血清及其它生物基質(zhì)中的分析物的量化的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于量化生物樣本中的分析物的方法及系統(tǒng)，其包含：制備生物樣本以用于質(zhì)譜分析；利用離子化源將所述所制備生物樣本的至少一部分離子化以產(chǎn)生經(jīng)離子化分析物流；將所述經(jīng)離子化分析物流引入到設(shè)定于經(jīng)選擇以從所述經(jīng)離子化分析物流萃取經(jīng)離子化分析物分子的補(bǔ)償電壓下的差分遷移率光譜儀中；將所述差分遷移率光譜儀的輸出分析物流引入到質(zhì)譜儀中以檢測(cè)及量化所述輸出分析物流中的分析物離子。
【專利說(shuō)明】血清及其它生物基質(zhì)中的分析物的量化
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)案奪叉參考
[0002] 本申請(qǐng)案請(qǐng)求在2011年10月26日提出申請(qǐng)的第61/551，489號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案 的優(yōu)先權(quán)，所述美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案以全文引用的方式并入本文中，且本申請(qǐng)案請(qǐng)求在2012年 10月10日提出申請(qǐng)的第61/711,871號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案的優(yōu)先權(quán)，所述美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案以 全文引用的方式并入本文中。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明一般來(lái)說(shuō)涉及用于使用質(zhì)譜來(lái)檢測(cè)及量化例如血清及其它生物樣本等樣 本中的分析物的方法及系統(tǒng)。

【背景技術(shù)】
[0004] 復(fù)雜基質(zhì)內(nèi)所含的分析物的質(zhì)譜檢測(cè)及量化通常需要高分辨率分離技術(shù)以減小 干擾樣本內(nèi)的物質(zhì)的效應(yīng)。以舉例的方式，大多數(shù)質(zhì)譜分析利用液相色譜分離技術(shù)以改善 所關(guān)心分析物的下游光譜檢測(cè)的選擇性。盡管此些分離技術(shù)可產(chǎn)生較準(zhǔn)確的量化，但樣本 制備及色譜分離兩者均耗時(shí)且成本高，因此減小通量。
[0005] 因此，需要具有增加的通量同時(shí)允許復(fù)雜生物樣本中的所關(guān)心分析物（例如，血 清中的睪丸激素及維生素D)的選擇性檢測(cè)及量化的方法及系統(tǒng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 根據(jù)各種實(shí)施例，本文提供用于使用質(zhì)譜來(lái)檢測(cè)及/或量化樣本中的分析物的方 法及系統(tǒng)。如下文所描述，這些方法及系統(tǒng)可在不使用耗時(shí)的分離技術(shù)的情況下實(shí)現(xiàn)復(fù)雜 基質(zhì)中的分析物的檢測(cè)及/或量化。以舉例的方式，可利用激光解吸熱離子化結(jié)合差分 遷移率光譜法而快速地量化多個(gè)生物樣本（例如，血清）中的睪丸激素及維生素D的濃 度。在各種實(shí)施例中，分析物可包含25-0H-維生素D3。在各種實(shí)施例中，分析物可包含 25-0H-維生素D2。在各種實(shí)施例中，離子遷移率光譜儀可包含（舉例來(lái)說(shuō)）差分遷移率光 譜儀（DMS)、各種幾何形狀的FAMS裝置，例如平行板、彎曲電極或圓柱形FAMS裝置及其 它。在許多實(shí)施例中，此可在在離子化之前不使用液相色譜分離技術(shù)的情況下執(zhí)行。
[0007] 根據(jù)各種實(shí)施例，揭示一種量化生物樣本中的分析物的方法。所述方法包括制備 用于質(zhì)譜分析的生物樣本及利用離子化源以將所述所制備生物樣本的至少一部分離子化 從而產(chǎn)生經(jīng)離子化分析物流。將所述經(jīng)離子化分析物流引入到設(shè)定于經(jīng)選擇以從所述經(jīng)離 子化分析物流萃取經(jīng)離子化分析物分子的補(bǔ)償電壓下的差分遷移率光譜儀，且將所述差分 遷移率光譜儀的經(jīng)輸出分析物流引入到質(zhì)譜儀中以檢測(cè)及量化所述經(jīng)輸出分析物流中的 分析物離子。在各種實(shí)施例中，所述分析物可包含睪丸激素。在各種實(shí)施例中，所述分析物 可包含維生素D。在各種實(shí)施例中，所述分析物可包含25-0H-維生素D3。在各種實(shí)施例中， 所述分析物可包含25-0H-維生素D2。
