通過熱處理對切片的EGFR表位進(jìn)行重建（HIER為熱誘導(dǎo)的表位修復(fù)），在由180μl50mMHEPES緩沖液構(gòu)成的孵育緩沖液（pH為7）中重懸所述切片，在所述緩沖液中還含有蛋白酶抑制劑混合物、1%BSA、終濃度為50nM并標(biāo)記有穴狀化合物的EGFR特異性抗體Ab15（ThermoFisher）（CisbioBioassays）、以及終濃度為50nM并標(biāo)記有受體熒光團(tuán)d2（CisbioBioassays）的同為EGFR特異性的抗體REGF01（CisbioBioassays），其在665nm發(fā)射（REGF01-d2）。在20℃孵育16h后，添加20μl在緩沖液中為20μg/ml的Hoechst33342溶液，隨后，在孵育15min后，對所述管進(jìn)行離心（16000RCF），通過吸液除去上清液。在含有蛋白酶抑制劑混合物和0.1%BSA的300μl50mMHEPES緩沖液中重懸沉淀，對所述管進(jìn)行離心（16000RCF）。在相同緩沖液中重復(fù)清洗/離心循環(huán)兩次，并除去上清液。超聲處理（以20%的強(qiáng)度在Branson聲波儀上進(jìn)行5s）使其均質(zhì)化后，將100μl獲得的裂解物通過移液槍加至黑色（96孔）微板的B3和B4孔中。用類似的方式制備“陰性對照”樣品（不表達(dá)EGFR受體），只是所述樣品來自于由異種移植H2細(xì)胞的小鼠獲得的腫瘤。將100μl獲得的裂解物通過移液槍加至黑色微板的B1和B2孔中構(gòu)成陰性對照。在相鄰的孔中還放置了：僅緩沖液（BB：緩沖液空白）和100μl通過1/2連續(xù)稀釋（在HEPES緩沖液中，0.1%BSA）獲得的REGF01-d2和抗體混合物的稀釋液（孵育緩沖液），從而獲得0.16nM～5nM終濃度范圍的經(jīng)標(biāo)記的抗體（A3-A12孔）。隨后在TecanSafire2設(shè)備上以熒光模式進(jìn)行連續(xù)測量（“瞬時（prompt）熒光”延時=0；延時后測量時間=20μs），在640nm激發(fā)受體（d2）并在665nm讀取所發(fā)射的熒光，隨后在Pherastar設(shè)備上（用閃光燈激發(fā)）在340nm激發(fā)后，以時間分辨模式同時在620nm和665nm（延時=60μs；延時后測量時間=400μs）讀取熒光。以熒光模式在665nm（F665）對0.16nM-5nM范圍的孔進(jìn)行的測量使得能夠通過減去僅有緩沖液的熒光（B665）獲得與每孔校正后的熒光相關(guān)聯(lián)的校準(zhǔn)線（calibrationline）：F665c=F665-B665（見圖1）。通過插值（interpolation）獲得結(jié)合至生物材料的抗體濃度。表1特異性信號（REGF01-d2結(jié)合至EGFR）與陰性對照信號的比值為4.6/2.8=1.64，這是一個相當(dāng)?shù)偷男旁氡?。類似地，以TRF模式在620nm對0.16nM-5nM范圍的孔進(jìn)行的測量使得能夠通過減去僅有緩沖液的熒光（B620）獲得與每孔校正后的熒光相關(guān)聯(lián)的校準(zhǔn)線：E620c=E620-B620（見圖2）。表2特異性信號（結(jié)合至EGFR）與陰性對照信號的比值為2.72/0.8=3.4，這也是一個相當(dāng)?shù)偷男旁氡?。以TRF模式同時在620nm（供體的發(fā)光）和665nm（受體d2的發(fā)光）對板進(jìn)行測量。獲取表3中報導(dǎo)的下列值，用于校準(zhǔn)范圍。表3AbLumi4Tb（nM）0.160.310.631.252.55E6206650132002727053600106450210700E665609115023604630926018250繪制表示E665=f(E620)的圖，獲得直線，其斜率使得能夠?qū)θ缦逻M(jìn)行計算：相對于H2和P1樣品中在620nm測得的信號而言，鋱在665nm的殘余發(fā)射（residualemission）的貢獻(xiàn)（下表中稱為B665）。