選擇性量化A-β聚集體的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及選擇性量化A-β聚集體的方法，包括將抗A-β抗體固定在基材上，將樣品施加于基材上，加入用于檢測的標(biāo)記的探針，其通過特異性結(jié)合A-β聚集體標(biāo)記這些探針和檢測標(biāo)記的聚集體。
【專利說明】選擇性量化A-β聚集體的方法
[0001]本發(fā)明涉及選擇性量化Α-β聚集體的方法，包括將Α-β捕獲分子固定在基材上，將待研究的樣品施加于基材上，加入用于檢測的標(biāo)記的探針，其通過特異性結(jié)合Α-β聚集體標(biāo)記這些探針,并檢測經(jīng)標(biāo)記的聚集體。
[0002]A-β聚集體出現(xiàn)于阿爾茨海默病(AD，阿耳茨海默氏癡呆，拉丁語=MorbusAlzheimer)。其包括帕金森氏病例如屬于一種由不同種類組成的臨床病癥,其共同標(biāo)準(zhǔn)在許多情況(但不排除其它情況)下是各個特定蛋白質(zhì)以β折疊結(jié)構(gòu)的有序構(gòu)象的細(xì)胞外全身性或局部沉積。由年齡決定的癡呆是當(dāng)今社會中一個越來越大的問題，這是因?yàn)橛捎谔岣叩念A(yù)期壽命，越來越多的人遭受其苦并因此對社會保險系統(tǒng)和其可資助性產(chǎn)生影響。
[0003]內(nèi)源蛋白質(zhì)病理學(xué)聚集體，例如寡聚物或纖絲，出現(xiàn)于許多神經(jīng)變性疾病中。在阿爾茨海默癡呆的情況下，例如在大腦中發(fā)現(xiàn)β淀粉樣肽沉積物(Α-β肽沉積物)和在帕金森氏病情況下，共核蛋白(Synuclein)沉積物。然而，β淀粉樣肽沉積物(或肽_纖絲)僅是過程的最后階段，其以從來自APP(淀粉樣前體蛋白)的單體β淀粉樣肽的分裂開始，然后形成神經(jīng)毒性的β淀粉樣肽寡聚物并最后以斑點(diǎn)中的β淀粉樣肽纖絲的沉積物結(jié)束。AD的主要病理學(xué)特征是由A-β肽組成的老年斑或淀粉樣斑的形成。此外，產(chǎn)生來自Tau蛋白的神經(jīng)纖絲沉積物。A-β肽的前體蛋白質(zhì)，ΑΡΡ，定位于神經(jīng)元的細(xì)胞膜中。通過蛋白質(zhì)水解降解和之后的修飾，由此產(chǎn)生不同長度和類型的A-β片段，例如A-β 1-40,A-β 1-42、或pGluA- β 3-42。單體A- β肽也在健康機(jī)體的整個一生期間都產(chǎn)生。
[0004]按照自1990年代的淀粉樣蛋白級聯(lián)假說，以斑點(diǎn)形式的Α-β沉積物是疾病癥狀的觸發(fā)者。然而近年來，不同的研究表明，特別是小的、自由擴(kuò)散的Α-β寡聚物在所有Α-β類別中具有最大的毒性，并且對AD的發(fā)生和進(jìn)展負(fù)責(zé)。因此，Α-β肽的聚集體與AD發(fā)病機(jī)理直接相關(guān)。
[0005]然而目前，可靠的診斷在引人關(guān)注的臨床癥狀出現(xiàn)以后才是可能的，在這種情況下，以最大90%的可靠性為出發(fā)點(diǎn)。目前存在的至今唯一可靠的診斷可能，直到患者死亡后通過大腦中各種不同改變的組織學(xué)檢測。
[0006]因此，需要鑒定和量化估計A-β聚集體，尤其是小的、自由擴(kuò)散的A-β寡聚物或聚集體的方法。
[0007]迄今為止僅僅描述了幾種表征和量化組織和體液中致病性聚集體或寡聚物的方法。
[0008]與A-β結(jié)合并抑制其聚集的化合物例如由Chafekar等(ChemB1Chem 2007,8,1857-1864)獲知。這些物質(zhì)由A-β肽(KLVFF序列)中的部分組成并用于治療目的，沒有用這些物質(zhì)進(jìn)行組織和體液中的致病性聚集體或寡聚物的表征和量化。
