用于測(cè)定血產(chǎn)品樣品中凝集的方法和裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于測(cè)定血產(chǎn)品樣品中凝集的方法，所述方法包括：提供具有焦熱電或壓電元件、和能夠?qū)⑼ㄟ^(guò)非輻射衰減產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)換成電信號(hào)的電極(4、5)的換能器(3)；使所述換能器與所述樣品接觸；利用來(lái)自光源(6)的一系列電磁輻射脈沖來(lái)照射所述樣品；以及利用檢測(cè)器(7)來(lái)檢測(cè)由所述換能器3產(chǎn)生的電信號(hào)；其中所述樣品含有能夠吸收由輻射源(6)產(chǎn)生的電磁輻射以通過(guò)非輻射衰減產(chǎn)生能量(諸如熱或沖擊波)的粒子(2)(諸如紅血細(xì)胞(2))，并且其中所述電磁輻射的波長(zhǎng)使得所述輻射被粒子(2)吸收以通過(guò)非輻射衰減來(lái)產(chǎn)生能量。本發(fā)明還提供了一種裝置(1)。
【專利說(shuō)明】用于測(cè)定血產(chǎn)品樣品中凝集的方法和裝置

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于血液測(cè)定的方法，特別地，涉及測(cè)定凝集狀態(tài)。

【背景技術(shù)】
[0002] 凝集為導(dǎo)致凝血的過(guò)程，并且其在損傷血管失血的停止（止血）中起著重要的作 用。因此，凝集的測(cè)定在臨床上為重要的。凝集通過(guò)復(fù)雜的機(jī)制發(fā)生，并且具有兩個(gè)導(dǎo)致血 纖維蛋白形成的途徑。這兩個(gè)途徑為接觸激活途徑（也稱為內(nèi)源性途徑）和組織因子途徑 (也稱為外源性途徑）。目前，多種不同的方法可用于確定凝血速率。這些方法包括激活部 分促凝血酶原激酶時(shí)間（aPTT)(其為內(nèi)源性凝血途徑的量度）、凝血酶原時(shí)間（PT)(其為外 源性凝血途徑的量度）、激活凝血時(shí)間（ACT)(其用于大劑量肝素治療的患者）、INR(患者 樣品相對(duì)于正常樣品的PT比率）和凝血酶生成時(shí)間。盡管這些方法中的每一個(gè)在不同的 條件下起作用，但每個(gè)方法中的實(shí)際物理量度為相同的，即血樣品物理凝血的時(shí)間。
[0003] 存在多種用于測(cè)定凝血速率的方法，其中大多數(shù)集中于測(cè)定與樣品相關(guān)的物理參 數(shù)。這些方法包括：
[0004] -目測(cè)法：將血樣品放置在玻璃容器中并且進(jìn)行觀察?？赏ㄟ^(guò)目測(cè)來(lái)觀察凝血的 外觀。
[0005] -光散射法：將血漿與紅細(xì)胞分離，并且利用促凝血酶原激酶來(lái)處理血漿。血纖維 蛋白形成使得樣品具有濁度，這可通過(guò)光散射法進(jìn)行測(cè)定。
[0006] -機(jī)電方法：一個(gè)例子為機(jī)械柱塞方法，其中將柱塞移入和移出激活的血樣品。凝 塊形成改變了樣品的粘度，這隨后可被檢測(cè)到。另一個(gè)例子為微懸臂的使用。
[0007] -血栓彈力圖：將銷從線上懸吊到比色杯中的血樣品內(nèi)。使比色杯來(lái)回地旋轉(zhuǎn)。銷 的運(yùn)動(dòng)給定與凝塊形成相關(guān)的多個(gè)可用參數(shù)。
[0008] -磁測(cè)方法：將樣品放置在含有磁體的小管中，并且沿水平取向來(lái)旋轉(zhuǎn)該管。如果 樣品還未凝塊，則磁體將自由地旋轉(zhuǎn)并且位于管的底部。一旦樣品開(kāi)始凝塊，磁體就被固定 在凝塊內(nèi)并且圍繞管運(yùn)動(dòng)，這能夠被檢測(cè)到。
[0009] -電化學(xué)方法：Roche CoaguChekK為基于電化學(xué)方法工作的即時(shí)護(hù)理裝置。凝 血酶（因子Ila)切割肽底物，從而產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。
[0010] -粘度測(cè)定：通過(guò)毛細(xì)管來(lái)回地吸取血液，并且光學(xué)地監(jiān)測(cè)運(yùn)動(dòng)速度。
[0011] 然而，在本領(lǐng)域中，仍需要用于測(cè)定凝集的簡(jiǎn)單、精確、和通用的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 因此，本發(fā)明提供了用于測(cè)定血產(chǎn)品樣品中凝集的方法，所述方法包括：
[0013] 提供具有焦熱電或壓電元件、和能夠?qū)⑼ㄟ^(guò)非輻射衰減產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)換成電信號(hào) 的電極的換能器；