通過計算在665nm的信號（E665c）和鋱在665nm通道的殘余發(fā)射之差，計算在665nm恢復(fù)（restored）的FRET信號：Δ665=E665c-B665。在下表中，H460c對應(yīng)于通過傳統(tǒng)熒光模式測定的Hoechst33342化合物在460nm處的熒光。表4根據(jù)本發(fā)明獲得的特異性信號（REGF01-d2與結(jié)合至EGFR）與陰性對照信號的比值為26646/300=89，這是優(yōu)異的。這一實施例顯示，根據(jù)本發(fā)明的方法使得能夠在特異性信號和背景噪聲之間獲得優(yōu)異的信噪比（系數(shù)為89），而使用單個標(biāo)記的抗體最高僅能夠獲得系數(shù)為3.42的信噪比。實施例2將A431細(xì)胞系（ATCC/CRL-1555，每細(xì)胞表達(dá)約2×106EGFR受體（Shinobu，1984MolecularandCellularEndocrinology37，205））以每孔25000個細(xì)胞的密度分配至微滴定板（平底96孔黑色板）的孔中，在DMEM培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，從而獲得附著的細(xì)胞層。以100μlPBS清洗兩次后，在每孔中加入50μlKREBS緩沖液。[Krebs/HEPES緩沖液mmol/l：NaCl99；KCl4.69；CaCl21.87；MgSO41.2；K2HPO41.03；NaHCO325；Na-HEPES20+葡萄糖11.1mM+0.1%BSA，pH7.4]。在A1-A4孔中不加入其它試劑（緩沖液空白）。在A9-A12孔中加入10μl含有1μMEGF的KREBS（以飽和EGF結(jié)合位點），隨后將Ab10-d2抗體（以d2-NHS（CisbioBioassays）標(biāo)記的抗-EGFRAb10（ThermoFisherScientific），RMF=1.8）和EGF-Lumi4Tb（CisbioBioassays）的混合物加入A5-A12孔。以KREBS緩沖液將每孔中的體積補(bǔ)足至100μl，從而使得孔中Ab10-d2的終濃度為5nM且EGF-Lumi4Tb的終濃度為5nM。在相同微滴定板的孔中，通過在KREBS緩沖液中稀釋含有EGF-Lumi4Tb和Ab10-d2的儲液，形成標(biāo)準(zhǔn)范圍（1/2連續(xù)稀釋，從而獲得1nM至0.031nM的Ab終濃度）。在PherastarFS設(shè)備（BMG）上用如下參數(shù)進(jìn)行時間分辨模式讀取：在下表中示出獲得的E620c發(fā)射值（減去在僅含有緩沖液的A1和A2孔中測定的B620空白值后）。表5EGF-Lumi4Tb（nM）0.0310.0630.1250.250.51E620c63493014903050550010850E620c=f(EGF-Lumi4Tb)的圖使得能夠獲得E620c和EGF-Lumi4Tb的nM濃度之間的對應(yīng)關(guān)系（見圖3）。將板在20℃孵育4小時（黑暗中）后，向A3-A12孔添加10μlHoechst33342（2mg/mL在DMSO中的溶液，即時在KREBS中預(yù)稀釋至1/100th），并再在20℃孵育1小時。隨后以100μlKREBS緩沖液對所有孔清洗4次，再在每孔中加入100μl相同的緩沖液。以與上述相同的參數(shù)進(jìn)行時間分辨熒光讀取。表6為使細(xì)胞表達(dá)的EGFR受體的結(jié)合位點飽和，在孔中加入EGF（終濃度100nM）（A9-A12孔），從而能夠獲得E620c熒光值（平均值=1050AFU），其代表了對應(yīng)于標(biāo)記有Lumi4Tb的EGF與細(xì)胞的非特異性結(jié)合的背景噪聲。借助于校準(zhǔn)線，估計EGF-Lumi4Tb的結(jié)合為約0.096nM。EGF-Lumi4Tb與細(xì)胞的特異性結(jié)合（A5-A8孔）為約0.348nM。因此，當(dāng)使用感興趣受體的單一配體（EGF-Lumi4Tb）時，信噪比為3.6，這一數(shù)值相對較低。為將孔中細(xì)胞數(shù)量的變化（特別是由于在清洗中細(xì)胞的脫離）考慮在內(nèi)，使用Hoechst33342信號，通過將E620c信號除以用“傳統(tǒng)”熒光模式在460nm測定的每孔中Hoechst/DNA復(fù)合物的熒光值來進(jìn)行歸一化（并乘以100000從而得到整數(shù)）。