[0008] 在一個(gè)方面中，離子化源可包括激光二極管熱解吸（LDTD)離子化源。在一些實(shí)施 例中，離子化源可包括二極管激光器以將熱能賦予所制備生物樣本以解吸所述生物樣本的 至少一部分。在相關(guān)方面中，離子化源可包括用于將經(jīng)解吸生物樣本離子化的APCI離子化 器。
[0009] 在各個(gè)方面中，質(zhì)譜儀可包含串聯(lián)質(zhì)譜儀。舉例來(lái)說(shuō)，串聯(lián)質(zhì)譜儀可為三重四極質(zhì) 譜儀。在一個(gè)方面中，所述方法可包括具有約289/97、289/109及292/97的m/z值的至少 一個(gè)前驅(qū)物-產(chǎn)物離子對(duì)躍遷。在一個(gè)方面中，所述方法可包括檢測(cè)具有約401. 3/365. 2、 401. 3/257. 1及401. 3/201. 1的m/z值的至少一個(gè)前驅(qū)物產(chǎn)物離子對(duì)躍遷。在各種實(shí)施 例中，所述方法可包括檢測(cè)具有約413. 3/355. 2及413. 3/337. 2的m/z值的至少一個(gè)前驅(qū) 物-產(chǎn)物離子對(duì)躍遷。
[0010] 所述差分遷移率光譜儀可具有各種配置。舉例來(lái)說(shuō)，補(bǔ)償電壓可為約4伏。以此 方式，所述差分遷移率光譜儀可優(yōu)先傳輸睪丸激素（舉例來(lái)說(shuō)）。在各種實(shí)施例中，補(bǔ)償電 壓可在約4伏到約12伏的范圍內(nèi)。在各個(gè)方面中，補(bǔ)償電壓可在約4伏到約14伏的范圍 內(nèi)。
[0011] 在一些方面中，生物樣本可在不需要液相色譜分離的情況下制備。在相關(guān)方面中， 可通過(guò)執(zhí)行液-液萃取且在離子化步驟之前將生物樣本干燥來(lái)制備樣本。在一些實(shí)施例 中，所述離子化源可快速地將多個(gè)樣本離子化。舉例來(lái)說(shuō)，在將第一生物樣本離子化的約10 秒內(nèi)，離子化源可將額外所制備生物樣本的至少一部分離子化以產(chǎn)生額外經(jīng)離子化分析物 流。在各種實(shí)施例中，所述生物樣本可安置于所述離子化源的樣本板上。舉例來(lái)說(shuō)，所述生 物樣本可為干的。
[0012] 在一些方面中，生物樣本可為血液、血漿、血清、口液及尿液中的一者。在一些實(shí) 施例中，可以約0. Ing/mL的定量限制來(lái)檢測(cè)生物樣本中的分析物。換句話說(shuō)，本文所描述 的方法能夠檢測(cè)生物樣本中的低至〇. Ing/mL的分析物濃度。在各種實(shí)施例中，分析物可 包含睪丸激素。在各種實(shí)施例中，分析物可包含維生素D。在各種實(shí)施例中，分析物可包含 25-0H-維生素D3。在各種實(shí)施例中，分析物可包含25-0H-維生素D2。
[0013] 在一個(gè)方面中，揭示一種質(zhì)譜系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包括離子化源，所述離子化源具有經(jīng) 配置以將熱施加到樣本以致使所述樣本的至少一部分解吸的熱源及用于將所述經(jīng)解吸部 分的至少一部分離子化以產(chǎn)生經(jīng)離子化樣本的離子化器。所述系統(tǒng)還包括與所述離子化源 連通的差分遷移率光譜儀。所述差分遷移率光譜儀可從所述離子化源接收所述經(jīng)離子化 樣本的至少一部分且傳輸選定差分遷移率的離子。與所述差分遷移率光譜儀連通的質(zhì)譜 儀經(jīng)配置以分析從所述差分遷移率光譜儀接收的所述選定差分遷移率的所述離子。在各種 實(shí)施例中，所述分析物可包含睪丸激素。在各種實(shí)施例中，所述分析物可包含維生素D。在 各種實(shí)施例中，所述分析物可包含25-0H-維生素D3。在各種實(shí)施例中，所述分析物可包含 25-0H-維生素D2。
[0014] 在一些實(shí)施例中，所述熱源可包括激光二極管。舉例來(lái)說(shuō)，所述激光二極管可經(jīng)配 置以產(chǎn)生引導(dǎo)到恰好含有所述樣本的樣本的激光束。