[0014] 使換能器與樣品接觸；
[0015] 利用一系列電磁福射脈沖來(lái)照射樣品；
[0016] 以及檢測(cè)由換能器產(chǎn)生的電信號(hào)；
[0017] 其中樣品含有能夠吸收由輻射源產(chǎn)生的電磁輻射以通過(guò)非輻射衰減產(chǎn)生能量的 粒子，并且其中電磁輻射的波長(zhǎng)使得所述輻射被粒子吸收以通過(guò)非輻射衰減來(lái)產(chǎn)生能量。
[0018] 因此，本發(fā)明提供了一種方法，其中樣品內(nèi)的粒子朝向或遠(yuǎn)離換能器的運(yùn)動(dòng)被凝 集事件干擾并且粒子隨時(shí)間的運(yùn)動(dòng)中的這種擾動(dòng)提供出凝集速率的量度。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 現(xiàn)在將參照附圖來(lái)描述本發(fā)明，其中：
[0020] 圖1示出了與本發(fā)明一起使用的W02004/090512的化學(xué)感測(cè)裝置的示意圖；
[0021] 圖2示出了根據(jù)本發(fā)明的盒；
[0022] 圖3示出了存在肝素的凝集實(shí)驗(yàn)，其中血液未凝塊（頂部為原始數(shù)據(jù)/中間為相 對(duì)于周期1進(jìn)行基線化的/底部為相對(duì)于周期數(shù)的典型峰最大值），周期數(shù)是指在30秒間 期內(nèi)采集并且隨后進(jìn)行平均的數(shù)據(jù)，箭頭示出了信號(hào)隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的變化；
[0023] 圖4示出了不存在肝素的凝集實(shí)驗(yàn)，其中血液確定凝塊（頂部為原始數(shù)據(jù)/中間 為相對(duì)于周期1進(jìn)行基線化的/底部為相對(duì)于周期數(shù)的典型峰最大值），箭頭示出了信號(hào)隨 實(shí)驗(yàn)時(shí)間的變化；
[0024] 圖5示出了對(duì)于不同促凝血酶原激酶比率而言的相對(duì)于周期數(shù)的平均峰值高度； 并且
[0025] 圖6示出了對(duì)于促凝血酶原激酶的比率中的每一個(gè)而言的原始跡線，箭頭示出了 信號(hào)隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的變化。
[0026] 本發(fā)明采用如下裝置，所述裝置包括：適于產(chǎn)生一系列電磁輻射脈沖的輻射 源；具有焦熱電或壓電元件、和能夠?qū)⑼ㄟ^(guò)非輻射衰減產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)換成電信號(hào)的電極 的換能器；以及能夠檢測(cè)由換能器產(chǎn)生的電信號(hào)的檢測(cè)器。本發(fā)明的裝置基本上基于 W02004/090512中描述的裝置。
[0027] 圖1示出了根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行使用的裝置1，該裝置依賴于利用電磁輻射照射粒子2 而在粒子2中產(chǎn)生的熱（粒子被示為位于換能器表面上方）。為簡(jiǎn)單起見(jiàn)，僅粒子示于圖1 中（裝置的剩余部件將在下文進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)地描述）。圖1示出了在粒子2存在情況下 的裝置1。裝置1包括具有電極涂層4、5的焦熱電或壓電換能器3。換能器3優(yōu)選地為極 化的聚偏二氟乙烯膜。電極涂層4、5優(yōu)選地為透明的，并且最優(yōu)選地由氧化銦錫形成。電 極優(yōu)選地具有約35nm的厚度，但可以使用從lnm下限（低于此值導(dǎo)電性就太低）到100nm 上限（高于此值光透射率就過(guò)低（其不應(yīng)低于80% T))的幾乎任何厚度。在尤其優(yōu)選的實(shí) 施例中，換能器為經(jīng)氧化銦錫涂覆的聚偏二氟乙烯膜?？蓪⒏郊訉邮┯玫綋Q能器3以阻止 細(xì)胞或粒子結(jié)合到此表面，例如帕利靈聚合物層或惰性蛋白層（如聚鏈霉親和素層）。