表7根據(jù)Hoechst33342的信號對值進(jìn)行歸一化后，信噪比為3.78，這一數(shù)值同樣相對較低。測定經(jīng)標(biāo)記抗體（Ab10-d2）的結(jié)合：根據(jù)制造商的信息表，由于Ab10抗體干擾EGF與EGFR的結(jié)合，Ab10結(jié)合至與EGFR結(jié)合位點鄰近的表位。加入過量的EGF也應(yīng)干擾該抗體的結(jié)合，從而能夠通過加入過量的EGF來對這一抗體的非特異性結(jié)合進(jìn)行評估。通過在640nm對受體進(jìn)行激發(fā)并在680nm（考慮到濾光片的帶寬，可以將以“665nm”和“680nm”濾光片進(jìn)行的測量歸為一類，在兩種情況下，測定均對應(yīng)于“受體”通道）測定其發(fā)射（“瞬時熒光”），以熒光模式進(jìn)行熒光測量。利用Ab10-d2的校準(zhǔn)范圍（1nM-0.031nM），在減去于680nm測得的緩沖液空白后而來的E680c測定值使得能夠獲得結(jié)合至細(xì)胞的抗體濃度（以nM計）。表8因此，當(dāng)使用感興趣受體的單一配體（(Ab10-d2）時，信噪比為1.58，這一數(shù)值相對較低。通過TR-FRET測定熒光探針的結(jié)合：以類似的方式，以時間分辨模式在620nm和665nm測量含有EGF-Lumi4Tb和Ab10-d2稀釋液（1nM至0.031nM）的孔的信號。表9E620c63493014903050550010850E665c13431062204661210E665c和E620c的相關(guān)性直線使得能夠獲得鋱在665nm通道的發(fā)射貢獻(xiàn)：E665=0.102×E620，從而能夠獲得對應(yīng)于鋱發(fā)射貢獻(xiàn)的B665值。在665nm的時間分辨測量（參數(shù)如上）的結(jié)果在下表中歸類，其中Δ665=E665c–B665。表10在這一情況中，在665nm獲得的信號代表由供體（EGF-Lumi4Tb）通過FRET激發(fā)受體（Ab10-d2）所發(fā)射的信號。當(dāng)實施根據(jù)本發(fā)明的方法（即，使用兩個標(biāo)記有FRET伴侶的配體）時，信噪比為6.0，高于僅由標(biāo)記的配體或僅由標(biāo)記的抗體觀測到的信噪比。為將每孔中細(xì)胞數(shù)量的變化考慮在內(nèi)，使用Hoechst33342信號，通過將Δ665信號除以用“傳統(tǒng)”熒光模式在460nm測定的每孔中Hoechst/DNA復(fù)合物的熒光值來進(jìn)行歸一化（并乘以100000從而得到整數(shù)）。表11信噪比為6.29，因此高于僅由標(biāo)記的配體或僅由標(biāo)記的抗體觀測到的信噪比。實施例3將A431細(xì)胞系（ATCC/CRL-1555，每細(xì)胞表達(dá)約2×106EGFR受體（Shinobu，1984MolecularandCellularEndocrinology37，205））以每孔25000個細(xì)胞的密度分配至微滴定板（平底96孔黑色板）的孔中，在DMEM培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，從而獲得附著的細(xì)胞層。用2×100μlPBS清洗，然后在每孔中加入50μlKREBS緩沖液。[Krebs/HEPES緩沖液mmol/l：NaCl99；KCl4.69；CaCl21.87；MgSO41.2；K2HPO41.03；NaHCO325；Na-HEPES20+葡萄糖11.1mM+0.1%BSA，pH7.4]。在B1-B4孔中不加入其它試劑（緩沖液空白）。將Ab10-d2抗體（以d2-NHS（CisbioBioassays）標(biāo)記的抗-EGFRAb10（ThermoFisherScientific））和西妥昔單抗-Lumi4Tb（抗-EGFR）的混合物加入B5-B8孔，并以KREBS緩沖液將體積補(bǔ)足至100μl，從而使得孔中Ab10-d2的終濃度為5nM且西妥昔單抗-Lumi4Tb的終濃度為5nM。