[0015] 所述離子化器可具有各種配置以產(chǎn)生經(jīng)離子化樣本。在各種實(shí)施例中，所述離子 化器可包括大氣壓化學(xué)離子化源。在一個(gè)方面中，所述離子化器包含產(chǎn)生電暈放電的離子 化針。在另一方面中，所述離子化器可包括經(jīng)配置以產(chǎn)生用于通過(guò)光離子化將所述經(jīng)解吸 樣本離子化的光束的紫外光源。在各種實(shí)施例中，所述質(zhì)譜儀可包含串聯(lián)質(zhì)譜儀。在各個(gè) 方面中，所述質(zhì)譜儀可為三重四極質(zhì)譜儀。在各個(gè)方面中，所述系統(tǒng)可檢測(cè)具有約289/97、 289/109及292/97的m/z值的至少一個(gè)前驅(qū)物-產(chǎn)物離子對(duì)躍遷。在各個(gè)方面中，所述系 統(tǒng)可檢測(cè)具有約401. 3/365. 2、401/257. 1及401. 3/201. 1的m/z值的至少一個(gè)前驅(qū)物-產(chǎn) 物離子對(duì)躍遷。在各種實(shí)施例中，所述系統(tǒng)可檢測(cè)具有約413. 3/355. 2及413. 3/337. 2的 m/z值的至少一個(gè)前驅(qū)物-產(chǎn)物離子對(duì)躍遷。在各種實(shí)施例中，所述差分遷移率光譜儀可具 有各種配置。舉例來(lái)說(shuō)，補(bǔ)償電壓可為約4伏。以此方式，所述差分遷移率光譜儀可優(yōu)先傳 輸睪丸激素（舉例來(lái)說(shuō)）。在各種實(shí)施例中，補(bǔ)償電壓可在約4伏到約12伏的范圍內(nèi)。在 各個(gè)方面中，補(bǔ)償電壓可在約4伏到約14伏的范圍內(nèi)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016] 所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，下文所描述的圖式僅用于說(shuō)明目的。所述圖式并不 打算以任何方式限制申請(qǐng)者的教示內(nèi)容的范圍。
[0017] 圖1例示根據(jù)申請(qǐng)者的教示內(nèi)容的各種實(shí)施例的用于量化分析物的方法。
[0018] 圖2例示根據(jù)申請(qǐng)者的教示內(nèi)容的各種實(shí)施例的用于量化分析物的系統(tǒng)。
[0019] 圖3展示根據(jù)申請(qǐng)者的教示內(nèi)容的激光二極管熱解吸（LDTD)離子化源的示意圖。
[0020] 圖4展示根據(jù)申請(qǐng)者的教示內(nèi)容的各種實(shí)施例當(dāng)串聯(lián)使用LDTD源及離子遷移率 裝置以分析經(jīng)摻和血清睪丸激素校準(zhǔn)物時(shí)空白中的干擾的減小。
[0021] 圖5展示根據(jù)申請(qǐng)者的教示內(nèi)容的各種實(shí)施例的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。
[0022] 圖6展示根據(jù)申請(qǐng)者的教示內(nèi)容的各種實(shí)施例的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果。
[0023] 圖7展示根據(jù)申請(qǐng)者的教示內(nèi)容的各種實(shí)施例的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果。
[0024] 圖8展示根據(jù)申請(qǐng)者的教示內(nèi)容的各種實(shí)施例當(dāng)串聯(lián)使用LDTD源及離子遷移率 裝置以分析維生素D時(shí)干擾的減小。
[0025] 圖9展示根據(jù)申請(qǐng)者的教示內(nèi)容的各種實(shí)施例當(dāng)僅使用LDTD源且將離子遷移率 裝置關(guān)斷以分析維生素D時(shí)的干擾。
[0026] 圖10展示根據(jù)申請(qǐng)者的教示內(nèi)容的各種實(shí)施例當(dāng)串聯(lián)使用LDTD源及離子遷移率 裝置以分析維生素D時(shí)及當(dāng)僅使用LDTD且將離子遷移率裝置關(guān)斷時(shí)空白中的干擾的比較。
[0027] 圖11展示根據(jù)申請(qǐng)者的教示內(nèi)容的各種實(shí)施例的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，本文所描述的方法及系統(tǒng)為非限制性示范性實(shí)施例 且申請(qǐng)者的揭示內(nèi)容的范圍僅由權(quán)利要求書界定。盡管結(jié)合各種實(shí)施例描述申請(qǐng)者的教示 內(nèi)容，但并不打算將申請(qǐng)者的教示內(nèi)容限定于此些實(shí)施例。相反，申請(qǐng)者的教示內(nèi)容涵蓋各 種替代、修改及等效方案，如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解。結(jié)合一個(gè)示范性實(shí)施例所圖解說(shuō) 明或描述的特征可與其它實(shí)施例的特征組合。此些修改及變化打算包括在申請(qǐng)者的揭示內(nèi) 容的范圍內(nèi)。
