檢測生物分子的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于檢測存在于復(fù)雜生物樣品中生物分子的方法，其包括步驟：根據(jù)所述生物分子的至少一種物理性質(zhì)將所述生物樣品分離成多個(gè)級分；和特異性檢測存在于級分中的生物分子，使用至少一種基于固相的免疫檢測方法，所述免疫檢測方法使用可區(qū)分的微球，其對于每個(gè)級分是特異性的。
【專利說明】檢測生物分子的方法
[0001]本發(fā)明涉及一種方法，該方法使得可以檢測在生物材料中的生物分子，更具體地是蛋白和/或肽或消化而形成的肽的蛋白。
[0002]此類型的方法是從現(xiàn)有技術(shù)眾所周知的。
[0003]生物分子，更具體地來自少量的生物材料的蛋白和/或肽的特異性檢測，是用于研究和醫(yī)療診斷的重要要求。
[0004]因此，新開發(fā)的目的是增加已知檢測方法，更具體地是蛋白檢測方法的靈敏度。更具體地，目的是能夠在一個(gè)樣品中同時(shí)檢測和定量大量不同的蛋白或蛋白變體。
[0005]在蛋白的檢測中已帶來顯著進(jìn)步的技術(shù)發(fā)展具體是基于質(zhì)譜和微陣列的方法。
[0006]質(zhì)譜方法能夠從復(fù)雜的樣品中以明確的方式檢測大量不同的蛋白。盡管在分離和檢測技術(shù)中的巨大進(jìn)步，因?yàn)閬碜孕悠妨康牡鞍椎撵`敏的檢測經(jīng)常由于系統(tǒng)限制而不可能，所以靈敏度是此技術(shù)的關(guān)鍵問題。
[0007]第二個(gè)關(guān)鍵問題是質(zhì)譜分析相關(guān)的成本。為了允許特異性蛋白檢測，需要復(fù)雜和成本密集的樣品制備和蛋白分離技術(shù)，并且用于此目的所需的設(shè)備(即實(shí)際的質(zhì)譜儀)的成本非常高。
[0008]結(jié)果是質(zhì)譜分析在一些專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，并且只有一小部分可用的診斷檢測方法是基于這種技術(shù)。
[0009]因此免疫測定，如免疫組化、直接免疫測定和夾心免疫測定，在研究實(shí)驗(yàn)室中并也在臨床分析中是大大更為重要的分析方法。它們通常允許在復(fù)雜樣品中蛋白的特異性檢測而無需進(jìn)行復(fù)雜的樣品制備。
[0010]可實(shí)現(xiàn)的靈敏度可以達(dá)到低至飛摩爾的濃度范圍，且測量信號的特異性可以是非常聞的。
[0011]近年來，已做出了很大的努力，以將免疫測定從個(gè)別參數(shù)的確定變成多重格式，使其從而可以同時(shí)檢測大量不同蛋白。
[0012]例如，已經(jīng)開發(fā)了蛋白微陣列，其以在平面支持物上或微球上的固相測定法的形式，代表免疫測定的顯著的小型化，其允許來自幾微升樣品體積的幾十個(gè)到數(shù)百個(gè)不同蛋白的檢測和定量。
[0013]在這些基于抗體的方法中，問題首先是缺少結(jié)合親和性分子，即缺少抗體，其是靈敏和特異性的免疫測定的前提。第二個(gè)問題是所用的抗體彼此的交叉反應(yīng)性和與不同分析物蛋白的交叉反應(yīng)性。
[0014]當(dāng)同時(shí)檢測多于約20種蛋白時(shí)，這些限制經(jīng)常導(dǎo)致檢測方法的靈敏度明顯降低。
[0015]還已知免疫印跡，也稱為Wstern印跡，其首先包括在支持物基質(zhì)中使用凝膠電泳以根據(jù)它們的大小、電荷或其它物理性質(zhì)分離蛋白成帶(band)，并然后轉(zhuǎn)移這些帶到膜上，然后在那里蛋白可以進(jìn)行抗體結(jié)合事件。
[0016]此方法被如上述免疫測定的相同的缺點(diǎn)所阻礙。
[0017]鑒于上述情況，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供在開始時(shí)提到的那種類型的簡單且廉價(jià)地可實(shí)施的方法，使用該方法可以特異且靈敏地從少量的生物材料中檢測生物分子的多樣性，所述生物分子更具體是蛋白或肽，或消化而形成的肽的蛋白。