在相同微滴定板的孔中，通過在KREBS緩沖液中稀釋含有西妥昔單抗-Lumi4Tb和Ab10-d2的儲液，形成標(biāo)準(zhǔn)范圍（1/2梯度稀釋，從而獲得1nM至0.031nM的Ab終濃度）。在PherastarFS設(shè)備（BMG）上用如下參數(shù)進(jìn)行時間分辨模式讀取：為評估抗體與細(xì)胞表面的非特異性結(jié)合，將CHO（中國倉鼠卵巢）細(xì)胞與相同的經(jīng)標(biāo)記抗體的溶液進(jìn)行孵育，對孔進(jìn)行清洗并在相同條件下測量熒光。清洗后，僅由西妥昔單抗-Lumi4Tb發(fā)射的平均信號對于A431細(xì)胞為24033AFU（任意熒光單位），而對于CHO細(xì)胞是1170AFU，即信噪比為21。當(dāng)實施根據(jù)本發(fā)明的方法并測量FRET信號時，獲得明顯更好的信噪比，為約520。實施例4在這一實施例中，使用根據(jù)本發(fā)明的方法對患者腫瘤樣品（具體為乳腺腫瘤樣品）中EGFR和HER2蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量。以與實施例1類似的方式實施本方法：分別將和d2熒光團(tuán)（Cisbiobioassays）用作FRET伴侶的供體和受體。為測量EGFR的表達(dá)，分別以和d2熒光團(tuán)對所使用的西妥昔單抗（MerckKGaA）和Ab-10（ThermoScientific）抗體進(jìn)行標(biāo)記，該西妥昔單抗和Ab-10抗體識別EGFR的不同表位。為對HER2進(jìn)行定量，也分別將和d2熒光團(tuán)綴合至曲妥珠單抗抗體（RochePharmaAG）和FRP5抗體（在IMHarwerth等（1992）J.Biol.Chem.267：15160-15167中描述），該曲妥珠單抗和FRP5抗體對HER2的不同表位具有特異性。對于每種分析，在均以50nM含有兩種抗體的180μlTR-FRET緩沖液（1×PBS/10%BSA）中將50μm腫瘤的冷凍切片孵育過夜。隨后通過加入20μl0.1mg/ml的Hoechst33342（Invitrogen）溶液并在環(huán)境溫度下孵育10min，對DNA進(jìn)行染色。清洗和離心后，將樣品重懸在TR-FRET緩沖液中、進(jìn)行超聲處理并轉(zhuǎn)移至微板中。使用熒光計（BMGLabtech），在337nm激發(fā)后，以時間分辨模式（延時60μs，讀取窗400μs）分別在620nm和665nm測量和d2的熒光信號。以熒光模式在460nm測量Hoechst33342的信號。根據(jù)下式對這些信號進(jìn)行相對于背景噪聲的校正：F校正=F樣品-F背景噪聲，其中F背景噪聲的值通過測量僅有TR-FRET緩沖液的熒光獲得。此外，對于每種分析，在測量樣品的同時，在由含有50nM抗體和50nM抗體-d2混合物的儲液進(jìn)行1/2連續(xù)稀釋（從而獲得濃度范圍）而獲得的溶液上測量的熒光信號，并建立在每一抗體濃度下在665nm獲得的信號和在620nm測得的信號間的關(guān)系?；跇悠吩?20nm發(fā)射的信號，使用所生成的曲線計算熒光在665nm的貢獻(xiàn)（F665Tb）。用如下方式表示TR-FRET信號：ΔF665=F665樣品-F665Tb用DNA-Hoechst33342復(fù)合物在460nm的信號（F460）對TR-FRET信號進(jìn)行歸一化，從而將各測量介質(zhì)中存在的生物材料含量的變化考慮在內(nèi)，歸一化至平均值為100000熒光單位（FU）：TR-FRET歸一化的=(ΔF665×100000)/(F460)。歸一化的TR-FRET信號以FU表示。為將歸一化的TR-FRET信號轉(zhuǎn)化為每個細(xì)胞中受體的數(shù)量，首先在NIH/3T3EGFR、NIH/3T3HER2、NIH/3T3EGFR/HER2和SKOV-3細(xì)胞系中對每個細(xì)胞中受體的數(shù)量進(jìn)行評估。為此，如在先所描述的（Gaborit等，2011JBiolChem.