用于對(duì)抗體的糖基化進(jìn)行測(cè)定的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于對(duì)抗體與存在于細(xì)胞表面上的Fc受體的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)的方法，并涉及用于對(duì)抗體的糖基化水平進(jìn)行測(cè)定的方法。本發(fā)明還涉及用于實(shí)施所述方法的試劑盒。
【專利說(shuō)明】用于對(duì)抗體的糖基化進(jìn)行測(cè)定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于對(duì)抗體與存在于細(xì)胞表面上的可結(jié)晶片段Fe的受體(以下稱為“Fe受體”或FcR)的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)的方法，并涉及用于對(duì)抗體的糖基化水平進(jìn)行測(cè)定的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多年來(lái)，重組單克隆抗體使得得以發(fā)生治療革命。雖然其臨床效力不再需要任何證明，然而對(duì)于重組單克隆抗體在患者中的作用方式仍知之甚少。靶向膜抗原的抗體的療效特別涉及募集表達(dá)抗體可結(jié)晶片段的受體(以下稱為“Fe受體”)的效應(yīng)細(xì)胞。
[0003]Fe受體是存在于對(duì)免疫系統(tǒng)的功能有貢獻(xiàn)的特定細(xì)胞表面上的蛋白，所述細(xì)胞特別是NK( “自然殺傷”)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞。Fe受體的名字來(lái)自于它們與抗體的Fe (可結(jié)晶片段)區(qū)域結(jié)合的能力。存在多種類型的Fe受體，根據(jù)Fe受體識(shí)別的抗體類型將其分類=Fc Y受體(Fe Y R)與IgG結(jié)合；Fc α受體(Fe a R)與IgA結(jié)合；以及Fe ε受體(Fe ε R)與IgE結(jié)合。
[0004]Fe受體與抗體的結(jié)合觸發(fā)多種機(jī)制，這取決于表達(dá)該受體的細(xì)胞的性質(zhì)。表I為不同F(xiàn)e受體的細(xì)胞分布以及由該受體與抗體結(jié)合所觸發(fā)的機(jī)制的概要。
[0005]表I
【權(quán)利要求】
1.一種用于對(duì)抗體與存在于測(cè)量介質(zhì)中的細(xì)胞膜或完整細(xì)胞表達(dá)的Fe受體的結(jié)合進(jìn)行測(cè)定的體外方法，所述方法包括如下步驟: (i)用FRET伴侶對(duì)的第一成員對(duì)所述Fe受體進(jìn)行直接或間接標(biāo)記，或者向所述介質(zhì)中引入其Fe受體已預(yù)先被所述FRET伴侶對(duì)的第一成員直接標(biāo)記的細(xì)胞膜或完整細(xì)胞； (?)向所述測(cè)量介質(zhì)中加入用所述FRET伴侶對(duì)的第二成員直接或間接標(biāo)記的所述抗體； (iii)對(duì)FRET信號(hào)進(jìn)行測(cè)量，所述FRET信號(hào)的存在表示所述抗體與所述Fe受體的結(jié)合
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用不同的抗體濃度重復(fù)所述方法；并且，所述方法包括對(duì)抗體-Fe受體鍵的解離常數(shù)進(jìn)行測(cè)定的附加步驟(iv)。
3.—種通過(guò)與參比抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性抗體與存在于測(cè)量介質(zhì)中的細(xì)胞膜或完整細(xì)胞表達(dá)的Fe受體的結(jié)合進(jìn)行測(cè)定的體外方法，所述方法包括如下步驟: (i)用FRET伴侶對(duì)的第一成員對(duì)所述Fe受體進(jìn)行直接或間接標(biāo)記，或者向所述介質(zhì)中引入其Fe受體已預(yù)先被所述FRET伴侶對(duì)的第一成員直接標(biāo)記的細(xì)胞膜或完整細(xì)胞； (?)向所述測(cè)量介質(zhì)中加入所述競(jìng)爭(zhēng)性抗體； (iii)向所述測(cè)量介質(zhì)中加入用所述FRET伴侶對(duì)的第二成員直接或間接標(biāo)記的所述參比抗體； (iv)對(duì)FRET信號(hào)進(jìn)行測(cè)量，與不存在所述競(jìng)爭(zhēng)性抗體時(shí)測(cè)得的信號(hào)相比，在存在所述競(jìng)爭(zhēng)性抗體的情況下測(cè)得的信號(hào)的降低表示所述競(jìng)爭(zhēng)性抗體與所述Fe受體的結(jié)合。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，用不同量的競(jìng)爭(zhēng)性抗體重復(fù)步驟(ii)，步驟(iii)中加入的參比抗體的量是固定的；其特征還在于，所述方法包括對(duì)所述競(jìng)爭(zhēng)性抗體的EC50進(jìn)行測(cè)定并將其與所述參比抗體的EC50進(jìn)行比較的附加步驟(V)。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述參比抗體和所述競(jìng)爭(zhēng)性抗體在以下方面明顯不同:所述競(jìng)爭(zhēng)性抗體由目的在于改變其Fe片段的糖基化水平的方法生產(chǎn)，或者經(jīng)過(guò)目的在于改變其Fe片段的糖基化水平的處理。