[0018]根據(jù)本發(fā)明，此目標(biāo)通過開始時(shí)提到的那種類型的方法實(shí)現(xiàn)，其包括步驟:
a)根據(jù)所述生物分子的至少一種物理性質(zhì)將所述生物樣品分離成多個(gè)級分；和
b)使用至少一種基于固相的免疫學(xué)檢測方法特異性檢測存在于級分中的生物分子，其涉及將所述生物分子從各個(gè)級分固定到對于每種級分是特異的并且彼此可區(qū)分的微球群體上。
[0019]本發(fā)明的目的以這種方式完全地實(shí)現(xiàn)。
[0020]在本發(fā)明的上下文中，“復(fù)雜生物樣品”被理解為意指含有多種生物分子的混合物的樣品，所述生物分子可以是天然來源的或其已合成制備/或通過遺傳改造制備。所述樣品還可以由小量組織(例如活組織檢查材料)或培養(yǎng)的細(xì)胞組成。
[0021 ] 在本發(fā)明的上下文中，生物分子被理解為是指源自以上述意義的生物樣品的分子，并且是可以進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法的。更具體地，以這種方式所定義的生物分子包括蛋白、妝和多糖。
[0022]步驟a)中的分離，例如通過柱層析法實(shí)現(xiàn)并且步驟b)中的特異性檢測使用微球?qū)崿F(xiàn)。
[0023]因此，根據(jù)本發(fā)明，復(fù)雜生物樣品的分級之后是使用基于微球的免疫測定(即多重的小型化的系統(tǒng))，以在一個(gè)免疫測定中從小的樣品量檢測數(shù)百個(gè)蛋白。
[0024]在步驟a)獲得的根據(jù)物理性質(zhì)的生物分子分離，即在級分中表現(xiàn)不同的物理性質(zhì)值的生物分子的集合，通過生物分子與微球的結(jié)合而被“凍結(jié)”。各個(gè)生物分子對級分的分配可以，即使在與來自一些或所有級分的微球混合后，隨后被再次回收和/或用于進(jìn)一步的分析，因?yàn)橛糜诓煌壏值奈⑶蚴潜舜丝蓞^(qū)別的-例如，通過它們的著色。
[0025]因此，根據(jù)本發(fā)明，首先使用物理方法分離生物分子，并將獲得的級分然后再固定在不同的微球群體上。
[0026]在此新方法中預(yù)料不到地是，在用未知的生物分子，更具體是蛋白/肽加載微球后可以進(jìn)行免疫分析，并且從而不需要質(zhì)譜分析。
[0027]例如然后表現(xiàn)為積累在微球(珠)上的生物分子在混合微球后在多重免疫測定中被檢測。對于此測定，所有珠群體(即，所有級分)可以被混合并且同時(shí)與一種抗體一起孵育。
[0028]所用的微球群體可以，例如是來自xMAP? technology of Luminex Corp.,Austin, Texas的那些。此技術(shù)使用多達(dá)500種不同的顏色編碼的微球群體或組，其可以在適當(dāng)?shù)淖x數(shù)器中個(gè)別地被識別。
[0029]對每組相同編碼的微球，可以測量結(jié)合到微球上的物質(zhì)的光學(xué)信號并作為加和信號輸出。
[0030]如果不同顏色編碼的微球組用多種物質(zhì)加載，則可以在一個(gè)分析操作中捕獲不同組的相同顏色編碼的微球的光學(xué)信號，并顯示出分配到相應(yīng)微球組的它們。
[0031 ] 因此，根據(jù)本發(fā)明，物理方法諸如一維或二維凝膠電泳或等電聚焦的分離能力結(jié)合基于珠的測定系統(tǒng)的靈活性和檢測靈敏度。
[0032]在新方法的一個(gè)實(shí)施方案中，樣品中存在的所有蛋白被變性，使用一維SDS凝膠電泳分離，和使用Western印跡法轉(zhuǎn)移到支持膜上并固定于其上。[0033]固定的蛋白的生物素化之后，此基質(zhì)然后切成約Icm寬和5-10cm長的列(column),并包含樣品的所有蛋白。之后,列切成0.5mm寬的條。然后蛋白從每個(gè)個(gè)別的條洗脫并在每種情況下結(jié)合到可區(qū)分的珠群體上。足夠的蛋白從每個(gè)條洗脫以包被幾千個(gè)微球。然后在直接的基于珠的免疫測定中生成信號，其需要每個(gè)測定約100個(gè)微球。因此，使用從一個(gè)級分生成的微球可以進(jìn)行幾百個(gè)測定。