[0028] 粒子2被示為鄰近換能器3。本發(fā)明的主要特征在于粒子2在被電磁輻射（通常 稱為"光"）（優(yōu)選可見(jiàn)光）源6照射時(shí)產(chǎn)生熱。光源可為例如LED。光源6利用適當(dāng)波長(zhǎng) 的光照射粒子2。盡管不受理論的束縛，但據(jù)信粒子2吸收光以產(chǎn)生激發(fā)態(tài)，所述激發(fā)態(tài)隨 后經(jīng)歷非輻射衰減從而產(chǎn)生能量，如由圖1中的曲線所示。這種能量主要呈熱的形式（即， 環(huán)境中的熱運(yùn)動(dòng)），但還可產(chǎn)生其他形式的能量（主要為沖擊波）。然而，此能量被換能器 檢測(cè)到并且轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。針對(duì)正被測(cè)定的具體粒子來(lái)校準(zhǔn)裝置，因此無(wú)需確定由非輻射 衰減產(chǎn)生的能量的精確形式。除非另外指明，否則術(shù)語(yǔ)"熱"在本文中用于指由非輻射衰減 產(chǎn)生的能量。光源6被布置成使得照射粒子2。優(yōu)選地，光源6被布置成與換能器3和電極 4、5相對(duì)，并且經(jīng)由換能器3和電極4、5來(lái)照射粒子2。光源可為換能器內(nèi)的內(nèi)部光源，其 中光源為導(dǎo)波系統(tǒng)。波導(dǎo)可為換能器本身或者波導(dǎo)可為附接到換能器的附加層。照射波長(zhǎng) 取決于所使用的粒子。
[0029] 由粒子2產(chǎn)生的能量被換能器3檢測(cè)到并且轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。通過(guò)檢測(cè)器7來(lái)檢測(cè) 電信號(hào)。光源6和檢測(cè)器7二者均受控制器8的控制。光源6產(chǎn)生被稱為"斬切光"的一 系列光脈沖。原則上，單次閃光，即一個(gè)電磁輻射脈沖，將足以從換能器3產(chǎn)生信號(hào)。然而， 為了獲得可再現(xiàn)的信號(hào)，使用多次閃光，這在實(shí)際中需要斬切光。可改變所施用的電磁輻射 脈沖的頻率。在下限處，脈沖之間的時(shí)間延遲必須對(duì)每個(gè)脈沖與待測(cè)定的電信號(hào)的產(chǎn)生之 間的時(shí)間延遲而言為足夠的。在上限處，每個(gè)脈沖之間的時(shí)間延遲一定不能過(guò)長(zhǎng)以使得記 錄數(shù)據(jù)所需的周期被不合理地延長(zhǎng)。優(yōu)選地，脈沖的頻率為1-50HZ，更優(yōu)選地為l-ΙΟΗζ，并 且最優(yōu)選地為2Hz。這分別對(duì)應(yīng)于20-1，000ms、100-l，000ms和500ms的脈沖之間的時(shí)間延 遲。此外，所謂的"傳號(hào)脈沖-空號(hào)脈沖"比率，即信號(hào)開(kāi)與信號(hào)關(guān)的比率優(yōu)選地為1，但可 使用不存在不利效果的其他比率。使用較短的脈沖開(kāi)與較長(zhǎng)的信號(hào)關(guān)存在一些有益效果， 以便在下一個(gè)脈沖干擾系統(tǒng)之前允許系統(tǒng)接近熱平衡。產(chǎn)生具有不同斬切頻率或不同傳號(hào) 脈沖-空號(hào)脈沖比率的電磁輻射源為本領(lǐng)域內(nèi)已知的。檢測(cè)器7測(cè)定來(lái)自光源6的每個(gè)光 脈沖與由檢測(cè)器7從換能器3檢測(cè)到的相應(yīng)電信號(hào)之間的時(shí)間延遲。這種時(shí)間延遲為距離 d的函數(shù)。當(dāng)將粒子直接束縛在表面上時(shí)，優(yōu)選地從2至7ms測(cè)定信號(hào)。為了測(cè)定腔室的 深度中的粒子，使用較長(zhǎng)的時(shí)間延遲，例如l〇-5〇ms。系統(tǒng)還可構(gòu)造成測(cè)定信號(hào)中的峰最大 值，其時(shí)間延遲可在整個(gè)測(cè)定過(guò)程中變化。
[0030] 可使用用于確定光的每個(gè)脈沖與提供了可再現(xiàn)的結(jié)果的相應(yīng)的電信號(hào)之間的時(shí) 間延遲的任何方法。優(yōu)選地，從每個(gè)光脈沖的起點(diǎn)到由檢測(cè)器7檢測(cè)到電信號(hào)的最大值處 的時(shí)間點(diǎn)來(lái)測(cè)定時(shí)間延遲，所述電信號(hào)對(duì)應(yīng)于粒子對(duì)熱的吸收。
[0031] 應(yīng)該指出的是，粒子2可與換能器表面分離，并且仍可檢測(cè)到信號(hào)。此外，不僅可 穿過(guò)居間介質(zhì)檢測(cè)到信號(hào)，而且可區(qū)分不同的距離d(這已被稱為"深度剖析"），并且所接 收的信號(hào)的強(qiáng)度與距換能器3的表面特定距離d處的粒子2的濃度成比例。此外，據(jù)發(fā)現(xiàn)， 介質(zhì)本身的性質(zhì)影響時(shí)間延遲和給定時(shí)間延遲情況下的信號(hào)的幅值。