6.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述參比抗體和測(cè)試抗體在以下方面明顯不同:所述測(cè)試抗體由目的在于改變其Fe片段的巖藻糖基化水平的方法生產(chǎn)，或經(jīng)過(guò)目的在于改變其Fe片段的巖藻糖基化水平的處理。
7.一種用于對(duì)抗體的糖基化水平進(jìn)行測(cè)定的方法，所述方法包括如下步驟: -實(shí)施如權(quán)利要求4所述的方法，在所述步驟(ii)中使用糖基化或去糖基化水平已知的數(shù)種競(jìng)爭(zhēng)性抗體；然后 -實(shí)施如權(quán)利要求4所述的方法，在所述步驟(ii)中使用糖基化水平待測(cè)定的抗體；以及 -通過(guò)將測(cè)試抗體的EC50與所述糖基化或去糖基化水平已知的競(jìng)爭(zhēng)性抗體的EC50相比較，測(cè)定所述測(cè)試抗體的糖基化水平。
8.一種用于對(duì)抗體的巖藻糖基化水平進(jìn)行測(cè)定的方法，所述方法包括如下步驟: -實(shí)施如權(quán)利要求4所述的方法，在所述步驟(ii)中使用數(shù)種巖藻糖基化或去巖藻糖基化水平已知的競(jìng)爭(zhēng)性抗體；然后 -實(shí)施如權(quán)利要求4所述的方法，在所述步驟(ii)中使用巖藻糖基化或去巖藻糖基化水平待測(cè)定的抗體；以及 -通過(guò)將測(cè)試抗體的EC50與所述巖藻糖基化或去巖藻糖基化水平已知的競(jìng)爭(zhēng)性抗體的EC50相比較，測(cè)定所述測(cè)試抗體的巖藻糖基化水平。
9.如在先權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述Fe受體是YFc受體。
10.如在先權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述Fe受體是CD16a受體或其變體。
11.如在先權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述Fe受體經(jīng)由自殺酶直接進(jìn)行標(biāo)記，即，其特征在于，所述Fe受體以包含所述Fe受體和所述自殺酶的融合蛋白的形式表達(dá)；其特征還在于，通過(guò)向所述測(cè)量介質(zhì)中加入綴合有FRET伴侶之一的所述酶的底物實(shí)施標(biāo)記。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述自殺酶選自:06-烷基鳥嘌呤DNA烷基轉(zhuǎn)移酶突變體、脫鹵素酶突變體或酰基載體蛋白片段。
13.如在先權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，用完整細(xì)胞實(shí)施所述方法。
14.表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體包含編碼Fe受體的DNA序列和編碼自殺酶的DNA序列。
15.如權(quán)利要求14的表達(dá)載體，其特征在于，所述自殺酶選自:脫鹵素酶突變體、?；d體蛋白片段或06-烷基鳥嘌呤DNA烷基轉(zhuǎn)移酶突變體。
16.如權(quán)利要求14或15所述的表達(dá)載體,其特征在于,所述Fe受體是CD16a受體。
17.哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞含有如權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體。
18.如權(quán)利要求17所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞已在所述自殺酶的底物存在的情況下進(jìn)行了孵育，所述自殺酶的底物綴合有FRET伴侶對(duì)的成員，該處理導(dǎo)致所述細(xì)胞表達(dá)的所述Fe受體被所述FRET伴侶對(duì)的成員標(biāo)記。
19.如權(quán)利要求17或18所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞處于冷凍形式。
20.用于實(shí)施如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含如權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體、或如權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞；以及FRET伴侶對(duì)的至少一個(gè)成員。
【文檔編號(hào)】G01N33/542GK103959063SQ201280056607
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2012年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月16日
【發(fā)明者】德?tīng)柗颇取べZ加, 哈米德·莫克安娜, 斯特凡娜·馬丁內(nèi)斯, 米歇爾·芬克 申請(qǐng)人:Cisbio生物試驗(yàn)公司