[0034]鑒于上述情況，優(yōu)選的是如果在步驟a)中，生物樣品通過凝膠電泳分離，并且所獲得的帶模式(band pattern)優(yōu)選轉(zhuǎn)移到基質(zhì)上,其中優(yōu)選地轉(zhuǎn)移到基質(zhì)上的生物分子/蛋白被修飾，優(yōu)選被生物素化，以結(jié)合支持物分子，例如親和素或鏈親和素，并且如果進(jìn)一步優(yōu)選，在步驟a)中，基質(zhì)被機(jī)械地分成小的段并且生物分子之后從各個(gè)段洗脫到相應(yīng)級分，其中，優(yōu)選地所述基質(zhì)被切成至少一個(gè)列并且所述至少一個(gè)列被切成多個(gè)條，其中所述至少一個(gè)列被切成至少10個(gè)，優(yōu)選為20-200個(gè)條。
[0035]此凝膠電泳分離相對基于柱的方法的優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)平行分離很多樣品。進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是基于凝膠的方法的簡單和具有成本效益的實(shí)施。另外，結(jié)合到基質(zhì)的生物分子可以比存在于柱分離后的級分中的生物分子更有效地生物素化。
[0036]雖然也可以機(jī)械地劃分凝膠本身，即將其切成列和條，但在基質(zhì)的情況下，更具體地在Western印跡中使用的基質(zhì)的情況下，可以更容易和更有重現(xiàn)性地進(jìn)行此機(jī)械操作。
[0037]作為凝膠或基質(zhì)的機(jī)械劃分的結(jié)果，根據(jù)帶中物理性質(zhì)分離的生物分子/蛋白/肽分布到段/條，并且彼此空間分離。
[0038]在分離后不需要將凝膠染色，因?yàn)樗@得的帶對于新方法的進(jìn)一步的過程不一定是可視化的?？梢栽谖⑶蛩竭M(jìn)行檢查分離是否成功。
[0039]本發(fā)明從而提供了能夠使用多重免疫測定檢測在復(fù)雜樣品中存在的不同生物分子的方法。
[0040]優(yōu)選的是，如果在步驟b)中，來自至少幾個(gè)級分的生物分子包被的微球混合在一起，以形成預(yù)混物(master mix),并且優(yōu)選該預(yù)混物然后分成等分試樣,并且如果進(jìn)一步優(yōu)選地，在步驟b)中，特定結(jié)合分子，優(yōu)選抗體，被添加到所述至少一個(gè)等分試樣中，其中所述結(jié)合分子設(shè)計(jì)以發(fā)射優(yōu)選光學(xué)可檢測的信號，其中進(jìn)一步優(yōu)選，在步驟b)中，確定來自等分試樣的生物分子的可檢測的信號的強(qiáng)度，并根據(jù)微球群體分開地確定。
[0041]從預(yù)混物可以取得很多等分試樣，其每個(gè)針對抗體進(jìn)行測試。
[0042]在步驟a)中，蛋白可以在電泳分離之前被變性，其中在步驟a)中生物樣品可以在電泳分離之前預(yù)處理以將蛋白降解成肽片段，并且因此在步驟b)中，檢測這些肽片段。
[0043]根據(jù)一個(gè)改進(jìn)，來自一些或所有級分的生物分子在步驟a)中被進(jìn)一步處理，使得每個(gè)處理的級分產(chǎn)生在第一組的級分中至少一個(gè)級分，和優(yōu)選地在第二組級分中一個(gè)進(jìn)一步的級分，在所述第一和第二組級分中的生物分子根據(jù)翻譯后蛋白修飾而不同，優(yōu)選所述處理包括在第一組的級分中顯示一種類型的翻譯后修飾的生物分子的富集，并且進(jìn)一步優(yōu)選顯示所述一種類型的翻譯后修飾的生物分子在第二組級分中缺失，進(jìn)一步優(yōu)選地，在步驟b)中，來自一組的一些或所有級分的生物分子包被的微球被混合在一起以形成預(yù)混物。
[0044]這必須相對蛋白的翻譯后修飾的背景來看，所述修飾經(jīng)常決定蛋白的功能。因此，對于用于檢測生物分子的新方法的一個(gè)目標(biāo)是能夠區(qū)分修飾的和未修飾的蛋白。