[0029] 根據(jù)各種實(shí)施例，提供用于量化生物樣本中的所關(guān)心分析物的方法。圖1描繪根 據(jù)申請(qǐng)者的教示內(nèi)容用于量化分析物的方法的一個(gè)示范性實(shí)施例。如所展示，所述方法可 包括制備生物樣本、將樣本離子化、將離子輸入到差分遷移率光譜儀（DMS)中及質(zhì)量分析 DMS的輸出。
[0030] 如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，可制備含有或可能含有所關(guān)心分析物的樣本以用 于質(zhì)譜分析。以舉例的方式，樣本可為生物樣本，例如血液、血清、血漿、口液或尿液。可使 用根據(jù)本文的教示內(nèi)容修改的此項(xiàng)技術(shù)中已知的各種技術(shù)來(lái)制備樣本。在一些實(shí)施例中， 根據(jù)申請(qǐng)者的教示內(nèi)容的方法可消除耗時(shí)的樣本制備步驟。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中，制 備樣本不需要包括使用液相色譜以分離樣本中存在的可能干擾物質(zhì)。在一個(gè)方面中，樣本 制備可包括執(zhí)行液-液萃取及干燥，如本文所論述。
[0031] 可接著將所制備樣本離子化。可使用根據(jù)本文的教示內(nèi)容修改的此項(xiàng)技術(shù)中已知 的各種離子化技術(shù)來(lái)將所制備樣本離子化。在一個(gè)實(shí)施例中，可使用激光二極管熱解吸來(lái) 將多個(gè)樣本依序離子化，如本文所論述。在示范性實(shí)施例中，安置于樣本板上的所制備樣本 例如可通過(guò)對(duì)樣本板（例如,與樣本熱接觸的一部分）或樣本本身輻射以使樣本的一部分 汽化來(lái)解吸?？蓪颖镜慕?jīng)解吸部分傳輸?shù)诫x子化器以將經(jīng)解吸樣本離子化。如所屬領(lǐng)域 的技術(shù)人員將了解，可利用根據(jù)本文的教示內(nèi)容修改的各種離子化技術(shù)來(lái)將樣本離子化。 以舉例的方式，可使用大氣壓化學(xué)離子化或光離子化來(lái)將經(jīng)解吸樣本的一部分離子化。
[0032] 在經(jīng)離子化之后，可將樣本的一部分遞送到差分遷移率光譜儀以從經(jīng)離子化樣本 至少部分地萃取選定經(jīng)離子化分析物。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，差分遷移率光譜儀 的補(bǔ)償電壓可經(jīng)選擇以優(yōu)先傳輸所關(guān)心分析物。以舉例的方式，補(bǔ)償電壓可設(shè)定為約4伏 以將經(jīng)離子化睪丸激素優(yōu)先傳輸?shù)较掠钨|(zhì)量分析儀。在各種實(shí)施例中，補(bǔ)償電壓可在約4 伏到約12伏的范圍內(nèi)。在各個(gè)方面中，補(bǔ)償電壓可在約4伏到約14伏的范圍內(nèi)。
[0033] 退出DMS的離子可由下游質(zhì)譜儀分析，例如串聯(lián)質(zhì)譜儀。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員 將了解，可利用用于分析由差分遷移率光譜儀傳輸?shù)碾x子的各種技術(shù)。以舉例的方式，可觀 察選定MRM躍遷以找到所關(guān)心分析物以實(shí)現(xiàn)樣本中的分析物的定量。在其中檢測(cè)及量化睪 丸激素的一個(gè)示范性實(shí)施例中，可使用具有約289/97、289/109及292/97的m/z值的至少 一個(gè)產(chǎn)物-前驅(qū)物離子對(duì)躍遷。在其中檢測(cè)及量化25-0H-維生素D3的一個(gè)示范性實(shí)施例 中，可使用具有約401. 3/365. 2、401. 3/257. 1及401. 3/201. 1的m/z值的至少一個(gè)產(chǎn)物-前 驅(qū)物離子對(duì)躍遷。在其中檢測(cè)及量化25-0H-維生素D2的一個(gè)示范性實(shí)施例中，可使用具 有約413. 3/355. 2及413. 3/337. 2的m/z值的至少一個(gè)產(chǎn)物-前驅(qū)物離子對(duì)躍遷。