，286（13）：11337-45），通過間接定量免疫熒光分析（QIFI試劑盒，Dako）用FACS對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行分析。并行地，使用TR-FRET分析對衍生自相應(yīng)腫瘤細(xì)胞的小鼠異種移植樣品的EGFR和HER2表達(dá)進(jìn)行測量。由此，基于EGFR和HER2的表達(dá)在細(xì)胞培養(yǎng)物和衍生自這些細(xì)胞的異種移植腫瘤中水平相當(dāng)?shù)募僭O(shè)，將由異種移植獲得的值作為將TR-FRET信號轉(zhuǎn)化為每細(xì)胞受體數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果：EGFR和HER2的表達(dá)由18個乳腺腫瘤樣品獲得的結(jié)果在圖4中給出。觀測到的表達(dá)的中位數(shù)水平（medianlevels）為2800EGFR/細(xì)胞（范圍為220～35500EGFR/細(xì)胞）以及49800HER2/細(xì)胞（范圍為11500～584000HER2/細(xì)胞）。18個腫瘤中的5個（即27.8%）表達(dá)超高水平的HER2（216800、234300、391000、491500和584000HER2/細(xì)胞）。平均來說，HER2表達(dá)水平比EGFR高66倍。通過對每一樣品重復(fù)三次實驗，驗證結(jié)果的可重復(fù)性。平均變異系數(shù)（CV）對于EGFR的定量分析為22%，而對于HER2為19%。由于各實驗中使用了不同的冷凍切片，這一變異考慮了生物可變性。為了確認(rèn)EGFR的定量，提取每個腫瘤的總RNA用于RT-qPCR分析。觀測到通過TR-FRET確定的EGFR的蛋白表達(dá)水平與通過RT-qPCR確定的EGFR的mRNA水平之間具有正線性相關(guān)（Rho=0.84，P<0.001）。為了驗證使用本發(fā)明所述的方法對HER2定量分析的結(jié)果，使用HercepTestTM，并借助FISH和定量PCR分析測量編碼HER2基因的擴(kuò)增，對HER2的表達(dá)進(jìn)行評估。這一分析的結(jié)果在圖5中給出，顯示通過TR-FRET確定的表達(dá)水平在HER2-HerceptestTM陽性腫瘤和HER2-HerceptestTM陰性腫瘤之間沒有重疊。僅5個具有>150000HER2/細(xì)胞的乳腺腫瘤具有3+的HercepTestTM得分，且在HER2基因擴(kuò)增測試中為陽性。這表明本發(fā)明所述的方法能夠以100%的特異性和靈敏度檢測腫瘤樣品中HER2的過表達(dá)，從而對于評估患者對于靶向HER2的特定抗癌治療（如用曲妥珠單抗、赫賽汀TM進(jìn)行的治療）的易感性特別有用。這是首次出現(xiàn)能夠評估患者樣品中每細(xì)胞的HER2蛋白數(shù)量的用于HER2定量的可靠方法（該方法例如可在醫(yī)院中實施）。該方法沒有免疫組織化學(xué)染色和FISH技術(shù)的缺點。實施例5通過如實施例4所述的方法對100個乳腺癌患者的腫瘤冷凍樣品的HER2表達(dá)進(jìn)行定量。經(jīng)歸一化的熒光信號的測定使得能夠?qū)ER2受體的表達(dá)進(jìn)行定量測定。對每個患者的無病生存率（DFS）和總生存率（OS）進(jìn)行評估。結(jié)果：在100個患者中，82個為IHC-HER2陰性（HercepTestTM陰性），包括60個ER（雌激素受體）陽性并接受激素治療的受試者。使用Cox比例風(fēng)險分析顯示，IHC-HER2陰性且ER陽性的受試者中，HER2的存在與DFS的降低（p=0.0005）和OS的降低（p=0.003）均顯著相關(guān)。使用根據(jù)本發(fā)明的方法對HER2表達(dá)的定量測量使得能夠預(yù)期IHC-HER2陰性且ER陽性的患有乳腺癌的受試者的疾病結(jié)果（outcome）。這一生物標(biāo)記物可用于識別激素治療未充分有效且可能受益于赫賽汀TM類的抗-HER療法的輔助治療的患者。本發(fā)明的一個主要貢獻(xiàn)在于能夠改進(jìn)對可能能對這類治療產(chǎn)生響應(yīng)的患者的選擇。當(dāng)前第1頁1 2 3