[0045]但是，對于很多翻譯后修飾，沒有可以使用的選擇性結(jié)合修飾的或未修飾的蛋白的特異性結(jié)合分子。但是，可用的是一般性結(jié)合很多攜帶特定修飾的不同蛋白的結(jié)合劑。
[0046]翻譯后修飾其中包括乙?；?、磷酸化、甲基化、異戊烯化、泛素化、SUMO化、糖基化、O-N-乙酰糖胺化(o-N-acetylglcosaminylation)。修飾的更完整的列表可以見于http://en.wikipedia.0rg/wiki/Posttranslational modification。
[0047]一般地結(jié)合到具有相同修飾的不同蛋白的試劑包括針對這些結(jié)構(gòu)的抗體(例如，用于識別乙酰化的蛋白的抗乙酰賴氨酸抗體)，識別特定糖(例如凝集素)的結(jié)合蛋白，富集磷酸化蛋白(如鎵氧化物涂層的磁性微球)的固定的離子。
[0048]在步驟a)中已被分級的生物分子，可以根據(jù)它們的翻譯后修飾類型進(jìn)一步分級，使得第一組級分富含具有特定翻譯后修飾的生物分子。優(yōu)選地第二組缺失具有所述修飾的生物分子。為此，在步驟a)中獲得的幾個(gè)或所有級分可以進(jìn)一步使用通常結(jié)合具有特定類型的翻譯后修飾的生物分子但不區(qū)分具有相同修飾的不同蛋白的試劑，通過親和富集方法進(jìn)行處理。
[0049]在該進(jìn)一步處理后，一組或兩組級分進(jìn)一步如上述處理。來自每組的級分加載到對于每種級分特異性的微球上，混合入預(yù)混物，并且每種預(yù)混物分成等分試樣。
[0050]當(dāng)現(xiàn)在蛋白特異性抗體添加到每組級分的等分試樣時(shí)，人們可以從比較在原始樣品中兩組修飾和未修飾的蛋白的量的光學(xué)讀數(shù)進(jìn)行辨別。
[0051]這具有如下優(yōu)點(diǎn):可以分析所選擇的具有特定的翻譯后修飾的蛋白，盡管沒有可特異性結(jié)合到攜帶這種修飾的該選擇的蛋白的結(jié)合分子可利用。
[0052]由于使用新方法，可以使很大數(shù)量的不同的蛋白特異性抗體用于從一次電泳運(yùn)行獲得的級分，從一個(gè)小生物樣品中，可以分析很多這樣的蛋白的翻譯后修飾，盡管沒有特異性結(jié)合具有該修飾的蛋白的抗體可利用。
[0053]新方法具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。
[0054]令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)條從基質(zhì)上更窄地切出時(shí)，在每種情況下對于不同物理性質(zhì)值，即對于個(gè)別級分獲得的熒光信號更高。因此，機(jī)械劃分的分辨率影響新方法的靈敏度。
[0055]使用小量樣品材料，其可以進(jìn)行大量測量。如通常用于在Western印跡中的蛋白的檢測的，使用10 Pg蛋白，其可以產(chǎn)生預(yù)混物，使用該預(yù)混物可以進(jìn)行幾百個(gè)測量。
[0056]從20000至50000個(gè)細(xì)胞或5至2(^g細(xì)胞蛋白，根據(jù)本發(fā)明人的最初實(shí)驗(yàn)可以檢測幾十到幾百個(gè)不同的蛋白。
[0057]例如，在等分取樣后，可以使多達(dá)96種不同的抗體結(jié)合來自Western印跡泳道(lane)的材料，并且從而多達(dá)上千個(gè)測量是可能的。這允許全面表征所研究的材料，并且從而甚至細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)例如磷酸化級聯(lián)反應(yīng)的研究也是可能的。
[0058]新方法還展示了非常好的分辨率。Western印跡泳道可以，例如，分成多達(dá)96個(gè)級分。因此，以不同分子量的多個(gè)亞型存在的蛋白、處理的蛋白和修飾的蛋白可以被區(qū)分并且可以使用抗體檢測。