[0032] 在本發(fā)明中，粒子可為紅血細(xì)胞（紅細(xì)胞）或另一種粒子。粒子的目的為吸收由 輻射源產(chǎn)生的電磁輻射以通過(guò)非輻射衰減產(chǎn)生能量。然后通過(guò)換能器將輻射衰減轉(zhuǎn)換成電 信號(hào)。電磁輻射的波長(zhǎng)使得該輻射被粒子吸收以通過(guò)非輻射衰減來(lái)產(chǎn)生能量。例如，在紅 血細(xì)胞正被用于監(jiān)測(cè)凝集行為的情況下，輻射波長(zhǎng)優(yōu)選地為520nm。
[0033] 紅血細(xì)胞存在于血樣品中，S卩，（未分離的）全血中。這些細(xì)胞往往會(huì)在諸如試管 或容器之類的靜態(tài)系統(tǒng)中隨時(shí)間推移而沉降，因?yàn)檫@些細(xì)胞與其中分散這些細(xì)胞的周圍血 漿相比具有更高的密度。通常建立描述于W02004/090512中的系統(tǒng)以最大程度地降低來(lái)自 紅血細(xì)胞的信號(hào)，具體方式為使用最大程度地降低來(lái)自紅血細(xì)胞的信號(hào)的光的波長(zhǎng)（690nm 左右），并且在光脈沖幾毫秒之后來(lái)測(cè)定信號(hào)，由此將輸出限定為緊鄰換能器產(chǎn)生的熱。然 而，通過(guò)測(cè)定在適當(dāng)波長(zhǎng)下和脈沖之后稍后時(shí)間間期處的電信號(hào)，可以獲得有關(guān)較遠(yuǎn)離表 面的粒子的更多信息。因而可以使用上述系統(tǒng)來(lái)監(jiān)測(cè)粒子隨時(shí)間的運(yùn)動(dòng)，例如，紅血細(xì)胞的 沉降。
[0034] 已發(fā)現(xiàn)，從沉降紅血細(xì)胞獲得的信號(hào)最初隨細(xì)胞沉降而下降，但隨后隨凝集發(fā)生 而又開(kāi)始上升。這種意外的發(fā)現(xiàn)未得到完全理解。然而，盡管不受理論的約束，但這可能為 兩種現(xiàn)象的結(jié)果。第一種現(xiàn)象為紅細(xì)胞最初開(kāi)始減少，但隨后又隨凝塊形成而被迫使增加。 這可與已知的凝塊凝縮的過(guò)程有關(guān)。第二種現(xiàn)象為凝塊樣品中的熱傳遞過(guò)程有所不同，使 得較多的熱通過(guò)凝塊樣品傳遞到換能器。然而，測(cè)定此過(guò)程的優(yōu)點(diǎn)在于其提供出具有不同 最小值的信號(hào)（如果粒子最初朝換能器運(yùn)動(dòng)（例如，如果換能器形成腔室的底部），其也可 為最大值），所述信號(hào)更能表征凝塊過(guò)程。此特征信號(hào)允許更有效地分析由換能器產(chǎn)生的電 信號(hào)。這繼而提供出樣品中的凝集速率的臨床可用量度。
[0035] 此凝集過(guò)程還可在能夠發(fā)生凝集的任何血產(chǎn)品中測(cè)得。此類血產(chǎn)品含有血纖維蛋 白原和凝血因子。優(yōu)選地，血產(chǎn)品為（未分離的）全血或血漿。
[0036] 用于執(zhí)行測(cè)定的粒子必須能夠吸收由輻射源產(chǎn)生的電磁輻射以在所使用的電磁 輻射的波長(zhǎng)下通過(guò)非輻射衰減來(lái)產(chǎn)生能量。粒子與樣品的介質(zhì)（主要為水，但血產(chǎn)品還含 有溶解的蛋白質(zhì)、葡萄糖、凝血因子、礦物離子、激素和溶解的氣體（主要為二氧化碳））相 比將具有更高或更低的密度。通常粒子將具有高于介質(zhì)的密度，因此將在重力作用下沉降。 然而，粒子也可具有低于介質(zhì)的密度，并且粒子將受到粒子在介質(zhì)中的浮力控制而向上運(yùn) 動(dòng)。無(wú)論哪種方式，粒子朝向或遠(yuǎn)離換能器的運(yùn)動(dòng)有所改變，因?yàn)檫@種運(yùn)動(dòng)受到凝塊形成的 影響。
[0037] 粒子的沉降速率（或浮力）為粒子的粒度和其密度二者的函數(shù)。沉降（或浮力） 發(fā)生的速率必須使其在凝集過(guò)程的時(shí)間尺度（其通常為數(shù)秒至數(shù)分鐘）上為可測(cè)定的。因 此，極大的、高密度的粒子可在凝集過(guò)程發(fā)生之前沉降到腔室的底部，然而具有類似于血漿 的密度的極小粒子可沉降得不夠快從而不能用于可測(cè)定的過(guò)程。因此，必須提供粒度和密 度之間的平衡以便適用于給定的測(cè)定。
[0038] 優(yōu)選地，本發(fā)明使用具有20nm至10 μ m的粒度的粒子。粒度是指粒子在其最寬點(diǎn) 處的直徑。粒子優(yōu)選地具有〇. 8至20g/mL的密度。以舉例的方式，紅細(xì)胞具有7微米左右 的直徑和大約1. lg/mL的密度。