[0034] 根據(jù)各種實(shí)施例，提供用于量化生物樣本中的所關(guān)心分析物的質(zhì)譜系統(tǒng)。圖2描 繪用于量化分析物的系統(tǒng)的一個(gè)示范性實(shí)施例。如所展示，所述系統(tǒng)包括操作地耦合到差 分遷移率光譜儀（DMS)的離子化源及下游質(zhì)量分析儀。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，根 據(jù)申請(qǐng)者的教示內(nèi)容的系統(tǒng)可用于量化各種生物樣本中所存在的各種分析物，例如睪丸激 素及維生素D。在各種實(shí)施例中，分析物可包含25-0H-維生素D3。在各種實(shí)施例中，所述 分析物可包含25-0H-維生素D2。
[0035] 如本文所論述，可在離子化之前制備樣本。可接著使用各種離子化源將樣本離子 化。舉例來(lái)說(shuō)，可使用APCI及光離子化來(lái)將樣本離子化。在一個(gè)實(shí)施例中，離子化源可為 激光二極管熱解吸離子化源，其可有效地解吸及/或離子化所制備樣本。由加拿大魁北克 的菲特尼斯技術(shù)公司（Phytronix Technologies, Inc.)制造的LDTD S-960/S-3480為可如 所論述（舉例來(lái)說(shuō)，如在以下實(shí)例部分中所描述）操作的此種源的一個(gè)實(shí)例。
[0036] 可接著將經(jīng)離子化樣本傳輸?shù)紻MS，其可選擇性地將所關(guān)心分析物（例如，睪丸激 素、維生素D等）傳輸?shù)较掠钨|(zhì)量分析儀。在各種實(shí)施例中，可在系統(tǒng)中引入化學(xué)改進(jìn)劑， 舉例來(lái)說(shuō)，在DMS接口中。盡管將DMS及質(zhì)量分析儀描繪為單獨(dú)的組件，但所屬領(lǐng)域的技術(shù) 人員將了解DMS可實(shí)施為集成單元。以舉例的方式，SelexION?離子遷移率裝置可與如馬 薩諸塞州弗雷明漢（Framingham，MA)的AB SCIEX所生產(chǎn)的QTRAP? 5500三重四極質(zhì)譜 儀直接介接。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，質(zhì)量分析儀可具有各種配置且可為操作地耦 合到DMS的獨(dú)立質(zhì)量分析儀。以舉例的方式，質(zhì)量分析儀可為串聯(lián)質(zhì)譜儀、三重四極、QqTOF 或阱TOF質(zhì)譜儀。
[0037] 實(shí)例
[0038] 申請(qǐng)者的教示內(nèi)容可參考下文所呈現(xiàn)的實(shí)例及所得數(shù)據(jù)而甚至更全面地理解。所 屬領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)考慮本說(shuō)明書及實(shí)踐本文所揭示的本教示內(nèi)容將顯而易見(jiàn)申請(qǐng)者的 教示內(nèi)容的其它實(shí)施例。打算將這些實(shí)例僅視為示范性。
[0039] Laser Diode Thermal Desorption?(LDTD)離子化源技術(shù)稱合到配備有 SelexION?差分離子遷移率裝置的質(zhì)譜儀，從而實(shí)現(xiàn)用于生物基質(zhì)中的分析物的分析的高 通量容量。LDTD源允許樣本在大氣壓下的快速激光熱解吸，后續(xù)接著APCI型離子化。分 析物的LDTD-MS/MS分析的定量下限可受由于同質(zhì)異位分析物的存在而產(chǎn)生的空白干擾限 制，然而，LDTD源與串聯(lián)質(zhì)譜儀之間的SelexION?差分離子遷移率裝置的添加提供增強(qiáng)的 選擇性，且有效地允許同質(zhì)異位分析物的分離。圖3展示LDTD離子化源的示意圖。LDTD使 用激光二極管來(lái)產(chǎn)生及控制樣本支撐件上的熱，所述樣本支撐件為96孔板。接著經(jīng)由樣本 固持器轉(zhuǎn)移能量以使樣本干燥，樣本在由APCI區(qū)中的氣體運(yùn)載之前汽化。由于不存在溶劑 及流動(dòng)相，具有對(duì)離子抑制的強(qiáng)抵抗的高效率質(zhì)子化表征離子化。此允許7秒樣本-樣本 分析時(shí)間的極高通量能力（無(wú)推遲）。使用差分遷移率光譜法，SelexION?離子遷移率裝置 通過(guò)提供分離同質(zhì)異位物質(zhì)的正交手段而實(shí)現(xiàn)優(yōu)于傳統(tǒng)MS/MS分析的增強(qiáng)的選擇性。當(dāng)在 由MS/MS分析之前不使用液相色譜分離同質(zhì)異位物質(zhì)時(shí)此能力變得尤其重要。在所述實(shí)例 中，離子遷移率單元直接介接到QTRAP? 5500質(zhì)譜儀的前部，且通過(guò)將補(bǔ)償電壓（CoV)參 數(shù)調(diào)諧到4V的值而優(yōu)化以用于睪丸激素的檢測(cè)。樣本制備如下：