[0059]因?yàn)榈鞍椎姆旨壥褂媚z電泳，所以現(xiàn)在可以增加非特異性抗體的使用，并且從而可以避免在開始時(shí)提到的問題。
[0060]此外，該系統(tǒng)具有良好的動態(tài)范圍，因?yàn)樘禺愋孕盘柺菑年栃约壏智蠛?。使用不同抗體的實(shí)驗(yàn)揭示，具有良好線性的超過10000的動態(tài)范圍是可能的。
[0061 ] 在實(shí)驗(yàn)中摻入重組融合蛋白顯示使用此內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)在蛋白的定量是可能的。[0062]通過混合固定化在不同珠群體上的樣品并在一個(gè)反應(yīng)中測量混合的樣品，不同樣品的可比較的測量和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化是可能的。這是尤其相關(guān)的，因?yàn)橐赃@種方式腫瘤組織和正常組織，或在治療之前和之后的腫瘤組織，可以在一個(gè)單一的測量中比較。
[0063]在限制樣品量的情況下，例如在臨床腫瘤材料的情況下或在進(jìn)行激光捕獲顯微切割后獲得的腫瘤細(xì)胞群的情況下，新方法的使用是尤其有意思的。因此，可以檢測腫瘤標(biāo)志物并且可以進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分析。
[0064]此外，新方法可以在修飾的蛋白的分析中使用。例如，在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的背景下，磷酸化可以被檢測到。此外，可以檢測到表觀遺傳變化，例如組蛋白修飾。
[0065]在兩種檢測方法的這種結(jié)合中尤其令人驚訝的是，當(dāng)切出的帶更窄時(shí)，在加載的微球的分析中信號-噪聲比更好，因?yàn)榍谐鰩г秸?，洗脫的蛋白“越純”?br> [0066]結(jié)合到膜上的蛋白的生物素化允許甚至小量蛋白固定化到微球上。生物素-鏈霉親和素相互作用的非常高的親合力的結(jié)果是鏈霉親和素珠可以加載甚至很少的材料并且實(shí)現(xiàn)良好的包被密度。
[0067]進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)從說明書和所附的附圖是顯而易見的。
[0068]可以理解，不僅在每種情況中指示的組合中，而且在其它組合中或單獨(dú)的，上面提及的特征和那些將在下文解釋的特征是可用的，而不偏離本發(fā)明的范圍。
[0069]本發(fā)明在下文通過實(shí)施例進(jìn)行描述，其通過圖進(jìn)行解釋，其中 圖1A到H顯示新方法的個(gè)別方法步驟。
[0070]圖2A和B顯示關(guān)于從人肝細(xì)胞系檢測ERK1/ERK2的兩個(gè)柱狀圖；
圖3A和B顯示關(guān)于在人肝細(xì)胞系中ERKl的定量的兩個(gè)柱狀圖和回歸曲線。
[0071]圖4A和B顯示關(guān)于在腫瘤組織中ERK1/ERK2的檢測的兩個(gè)柱狀圖；和
圖5A和B每個(gè)顯示關(guān)于在兩個(gè)不同腫瘤組織中調(diào)節(jié)子活化的檢測的兩個(gè)柱狀圖。
[0072]實(shí)施例1:從少暈生物材料中檢測蛋白
圖1A到H簡單地顯示，從A開始，新方法的基本步驟。
[0073]首先，存在于復(fù)雜的生物樣品中的蛋白根據(jù)習(xí)慣方案被變性。
[0074]之后，蛋白根據(jù)分子量通過在SDS-凝膠上的凝膠電泳分離(圖1A)。此帶模式然后(如在Western印跡的情況下)轉(zhuǎn)移到結(jié)合蛋白的膜上(圖1B)。
[0075]現(xiàn)在結(jié)合到膜上的蛋白通過引入生物素被修飾(圖1C)。蛋白帶現(xiàn)在存在于彼此相鄰的多個(gè)列上。這些列之一現(xiàn)在從膜上機(jī)械切出，并切成很多窄的條(圖1D)。
[0076]可以看出，在列的縱向方向上，條是如此之短，以至于一個(gè)蛋白帶可以拆分到幾個(gè)相鄰的條。