[0039] 在粒子為紅血細(xì)胞的情況下，通過(guò)紅血細(xì)胞的沉降來(lái)進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于其他粒子而 言，該粒子通常將具有高于周圍介質(zhì)的密度，因此通過(guò)沉降進(jìn)行測(cè)定，但它們也可具有較低 的密度。粒子將遠(yuǎn)離換能器或朝向換能器運(yùn)動(dòng)，這取決于粒子的性質(zhì)（具有高于或低于介 質(zhì)的密度）和換能器的位置（高于或低于樣品）。
[0040] 就未分離的全血而言，紅血細(xì)胞可充當(dāng)本文限定的粒子。然而，可添加其他粒子以 提供附加或可供選擇的吸收/非輻射衰減源。就紅血細(xì)胞已被移除的血漿或其他血產(chǎn)品而 言，必須添加粒子以便用于待測(cè)定的沉降（或浮力）。
[0041] 粒子因此可由能夠以上述方式與電磁輻射相互作用的任何材料構(gòu)成。優(yōu)選地，粒 子選自但不限于碳粒子（例如，2g/mL的密度和200nm的粒度）、有色聚合物粒子（優(yōu)選有 色乳膠，例如20至2, OOOnm)、染料粒子、金屬（優(yōu)選金）粒子（15-20g/mL左右的密度和20 至lOOnm左右的粒度）、紅血細(xì)胞、磁性粒子、具有非傳導(dǎo)芯材料和至少一個(gè)金屬外殼層的 納米粒子、由聚吡咯或其衍生物構(gòu)成的粒子、以及它們的組合。
[0042] 就磁性粒子而言，電磁輻射為射頻輻射。上文所述的其他粒子中的全部均利用光， 所述光可包括IR或UV輻射。金粒子為可商購(gòu)獲得的或可使用已知的方法來(lái)制備（參見(jiàn)例 如G. Frens，Nature，241，20-22 (1973))。對(duì)于納米粒子的更詳細(xì)說(shuō)明，參見(jiàn)US6, 344, 272和 W02007/141581。
[0043] 優(yōu)選地，粒子為紅血細(xì)胞、碳粒子或金粒子，并且在尤其優(yōu)選的實(shí)施例中，樣品為 全血，并且所存在的能夠吸收由輻射源產(chǎn)生的電磁輻射以通過(guò)非輻射衰減產(chǎn)生能量的僅有 粒子為紅血細(xì)胞。
[0044] 樣品將通常為大約若干微升（例如1-100 μ L，優(yōu)選1-30 μ L)。為了保持流體樣品， 換能器優(yōu)選地位于腔室中，所述腔室具有一個(gè)或多個(gè)側(cè)壁、上表面、和下表面。因此，換能器 優(yōu)選地位于用于保持樣品與換能器接觸的腔室內(nèi)。優(yōu)選地，換能器與腔室形成一體，即，其 形成限定腔室的側(cè)壁、或者上表面或下表面中的一者。在優(yōu)選的實(shí)施例中，腔室具有上表面 和下表面，并且換能器形成上表面。可僅通過(guò)表面張力來(lái)將樣品保持在例如毛細(xì)管通道內(nèi)。 腔室的深度通常為50 μ m至lcm，優(yōu)選地為150-250 μ m。
[0045] 為了有利于樣品和測(cè)定自身的處理，樣品優(yōu)選地含有抗凝劑和/或促凝劑。
[0046] 可將一種或多種抗凝劑添加到樣品中以延緩凝集的開(kāi)始?？稍谝勋@得樣品之后的 任何階段處添加抗凝劑。典型的抗凝劑為肝素、檸檬酸鹽或EDTA。
[0047] 盡管全血含有通過(guò)內(nèi)源性途徑引起凝血的全部必要因子，但還可將一種或多種促 凝劑添加到樣品中?？蛇x擇促凝劑以激活凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的內(nèi)源性、外源性、或共同途徑。 [0048] 可通過(guò)添加諸如鞣花酸、膠原或二氧化硅之類的接觸激活劑來(lái)實(shí)現(xiàn)經(jīng)由內(nèi)源性途 徑的激活。二氧化硅可為高嶺土、微?；趸?、或膠態(tài)二氧化硅?？墒褂弥T如聚乙烯吡 咯烷酮（PVP)之類的涂料來(lái)將接觸激活劑施用到腔室的內(nèi)表面。作為另外一種選擇，可使 用因子X(jué)lla、因子X(jué)Ia或因子IXa，以及凝血酶原、因子VIII/因子Villa和因子X(jué)。
[0049] 可在添加或不添加因子VII/因子Vila的情況下通過(guò)添加組織因子來(lái)實(shí)現(xiàn)經(jīng)由外 源性途徑的激活。作為另外一種選擇，可通過(guò)因子Vila (任選地結(jié)合凝血酶原）、因子V/Va、 因子IX或因子X(jué)來(lái)實(shí)現(xiàn)激活。
[0050] 可通過(guò)添加外源因子X(jué)a、或者通過(guò)添加外源因子X(jué)并結(jié)合因子X(jué)的外源激活劑 (例如蛇毒蛋白酶（例如得自Russelli Viperii的蛇毒蛋白酶））來(lái)實(shí)現(xiàn)經(jīng)由共同途徑的 激活。作為另外一種選擇，可添加因子X(jué)的外源激活劑以用于激活內(nèi)源因子X(jué)。任選地，可 添加凝血酶原和/或因子V/Va。
[0051] 可添加諸如磷脂或有機(jī)硅表面活性劑之類的表面活性劑以及上文所述的促凝劑。