[0009]目前，對于AD，還沒有公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)和/或鑒定，所謂的生物標(biāo)志物。至今這種生物標(biāo)志物的出發(fā)點(diǎn)是使用PET放射性示蹤劑用于成像方法，這基于放射活性標(biāo)記的物質(zhì)結(jié)合淀粉質(zhì)斑塊的假設(shè)并因此在檢測之后可以是斑塊沉積的測量。盡管在PET信號和疾病之間有顯而易見的聯(lián)系，但至今仍不能由此使可靠的診斷成為可能，因?yàn)樵S多沒有老年癡呆的人也表現(xiàn)出高示蹤劑保留。高成本和在儀器上必要的技術(shù)開支對這些方法也是不利的，其中儀器并不是隨處可獲得的。
[0010]作為其它的出發(fā)點(diǎn)，目前正在研究患者的血液或脊髓液(CSF)中多種物質(zhì)的量和分析它們作為生物標(biāo)志物有用性。這些物質(zhì)之一為A-β肽。迄今為止，患者脊髓液中單體A-β含量的測定，可能地與Tau濃度的測定相結(jié)合似乎最可靠。然而，該值有如此高的變化以致不能利用這種生物標(biāo)志物對個體進(jìn)行可靠的診斷。這種方法的應(yīng)用由DE69533623 Τ2獲知。盡管有這些不同的方法，但迄今為止任何可靠的生物標(biāo)志物得到公認(rèn)還是不可能的。
[0011]其它困難是對于A-β聚集體的具體量化與A-β單體和/或A-β總含量相反,迄今為止只有幾種檢測系統(tǒng)可獲得。作為可能的檢測系統(tǒng)，目前采用ELISAs，其中Α-β寡聚物利用抗體檢測。其中所用的抗體識別僅非常特異性的類型的Α-β寡聚物或不是由Α-β肽構(gòu)成的非特異性的其它寡聚物，但在非常不同的蛋白質(zhì)中，其對評價有不利的影響。
[0012]利用構(gòu)象異構(gòu)體-特異性抗體應(yīng)用ELISA支持的方法例如由W02005/018424 Α2獲知。
[0013]作為其它檢測方法，采用夾心ELISA測量法。本發(fā)明中為了固定Α-β分子使用Α-β-特異性抗體。相同的抗體隨后也用于檢測。通過此方法，單體不產(chǎn)生信號，因?yàn)榭贵w結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)被捕獲分子占據(jù)。特定的信號因此只由二聚體或較大的寡聚物產(chǎn)生。然而在該評價中，這樣一種方法僅能夠量化存在于樣品中的所有聚集體的總和而不能表征個別的聚集體。為了可靠地檢測和量化個別的Α-β聚集體，ELISA支持的方法也缺少對此必需的敏感性。此種夾心ELISA法的應(yīng)用由W02008/070229 Α2獲知。
[0014]本發(fā)明的目的要提供一種蛋白質(zhì)聚集疾病、尤其是AD的生物標(biāo)志物，和一種量化和表征Α-β聚集體的超靈敏的方法。通過表征生物標(biāo)志物，即測定體液或組織中該物質(zhì)(生物標(biāo)志物)的數(shù)目、量和/或尺寸，疾病和/或有關(guān)疾病的病程和患者的狀況的信息的確切診斷將成為可能。
[0015]本發(fā)明的其它目的要提供選擇性量化導(dǎo)致和/或表征蛋白質(zhì)聚集疾病的致病性聚集體的方法，尤其是任何尺寸和組成的A-β聚集體、Α-β寡聚物以及同時還有小的、自由擴(kuò)散的A-β寡聚物。
[0016]此目的通過選擇性量化和/或表征A-β聚集體的方法來實(shí)現(xiàn)，包括下列步驟:
[0017]a)將待測樣品施加于基材上，
[0018]b)加入用于檢測的經(jīng)標(biāo)記的探針，其通過特異性結(jié)合A-β聚集體標(biāo)記這些Α_β聚集體，和
[0019]c)檢測標(biāo)記的聚集體，其中步驟b)可在步驟a)之前實(shí)施。
[0020]A-β聚集體或A-β寡聚物的表征指形式、尺寸和/或組成的測定。
[0021]本發(fā)明意義上的術(shù)語A-β單體描述一種肽分子，其為淀粉樣前體蛋白APP的一部分，其以名稱Α-β已知。根據(jù)來源種類(人和/或動物)和加工，Α-β單體的精確氨基酸序列可在長度和特性上變化。