[0077]對于每個(gè)條，蛋白現(xiàn)在洗脫到水溶液中，并且從而從一個(gè)膜條生成20至200個(gè)級分(圖1E)。
[0078]現(xiàn)在向每個(gè)級分中添加可區(qū)分的顏色編碼的微球群體，每個(gè)微球具有鏈霉親和素包被，并且從而蛋白固定化到微球上(圖1F)。這生成20至200個(gè)微球群體，其加載有來自不同條的蛋白并可以經(jīng)由它們的顏色編碼而區(qū)分。
[0079]這些微球群體然后首先混合在一起，隨后混合物然后分成至多達(dá)500個(gè)等分試樣。每個(gè)等分試樣包含至少100個(gè)來自每個(gè)級分的微球。向每個(gè)等分試樣現(xiàn)在添加特定抗體，其特異性地結(jié)合復(fù)雜的樣品中在待檢測的蛋白之一(圖1G)。[0080]這些抗體是，例如，熒光標(biāo)記的，并且從而特定蛋白可以通過顏色信號(條的鑒定)和熒光信號(識別的蛋白)的測量值與對于每個(gè)微球群體熒光信號的加和的組合來鑒定和定量。
[0081]如果熒光加和的信號相對經(jīng)由微球群體鑒定的級分，即相對分子量，顯示，然后特異性的(圖1H中陰影的)可以與非特異性的(圖1H中灰白的)區(qū)分并定量。
[0082]在圖1E和F的步驟之間，在幾個(gè)或所有級分中的生物分子對于特定翻譯后修飾可以進(jìn)行親和性富集。通過此，從每個(gè)這樣處理過的級分中，產(chǎn)生一個(gè)已富集所有顯示翻譯后修飾的生物分子的級分。此外，可以獲得第二級分，其中攜帶修飾的生物分子被缺失。
[0083]可以通過孵育初始級分與固定化的結(jié)合劑(例如，遺傳修飾特異性抗體)并且從而使初始級分缺失攜帶此修飾的生物分子進(jìn)行此富集。通過洗脫步驟，修飾的生物分子被釋放并且被發(fā)現(xiàn)富集在新的級分中。對于不同的翻譯后修飾，可以按順序重復(fù)進(jìn)行該方法。
[0084]這產(chǎn)生第一組含有被富集的攜帶修飾的生物分子的級分，和優(yōu)選第二組，其中攜帶修飾的生物分子被缺失。
[0085]如上文所詳述，通過添加微球，將級分混合到預(yù)混物中并將預(yù)混物分成多個(gè)等分試樣進(jìn)一步處理每組級分。
[0086]通過向每個(gè)等分試樣中添加蛋白特異性抗體，人們現(xiàn)在可以從第一組級分分析攜帶修飾的蛋白。此外，通過比較來自第一和第二組的相關(guān)級分，人們可以至少半定量地確定修飾的蛋白的配給(rat ion)。
[0087]實(shí)施例2:在人肝細(xì)朐系中檢測ERKl和ERK2
使用圖1中顯示的方法，測試來自人肝細(xì)胞系(HepG2)的15Pg蛋白提取物在SDS凝膠電泳后在Western印跡中蛋白ERKl和ERK2的存在。
[0088]在第一分析(A)中使用識別蛋白ERKl和ERK2的第一抗體。在第二分析(B)中使用識別磷酸化的ERKl和ERK2的第二抗體。
[0089]測量的是對于96個(gè)珠群體的熒光加和信號，所述珠群體在每種情況下用從膜條上洗脫的蛋白包被。對于測量，混合所有96個(gè)珠群體，并且將100000個(gè)珠子與抗體孵育，即約每個(gè)群體1000個(gè)珠子。
[0090]圖2顯示表征測量信號強(qiáng)度和斑點(diǎn)條的圖像(它已在標(biāo)準(zhǔn)的Western印跡中顯現(xiàn)(developed))的兩個(gè)柱狀圖。
[0091]兩種蛋白可以被區(qū)分和定量。
[0092]實(shí)施例3 =ERKl在人肝細(xì)胞系中的定暈
在每種情況下，將來源于人肝細(xì)胞系H印G2的20 μδ細(xì)胞裂解物應(yīng)用到SDS聚丙烯酰胺凝膠上4個(gè)泳道中。
[0093]向第一樣品添加20ng純化的GST-ERK1融合蛋白，向下一個(gè)樣品添加4ng，然后
0.8ng，然后0.16ng。電泳分離后，蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，并使用生物素修飾。