[0052] 抗凝劑和/或促凝劑優(yōu)選地保存在結(jié)合到本發(fā)明的裝置內(nèi)的腔室中?？鼓齽┖? 或促凝劑可沉積在換能器的表面上。
[0053] 本發(fā)明還提供了一種用于測(cè)定血產(chǎn)品樣品中凝集的裝置，所述血產(chǎn)品樣品含有能 夠吸收電磁輻射以通過(guò)非輻射衰減產(chǎn)生能量的粒子，所述裝置包括：
[0054] 輻射源，所述輻射源適于產(chǎn)生一系列特定波長(zhǎng)的電磁輻射脈沖，所述波長(zhǎng)使得所 述輻射被粒子吸收以通過(guò)非輻射衰減來(lái)產(chǎn)生能量；
[0055] 含有換能器的樣品腔室，所述換能器具有焦熱電或壓電元件、和能夠?qū)⑼ㄟ^(guò)非輻 射衰減產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)換成電信號(hào)的電極；以及
[0056] 檢測(cè)器，所述檢測(cè)器能夠檢測(cè)由換能器產(chǎn)生的電信號(hào)；
[0057] 其中所述裝置進(jìn)一步包括促凝劑和任選地抗凝劑。
[0058] 本發(fā)明的裝置可包括多個(gè)腔室，所述多個(gè)腔室優(yōu)選地為流體連通的。優(yōu)選地，所 述裝置進(jìn)一步包括細(xì)長(zhǎng)的樣品采集通道，所述樣品采集通道具有與裝置的外部接觸的樣 品采集端、以及與樣品腔室流體連通的樣品遞送端，如圖2的芯21所示。其他細(xì)節(jié)參見(jiàn) W0201I/027147?？稍诓煌那皇抑袌?zhí)行不同的凝集測(cè)定；實(shí)際上，其他腔室可含有其他測(cè) 定部件以用于例如免疫測(cè)定。
[0059] 在優(yōu)選的實(shí)施例中，所述裝置進(jìn)一步包括細(xì)長(zhǎng)的樣品采集通道，所述樣品采集通 道具有開(kāi)口端并且被布置成通過(guò)毛細(xì)管作用來(lái)將流體吸取到通道內(nèi)，其中所述通道具有采 集端和遞送端，并且遞送端與樣品腔室流體連通，并且其中所述通道沿其長(zhǎng)度的第一部分 提供涂覆有抗凝劑的區(qū)域并且沿其長(zhǎng)度的第二部分提供涂覆有促凝劑的區(qū)域，使得樣品在 接觸第二部分之前接觸第一部分。這種布置方式允許樣品接觸抗凝劑以避免采集通道內(nèi)的 凝塊，隨后接觸促凝劑以有利于測(cè)定。
[0060] 所述裝置可采用分離的讀出器和盒的形式、或集成裝置的形式。在前一形式中，所 述裝置由讀出器和盒形成，其中盒與讀出器能夠可釋放地接合，并且其中讀出器合并輻射 源和檢測(cè)器，并且盒合并換能器和腔室。讀出器優(yōu)選地為便攜式讀出器。盒優(yōu)選地為一次 性盒。
[0061] 現(xiàn)在將參照并非意圖進(jìn)行限制的下述實(shí)例來(lái)描述本發(fā)明。

【具體實(shí)施方式】
[0062] 實(shí)魁
[0063] 實(shí)例 1
[0064] PVDF 臘
[0065] 將涂覆有氧化銦錫的極化的壓電/焦熱電聚偏二氟乙烯（PVDF)雙壓電晶片膜用 作下述實(shí)例中的感測(cè)裝置。通過(guò)氣相氣體沉積工藝來(lái)將帕利靈層（具有大約1微米的厚度） 涂覆到氧化銦錫表面上。這種方法涉及對(duì)環(huán)芳烷前體的升華和后續(xù)熱解，之后是在表面上 的自由基聚合反應(yīng)。其他細(xì)節(jié)參見(jiàn)W02009/141637。然后在聚鏈霉親和素溶液QOOyg/ 11^，？85-含有2.7111111〇1/1的1((：1、137111111〇1/1的似(：1、和0.05%的了￥6611的10111111〇1/1磷酸 鹽緩沖液）中通過(guò)室溫下的過(guò)夜孵育來(lái)涂覆所得膜。聚鏈霉親和素是按照Tischer等人所 述（US5, 061，640)來(lái)制備的。聚鏈霉親和素僅為惰性蛋白層以覆蓋傳感器的表面。
[0066] 實(shí)例 2
[0067] 倉(cāng)的制各
[0068] 如圖2所示，盒14被制備用于執(zhí)行測(cè)定。盒14由支撐在加強(qiáng)片16上的壓電/焦 熱電膜15制成。將沖切形成三個(gè)樣品腔室18的經(jīng)壓敏粘合劑涂覆的聚酯膜17施用到表 面上。建立供電源以允許電連接到壓電/焦熱電膜15的頂部或底部表面，以便檢測(cè)所產(chǎn)生 的電荷。然后通過(guò)將上述部件夾在其上施加有標(biāo)簽20的頂部覆蓋件19與芯21、密封件22 和底部覆蓋件23之間來(lái)形成盒14。