[0040] 1.將100 μ L的血清樣本轉(zhuǎn)移到硼硅酸鹽試管。
[0041] 2.將20 μ L的IS工作儲(chǔ)備溶液（10ng/mL)添加到每一試管。
[0042] 3.將300 μ L的NaOH(IN)吸入到硼硅酸鹽試管中且使用旋渦混合器混合10秒。
[0043] 4.將400 μ L的MTBE添加到試管且使用旋渦混合器混合30秒。
[0044] 5.在環(huán)境溫度下將試管堅(jiān)直放置5分鐘且以HOOOrpm離心5分鐘。
[0045] 6.將200 μ L的上部層清液轉(zhuǎn)移到干凈的硼硅酸鹽試管并在45°C下在Ν2氣體中 蒸發(fā)干燥。
[0046] 7.樣本在40 μ L復(fù)原溶液中復(fù)原且使用旋潤(rùn)混合器混合60秒。
[0047] 8.接著以HOOOrpm將試管離心1分鐘以沉淀任何不溶或微粒物質(zhì)。
[0048] 9.將干凈的無(wú)沉淀物溶液轉(zhuǎn)移到配備有200 μ L內(nèi)插管的硼硅酸鹽HPLC小瓶。
[0049] 如圖4中所展示，當(dāng)串聯(lián)使用LDTD源與SelexION?離子遷移率裝置以分析經(jīng)摻 合血清睪丸激素校準(zhǔn)物時(shí)，空白中的干擾從65%減小到接近零，從而產(chǎn)生定量下限的IOx 改善。樣本制備是由以l:4v/v比使用乙酸乙酯對(duì)人類血漿的簡(jiǎn)單液-液萃取構(gòu)成的。將 2μ 1的上部層直接存放到96孔板且允許在分析之前干燥。這些結(jié)果表示優(yōu)于在不存在 SelexION?離子遷移率裝置的情況下獲得的結(jié)果的顯著改善。
[0050] 定量下限為0. lng/ml，且化驗(yàn)顯示超過(guò)5個(gè)數(shù)量級(jí)的極好線性，其中r2 = 0. 99972。準(zhǔn)確性及可重復(fù)性在接受值內(nèi)，如圖5中所展示。樣本-樣本運(yùn)行時(shí)間僅為7秒。 相比之下，使用常規(guī)LC-MS/MS的等效分析將通常每樣本需要大約3到5分鐘。
[0051] 結(jié)果表明在L/L血清萃取中，基線顯著降低且降低到可能實(shí)現(xiàn)合適的LOQ的點(diǎn)，如 圖4中所展示。此在不引入DMS接口中的化學(xué)改進(jìn)劑的情況下實(shí)現(xiàn)。在這些條件下，睪丸 激素具有4V的最佳C0V。通過(guò)引入改進(jìn)劑可能實(shí)現(xiàn)額外選擇性。
[0052] 使用LDTD/SelexION?組合發(fā)現(xiàn)并分析所萃取經(jīng)摻和血清校準(zhǔn)劑。重復(fù)所述實(shí)驗(yàn) 得到兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果，如圖6及7中所展示。所述結(jié)果展示良好線性。
[0053] 串聯(lián)使用LDTD源及離子遷移率裝置（在此實(shí)例中為Selexlon)來(lái)分析維生 素D以分離7-α -輕基-4-膽甾烯-3-酮的同質(zhì)異位干擾。Laser Diode Thermal Des〇rpti〇nTM(LDTD)離子化源耦合到配備有SelexION?差分離子遷移率單元的質(zhì)譜儀，從 而實(shí)現(xiàn)用于生物基質(zhì)中的25-羥基維生素D2及D3的分析的高通量容量，其中樣本-樣本 分析時(shí)間為9秒。血漿樣本的制備是由蛋白質(zhì)沉淀添加甲醇后續(xù)接著使用己烷的液-液萃 取構(gòu)成的。將5μ1的上部層存放在專有96孔板中且允許在分析之前干燥。通過(guò)差分遷移 率光譜儀的作用將已知干擾25-0H-D3的MS/MS躍遷的內(nèi)生同質(zhì)異位化合物7 α -羥基-膽 甾烯-3-酮分離，如個(gè)別標(biāo)準(zhǔn)的特定解吸所演示。使用根據(jù)Chromsystem設(shè)定的多級(jí)校準(zhǔn) 物來(lái)制備校準(zhǔn)曲線。通過(guò)用經(jīng)汽提血清稀釋校準(zhǔn)物來(lái)制備額外曲線級(jí)。進(jìn)行多個(gè)測(cè)試以用 于驗(yàn)證。