[0094]四個(gè)個(gè)別的泳道每個(gè)隨后切成60個(gè)條，并且蛋白從條的表面溶解；從單個(gè)條生成的洗脫物固定在60個(gè)可以區(qū)分的微球群體上并且混合以形成預(yù)混物。
[0095]從而，在該實(shí)驗(yàn)中，有4個(gè)批次，其包含等量的HepG2細(xì)胞裂解物(并且從而也包含等量的內(nèi)在ERKl和ERK2)但是不同的限定量的GST-ERKl融合蛋白。
[0096]作為4個(gè)樣品與特異性抗ERK抗體孵育的結(jié)果，可以生成對ERK1、ERK2和GST-ERKl融合蛋白的測量信號(相對熒光強(qiáng)度)。對于測量，100000個(gè)珠(其對應(yīng)每群體約1000個(gè)珠)與ERK1/2特異性抗體一起孵育。對于已知量的融合蛋白的信號用于產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且此曲線用于計(jì)算ERKl的絕對量。
[0097]在圖3A中的柱狀圖顯示對包含4ng的GST-ERKl融合蛋白的H印G2樣品的信號；在分子量 65kDa、42kDa 和 39kDa 的峰對應(yīng) GST-ERKl、ERK2 和 ERKl。
[0098]圖3B的右手側(cè)顯示4條泳道中內(nèi)在ERKl的相對熒光強(qiáng)度。
[0099]實(shí)施例4:以有限的暈存在的腫瘤材料的分析
切割冷凍的腫瘤組織并進(jìn)行組織學(xué)評價(jià)。在所檢查的切片中，可以鑒定兩個(gè)組織學(xué)可區(qū)分的腫瘤區(qū)域。
[0100]使用激光顯微切割,從兩個(gè)區(qū)域可以取出約20000個(gè)細(xì)胞。所包含的蛋白溶解在包含去垢劑的裂解緩沖液中。
[0101]對于兩個(gè)腫瘤區(qū)域，根據(jù)圖1的方法用于通過凝膠電泳根據(jù)大小分離蛋白，并且在每種情況下生成96個(gè)蛋白級分。兩個(gè)腫瘤區(qū)域的級分固定化在192個(gè)可區(qū)分的珠群體上。將這些合并用于測量。從而，對于兩個(gè)樣品可以在一個(gè)測定中比較地測試蛋白表達(dá)中的差異。
[0102]新方法的主要優(yōu)點(diǎn)在于現(xiàn)在可能的分析的數(shù)目。使用可用的20000個(gè)細(xì)胞，可以進(jìn)行多達(dá)200個(gè)測定。使用常規(guī)Western印跡，使用此材料僅可以進(jìn)行1_8個(gè)測定。
[0103]在比較性的分析中研究了 54種蛋白的表達(dá)。對于所研究的大部分分析物(45/54)，樣品間沒有檢測到明顯的表達(dá)中的變化；參見圖4，其中熒光加和信號仍然相對分子量顯示。
[0104]從圖4可以看見，使用ERK1/2特異性抗體可以檢測ERKl (陰影柱形)和ERK2 (灰色柱形)的總量的表達(dá)。兩種蛋白都是可檢測的，沒有發(fā)現(xiàn)激酶之間的表達(dá)中的差異。
[0105]對于大部分分析物檢測到了顯著的變化。特別重要的是細(xì)胞生長的中心調(diào)節(jié)子(regulator)的活化的檢測。
[0106]使用特異性抗體，確定了來自腫瘤A和腫瘤B的調(diào)節(jié)子的總量的表達(dá)，參見圖5A。
[0107]使用活化特異性抗體，進(jìn)一步確定了活化的調(diào)節(jié)子的量，參見圖5B。這揭示了對于腫瘤B:腫瘤A的83:1的比例。
【權(quán)利要求】
1.檢測存在于復(fù)雜生物樣品中生物分子的方法，其包括步驟: a)根據(jù)所述生物分子的至少一種物理性質(zhì)將所述生物樣品分離成多個(gè)級分；和 b)使用至少一種基于固相的免疫學(xué)檢測方法特異性檢測存在于級分中的生物分子，其涉及將來自各個(gè)級分的生物分子固定到對于每個(gè)級分是特異的并且彼此可區(qū)分的微球群體上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在步驟a)中，所述生物樣品通過凝膠電泳分離。