[0022]本發(fā)明意義上的術(shù)語Α-β寡聚物既描述Α-β聚集體又描述Α-β寡聚物以及小的、自由擴(kuò)散的Α-β寡聚物。本發(fā)明意義上的寡聚物為由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19或20個單體或其多倍體形成的聚合物。在此可能的是，A-β寡聚物中A-β單體必須是彼此相同的，但不一定是所有。
[0023]因此Α-β聚集體將理解為既指A-β寡聚物又指小的、自由擴(kuò)散的A-β寡聚物。這還包括聚集體，例如描述了纖絲的片段，“初纖維”、“ADDLs”和p56'對本發(fā)明必要的是:關(guān)于尺寸Α-β聚集體為在體內(nèi)可遷移的聚集體或聚合物而不是由于其固定在體內(nèi)以淀粉樣-β肽斑塊沉積物的形式存在的尺寸。
[0024]作為基材，根據(jù)本發(fā)明選擇具有盡可能低的非特異性的結(jié)合能力的物質(zhì)，特別是鑒于Α-β寡聚物。
[0025]在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，選擇玻璃基材。
[0026]基材可用親水材料涂覆，親水材料優(yōu)選聚-D-賴氨酸、聚乙二醇(PEG)或右旋糖酐。
[0027]在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，將玻璃表面羥基化并隨即用氨基基團(tuán)活化。
[0028]為了制備待涂覆的基材，實(shí)施下列步驟中的一個或多個步驟:
[0029]在超聲波浴或血漿清潔器中洗滌玻璃基材或玻璃載片，作為此步驟的替代，在5MNaOH中溫育至少3小時，
[0030]用水沖洗隨后在氮?dú)庀赂稍铮?br> [0031]浸潰在比例為3: I的濃硫酸和過氧化氫的溶液中以活化羥基基團(tuán)，
[0032]用水沖洗至中性pH，然后用乙醇沖洗并在氮?dú)夥障赂稍铮?br> [0033]浸潰在3-氨基丙基三乙氧基甲硅烷(APTES) (1-7% )在無水甲苯中的溶液或乙醇胺的溶液中，
[0034]用丙酮或DMSO和水沖洗并在氮?dú)夥障赂稍铩?br> [0035]對于用右旋糖酐、優(yōu)選羧甲基右旋糖酐(CMD)包覆，將基材用CMD的水溶液(在10mg/ml或20mg/ml的濃度下)和任選的N-乙基-N-(3- 二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)，(200mM)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，(50mM)溫育，然后洗滌。
[0036]在一種變化中，所述羧甲基右旋糖酐與玻璃表面共價結(jié)合，其按照上面的描述首先被羥基化然后用胺基活化。
[0037]作為基材，也可以使用，微量滴定板，優(yōu)選具有玻璃基底的微量滴定板。由于利用聚苯乙烯框架使用濃硫酸是不可能的,在本發(fā)明的一種實(shí)用的改進(jìn)中按類似于Janissen等(Colloids Surf B B1interfaces，2009，71 (2)，200-207)的方法進(jìn)行玻璃表面的活化。
[0038]在本發(fā)明一種替代方案中，將捕獲分子固定在基材上以俘獲和固定A-β聚集體。
[0039]優(yōu)選地抗A-β抗體用作捕獲分子。
[0040]在一個替代方案中，捕獲分子與基材共價結(jié)合。
[0041]在其它替代方案中，將捕獲分子與涂層、優(yōu)選右旋糖酐層共價結(jié)合。
[0042] 抗A-β抗體特異性結(jié)合A-β聚集體的一個表位。在本發(fā)明的一個替代方案中，表位具有Α-β肽的氨基末端部分的氨基酸序列，其選自部分區(qū)域Α-β 1-8(SEQ IDNO:2), A-β 1-11 (SEQ ID NO:3)，A-β 1—16 (SEQ ID NO:4)，A-β 3-11 (SEQ ID NO:5)和pyroGluA-β 3-11(SEQ ID NO:6)，A-β 11-16(SEQ ID NO:7)和 pyroGluA-β 11-16(SEQ IDNO:8)，例如人N端表位的氨基酸序列(具有下列序列:DAEFRHDSGYE (1-11，SEQ ID NO:3)。