通過(guò)首先測(cè)量6個(gè)不同血漿樣本的原始水平且將其與已知量的25-0H-D3摻合來(lái) 評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。觀察恒定內(nèi)生+經(jīng)摻合數(shù)量。特異性測(cè)量為在定量限制下空白級(jí)峰值區(qū)域 與信號(hào)區(qū)域的比較?？芍貜?fù)性測(cè)試為同日間及異日間重復(fù)的測(cè)量。在基質(zhì)中評(píng)價(jià)穩(wěn)定性， 在室溫及4°C下萃取并干燥到Lazwell板上。最后，在QC中摻合6種伴隨藥物（咖啡因、 醋氨酚等）以驗(yàn)證可能的干擾。范圍從1到65ng/ml及1. 5到94ng/ml的定量分別用于 25-0H-維生素D3及D2。對(duì)于兩種化合物，空白級(jí)小于LOQ的20%。為評(píng)估準(zhǔn)確性及精確 性，一式三份地對(duì)校準(zhǔn)點(diǎn)及QC進(jìn)行分析。η = 3的可重復(fù)性范圍從0. 6%到12. 3%。QC的 所計(jì)算濃度在所報(bào)告值的15%內(nèi)。LC MS/MS與LDTD MS/MS樣本之間的關(guān)系由r2 = 0. 952 表達(dá)。以LDTD MS/MS在9秒內(nèi)分析樣本符合所有驗(yàn)證參數(shù)的監(jiān)管環(huán)境的指導(dǎo)方針。
[0054] 樣本制備如下：
[0055] ?根據(jù)Chromsystem的血楽標(biāo)準(zhǔn)
[0056] ?來(lái)自經(jīng)雙重汽提血漿的空白：濃度〈lng/ml
[0057] ?血漿的連續(xù)稀釋
[0058] ?氘化的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)
[0059] · 20 μ 1的血漿與40 μ 1的MeOH -起粉碎
[0060] · 40 μ 1的上清液+20 μ 1的水飽和NaCl+40 μ 1己燒
[0061] ·2μ1 沉淀物
[0062] 如圖8中所展示，當(dāng)LDTD源及離子遷移率裝置及差分遷移率裝置SelexION?(在 此實(shí)例中）接通且串聯(lián)使用以分析維生素D時(shí)，來(lái)自7- α -羥基-4-膽留烯-3-酮的干擾 為0. 6 %。相比之下，如圖9中所展示，當(dāng)僅使用LDTD源且差分遷移率裝置關(guān)斷時(shí)，來(lái)自 7- α -羥基-4-膽甾烯-3-酮的干擾為16. 9%。
[0063] 圖10展示當(dāng)LDTD源及SelexION?離子遷移率裝置接通且串聯(lián)用于分析維生素D 時(shí)，與當(dāng)僅使用LDTD源而差分遷移率裝置關(guān)斷時(shí)相比空白中的干擾減小。
[0064] 圖11展示展示良好線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果。
[0065] 基于上文所描述的實(shí)施例，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解根據(jù)申請(qǐng)者的教示內(nèi)容的 方法及系統(tǒng)的其它特征及優(yōu)點(diǎn)。因此，申請(qǐng)者的教示內(nèi)容不受已特定展示及描述的內(nèi)容限 制，除非所附權(quán)利要求書指示。本文所引用的所有公開案及參考文獻(xiàn)均以全文引用的方式 明確并入本文中。
【權(quán)利要求】
1. 一種量化生物樣本中的分析物的方法，其包含： 制備生物樣本以用于質(zhì)譜分析， 利用離子化源將所述所制備生物樣本的至少一部分離子化以產(chǎn)生經(jīng)離子化分析物流， 將所述經(jīng)離子化分析物流引入到設(shè)定于經(jīng)選擇以從所述經(jīng)離子化分析物流萃取經(jīng)離 子化分析物分子的補(bǔ)償電壓下的差分遷移率光譜儀中， 將所述差分遷移率光譜儀的輸出分析物流引入到質(zhì)譜儀中以檢測(cè)及量化所述輸出分 析物流中的分析物離子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分析物包含睪丸激素。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分析物選自由25-0H-維生素 D2及25-0H-維 生素 D3組成的群組。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述離子化源包含激光二極管熱解吸LDTD離子化 源。