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于，在步驟a)中，所獲得的帶模式轉(zhuǎn)移到基質(zhì)上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述分離的生物分子是修飾的，優(yōu)選生物素化的，用于結(jié)合支持物分子例如親和素或鏈霉親和素。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的方法，其特征在于，在步驟a)中，所述基質(zhì)機(jī)械劃分成小的區(qū)段，并且生物分子此后從各個(gè)區(qū)段上洗脫到相應(yīng)級分中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述基質(zhì)被切成至少一個(gè)列，并且所述至少一個(gè)列被切成多個(gè)條，并且所述生物分子此后從各個(gè)條上洗脫到相應(yīng)級分中。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于所述至少一個(gè)列被切成至少10，優(yōu)選20-200個(gè)條。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其特征在于，在步驟a)中來自一些或所有級分的生物分子被進(jìn)一步處理，使得每個(gè)處理過的級分至少產(chǎn)生在第一組級分中的一個(gè)級分，和優(yōu)選在第二組級分中的一個(gè)級分，在第一和第二組級分中的生物分子根據(jù)翻譯后蛋白修飾而不同。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征在于所述處理包括在第一組的級分中顯示一種類型的翻譯后修飾的生物分子的富集，和優(yōu)選地在第二組的級分中顯示所述一種類型的翻譯后修飾的生物分子的缺失。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，其特征在于，在步驟b)中，來自一組的一些或所有級分的所述生物分子包被的微球混合在一起以形成預(yù)混物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其特征在于，在步驟b)中，來自一些或所有級分的所述生物分子包被的微球混合在一起以形成預(yù)混物。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的方法，其特征在于，在步驟b)中，所述預(yù)混物被分成等分試樣。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于，在步驟b)中，特定結(jié)合分子例如抗體被添加到至少一個(gè)等分試樣，其中所述結(jié)合分子設(shè)計(jì)以發(fā)射優(yōu)選光學(xué)可檢測的信號。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其特征在于，在步驟b)中，對于來自等分試樣的生物分子確定可檢測的信號的強(qiáng)度，并且根據(jù)微球群體分開地確定。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法，其特征在于，在步驟a)中，所述生物分子在電泳分離前被變性。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述生物分子是蛋白。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其特征在于，在步驟a)中，所述生物樣品在分離前預(yù)處理以降解蛋白成肽片段，并且在步驟b)中，所述肽片段被檢測。
【文檔編號】G01N33/68GK103917873SQ201280047533
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月28日
【發(fā)明者】M.滕普林, F.特賴因德爾, A.德廷格, O.佩茨 申請人:圖賓根埃伯哈德·卡爾斯大學(xué)