[0069] 通過(guò)將樣品裝入樣品腔室來(lái)執(zhí)行測(cè)定。利用斬切的LED光并且隨后利用LED穿過(guò) 頂部覆蓋件19中的孔來(lái)照射壓電/焦熱電膜15。對(duì)于每個(gè)LED脈沖而言，利用放大器和模 數(shù)（ADC)轉(zhuǎn)換器來(lái)測(cè)定整個(gè)壓電/焦熱電膜15上的電壓。隨著時(shí)間推移來(lái)繪制時(shí)間分辨 的ADC信號(hào)。
[0070] 實(shí)例 3
[0071] 凝集1 :存在或不存在肝素
[0072] 將靜脈血樣品吸取到肝素采集管內(nèi)。另外，將同一供體的得自手指針刺的約 500 μ L血液采集到微量離心管（不存在抗凝劑）內(nèi)。通過(guò)在渦旋器上混合約30s來(lái)氧化這 兩個(gè)樣品。在渦旋之后，將這兩個(gè)樣品通過(guò)吸移加載到盒的傳感器阱內(nèi)，并且插入到用于執(zhí) 行測(cè)定的器械內(nèi)。在此實(shí)例中，盒中的樣品采集管為旁通的。
[0073] 樣品的數(shù)據(jù)分別示于圖3和圖4中。
[0074] 圖3示出了信號(hào)的正常變化，即信號(hào)隨時(shí)間推移而下降，因?yàn)檠獦悠烦两颠h(yuǎn)離傳 感器表面。峰最大值相對(duì)周期數(shù)也示出了這種關(guān)系，并且強(qiáng)調(diào)顯示出相對(duì)急劇的下降，這 種急劇的下降朝向?qū)嶒?yàn)期的終點(diǎn)而逐漸減小。相比之下，圖4示出了不存在抗凝劑的樣品 的顯著不同的曲線。樣品沒(méi)有同樣地下降，但更重要的是，在實(shí)驗(yàn)期的大約中點(diǎn)處達(dá)到最 小值，其后信號(hào)則開(kāi)始再次增加。全部盒均表現(xiàn)出這種特性。（這是令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)?按照預(yù)期，一旦樣品已經(jīng)凝集，則血細(xì)胞就應(yīng)停止運(yùn)動(dòng)，并且因而將具有恒定的信號(hào)/峰高 度。）
[0075] 這些數(shù)據(jù)已經(jīng)示出在非凝集血樣品和凝集血樣品的沉降曲線之間存在可分辨的 差異。
[0076] 實(shí)例 4
[0077] 凝集2 :促凝血酶原激酶試劑
[0078] 不同于實(shí)例3,通過(guò)向樣品添加特異性凝集劑來(lái)控制凝集。
[0079] 使用商業(yè)的凝血酶原時(shí)間凝血?jiǎng)═EClotPT-S)。這種可商購(gòu)獲得的試劑主要含 有促凝血酶原激酶和鈣。在標(biāo)準(zhǔn)的凝血酶原時(shí)間試驗(yàn)中，將樣品采集在檸檬酸鹽采集管內(nèi)。 然后將試劑以2 : 1的PT試劑：樣品比添加到此管內(nèi)。通常，血液或血漿在約10至20s 凝塊。因此，為了減慢反應(yīng)（以便有利于測(cè)定），滴定試劑以確定在將適于利用器械觀察的 時(shí)間尺度下將導(dǎo)致凝集的水平。（應(yīng)該指出的是，作為另外一種選擇，器械可被構(gòu)造成測(cè)定 10至20s的時(shí)間尺度）。使用較長(zhǎng)的時(shí)間，因?yàn)檫@種器械配置可用于此實(shí)驗(yàn)。
[0080] 將得自供體的靜脈血樣品采集在檸檬酸鹽管中。然后將其與不同比率的PT (血 液：試劑比在10 : 1至20 : 1的范圍內(nèi)）進(jìn)行混合。這對(duì)應(yīng)于按體積計(jì)5%至10%范圍 內(nèi)的PT體積。在混合之后，立即將樣品加載到盒內(nèi)，并且插入到用于執(zhí)行測(cè)定的器械內(nèi)。
[0081] 相對(duì)于周期數(shù)繪制出峰高度，并且針對(duì)每個(gè)比率的這些數(shù)據(jù)示于下面的圖5中。
[0082] 對(duì)于20 : 1至14 : 1的比率，樣品顯示具有正常的下降，這指示它們沒(méi)有顯著地 凝集。12 : 1和10 : 1兩者均顯示具有圖4中所觀察到的用于凝集材料的典型曲線；即， 峰高度下降到最小值隨后再增加，由此指示出凝集。這還顯示出，在最高濃度的水平上，信 號(hào)較快地達(dá)到最小值，這表明可通過(guò)監(jiān)測(cè)信號(hào)的形狀和信號(hào)開(kāi)始上升時(shí)的時(shí)間來(lái)辨別凝集 差異。
[0083] 對(duì)于完整性，每個(gè)樣品的原始數(shù)據(jù)示于下面的圖6中。