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述質(zhì)譜儀包含串聯(lián)質(zhì)譜儀。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中檢測(cè)具有約289/97、289/109、292/97、 401. 3/365. 2、401. 3/257. 1、401. 3/201. 1、413. 3/355. 2 及 413. 3/337. 2 的 m/z 值的至少一 個(gè)前驅(qū)物-產(chǎn)物離子對(duì)躍遷。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述補(bǔ)償電壓為約4伏到約14伏。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中以約0. Ing/mL的定量限制來(lái)檢測(cè)所述睪丸激素。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述離子化源包含二極管激光器以將熱能賦予所 述所制備生物樣本以解吸所述所制備生物樣本的至少一部分。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述離子化源包含用于將所述經(jīng)解吸生物樣本 離子化的APCI離子化器。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在無(wú)需液相色譜分離的情況下制備所述生物樣 本。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中制備所述樣本包含執(zhí)行液-液萃取及在所述離 子化步驟之前將所述生物樣本干燥。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其進(jìn)一步包含利用所述離子化源將額外所制備生物 樣本的至少一部分離子化以在將所述所制備生物樣本離子化的約10秒內(nèi)產(chǎn)生額外經(jīng)離子 化分析物流。
14. 一種質(zhì)譜系統(tǒng)，其包含： 離子化源，其具有經(jīng)配置以將熱施加到樣本以產(chǎn)生經(jīng)解吸樣本的熱源及用于將所述經(jīng) 解吸樣本的至少一部分離子化以產(chǎn)生經(jīng)離子化樣本的離子化器， 差分遷移率光譜儀，其與所述離子化源連通，所述差分遷移率光譜儀經(jīng)配置以從所述 離子化源接收所述經(jīng)離子化樣本的至少一部分且傳輸選定差分遷移率的離子，及 質(zhì)譜儀，其與所述差分遷移率光譜儀連通，所述質(zhì)譜儀經(jīng)配置以分析從所述差分遷移 率光譜儀接收的所述選定差分遷移率的所述離子。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的系統(tǒng)，其中所述樣本包含睪丸激素。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的系統(tǒng)，其中所述樣本選自由25-OH-維生素 D2及25-OH-維 生素 D3組成的群組。
17. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的系統(tǒng)，其中所述熱源包含激光二極管。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的系統(tǒng)，其中所述離子化器包含大氣壓化學(xué)離子化源。
19. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的系統(tǒng)，其中所述離子化器包含經(jīng)配置以產(chǎn)生用于通過(guò)光離 子化將所述經(jīng)解吸樣本離子化的光束的紫外光源。
20. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的系統(tǒng)，其中所述質(zhì)譜儀包含串聯(lián)質(zhì)譜儀。
【文檔編號(hào)】G01N27/62GK104364641SQ201280053124
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月26日
【發(fā)明者】瑟奇·奧格, 格雷戈里·布拉雄, 希沙姆·古巴拉, 邁克爾·賈維斯, 皮埃爾·皮卡爾 申請(qǐng)人:Dh科技發(fā)展私人貿(mào)易有限公司, 菲特羅尼克斯科技公司, 瑟奇·奧格, 格雷戈里·布拉雄, 希沙姆·古巴拉, 邁克爾·賈維斯, 皮埃爾·皮卡爾