[0084] 對(duì)于臨床測(cè)定而言，基于正常人血樣品（和現(xiàn)有的凝集方法）來(lái)校準(zhǔn)所述系統(tǒng)以 標(biāo)示出樣品在特定類型的凝集試驗(yàn)的條件下正常凝集所需用的時(shí)間。然后利用校準(zhǔn)的系統(tǒng) 來(lái)測(cè)定患者血樣品的凝集時(shí)間。使用凝集時(shí)間的變化來(lái)辨別血樣品是否比正常樣品更快或 更慢地凝集。這隨后可用于作出臨床診斷，或調(diào)整現(xiàn)有治療以使凝集時(shí)間恢復(fù)到正常范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于測(cè)定血產(chǎn)品樣品中凝集的方法，包括： 提供具有焦熱電或壓電元件、和能夠?qū)⑼ㄟ^(guò)非輻射衰減產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)換成電信號(hào)的電 極的換能器； 使所述換能器與所述樣品接觸； 利用一系列電磁輻射脈沖來(lái)照射所述樣品； 以及檢測(cè)由所述換能器產(chǎn)生的所述電信號(hào)； 其中所述樣品含有能夠吸收由所述輻射源產(chǎn)生的所述電磁輻射以通過(guò)非輻射衰減產(chǎn) 生能量的粒子，并且其中所述電磁輻射的波長(zhǎng)使得所述輻射被粒子吸收以通過(guò)非輻射衰減 來(lái)產(chǎn)生能量。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述血產(chǎn)品為全血或血漿。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述粒子選自碳粒子、有色聚合物粒子、染料粒 子、金屬粒子、紅血細(xì)胞、磁性粒子、具有非傳導(dǎo)芯材料和至少一個(gè)金屬外殼層的納米粒子、 由聚吡咯或其衍生物構(gòu)成的粒子、以及它們的組合。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述粒子為紅血細(xì)胞或碳粒子。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述樣品為全血，并且所存在的能夠吸收由所述輻 射源產(chǎn)生的所述電磁輻射以通過(guò)非輻射衰減產(chǎn)生能量的僅有粒子為紅血細(xì)胞。
6. 如上述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述換能器位于用于保持所述樣品與所述換 能器接觸的腔室內(nèi)。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述腔室具有上表面和下表面，并且所述換能器形 成所述上表面。
8. 如上述任一權(quán)利要求所述的方法，其中樣品含有抗凝劑和/或促凝劑。
9. 一種用于測(cè)定血產(chǎn)品樣品中凝集的裝置，所述血產(chǎn)品樣品含有能夠吸收電磁輻射以 通過(guò)非輻射衰減產(chǎn)生能量的粒子，所述裝置包括： 輻射源，所述輻射源適于產(chǎn)生一系列特定波長(zhǎng)的電磁輻射脈沖，所述波長(zhǎng)使得所述輻 射被所述粒子吸收以通過(guò)非輻射衰減來(lái)產(chǎn)生能量； 含有換能器的樣品腔室，所述換能器具有焦熱電或壓電元件、和能夠?qū)⑼ㄟ^(guò)非輻射衰 減產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)換成電信號(hào)的電極；以及 檢測(cè)器，所述檢測(cè)器能夠檢測(cè)由所述換能器產(chǎn)生的所述電信號(hào)； 其中所述裝置進(jìn)一步包括促凝劑和任選地抗凝劑。
10. 如權(quán)利要求9所述的裝置，其中所述腔室具有上表面和下表面，并且所述換能器形 成所述上表面。
11. 如權(quán)利要求9或10所述的裝置，其中所述裝置由讀出器和盒形成，其中所述盒與所 述讀出器能夠可釋放地接合，并且其中所述讀出器合并所述輻射源和所述檢測(cè)器，并且所 述盒合并所述換能器和所述腔室。
12. 如權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)所述的裝置，其中所述裝置進(jìn)一步包括細(xì)長(zhǎng)的樣品采 集通道，所述樣品采集通道具有開(kāi)口端并且被布置成通過(guò)毛細(xì)管作用來(lái)將流體吸取到所述 通道內(nèi)，其中所述通道具有采集端和遞送端，并且所述遞送端與所述樣品腔室流體連通，并 且其中所述通道沿其長(zhǎng)度的第一部分提供涂覆有抗凝劑的區(qū)域并且沿其長(zhǎng)度的第二部分 提供涂覆有促凝劑的區(qū)域，使得所述樣品在接觸所述第二部分之前接觸所述第一部分。
【文檔編號(hào)】G01N33/86GK104067107SQ201280061233
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月12日
【發(fā)明者】S·A·羅斯, P·B·莫納漢, T·J·N·卡特 申請(qǐng)人:維瓦克塔有限公司