[0043]在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，將捕獲分子(抗體)固定在基材上，任選地在CMD-包覆的載片被EDC/NHS的混合物(分別200和50mM)活化之后。
[0044]可以使剩余的沒有捕獲分子結(jié)合的羧酸端基失活。
[0045]為了使CMD間隔子上的這些羧酸端基失活，使用在DMSO中的乙醇胺。在施加樣品之前，基材或載片用PBS沖洗。
[0046]將待檢測的樣品在如此制備的基材上溫育。
[0047]在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，直接在基材(未包覆的基材)上進(jìn)行樣品的施加，任選地通過共價鍵合在任選地活化的基材的表面上。
[0048]在本發(fā)明的一種變化中，通過下列方法中的一種或多種方法進(jìn)行樣品的預(yù)處理:
[0049]-加熱(最高為樣品的沸點(diǎn)溫度)
[0050]-一個或多個凍融循環(huán)，
[0051]-用水或緩沖液稀釋，
[0052]-用酶，例如蛋白酶、核酸酶、脂肪酶處理，
[0053]-離心，
[0054]-沉淀，
[0055]-與探針競爭，以排擠任何存在的抗A-β抗體。
[0056]在進(jìn)一步的步驟中，A-β聚集體以經(jīng)標(biāo)記的用于以后檢測的探針標(biāo)記。
[0057]在本發(fā)明的一種變化中，抗A-β抗體用作探針。俘獲分子和探針可以相同。
[0058]在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，捕獲分子和探針不同。這樣例如不同的抗A-β抗體可用作捕獲分子和探針。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，除可能的染料標(biāo)記以外使用彼此相同的捕獲分子和探針。在本發(fā)明的可替代的方式中，除可能的染料標(biāo)記以外使用彼此相同的多種探針。在本發(fā)明的其它替代方案中，使用至少2種或更多不同的捕獲分子和/或探針，其來自于不同的抗A- β抗體且任選地還具有不同的染料標(biāo)記。
[0059]然而，不同的分子，諸如不同的抗A-β抗體，也可以用作捕獲分子。俘獲分子可以是 Α-β 肽的特定氨基酸序列，例如 Α-β l-40/42，pyroGlu 3-40/42 或 pyroGlu 11-40/42。
[0060]同樣，若干不同的分子，諸如不同的抗A-β抗體，可以用作探針。
[0061]至于隨后表面的質(zhì)量控制，例如含捕獲分子的涂層的均一性，可以使用以熒光染料標(biāo)記的捕獲分子。為此，優(yōu)選使用沒有受檢測干擾的染料。經(jīng)此隨后的構(gòu)造檢驗(yàn)變成可能，以及測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化。
[0062]在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，特異性結(jié)合A-β肽的N端表位的抗A-β抗體用作探針。
[0063]為了檢測，對探針進(jìn)行標(biāo)記使得它們發(fā)射視覺上可檢測的信號，選自熒光、生物熒光和化學(xué)發(fā)光發(fā)射和吸收。
[0064]在一個替代方案中，探針以染料標(biāo)記。優(yōu)選在此涉及熒光染料。
[0065]在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，使用至少2、3、4、5、6種或更多不同的探針。探針可以既在它們特異性結(jié)合Α-β聚集體方面又在它們不同的標(biāo)記例如以熒光染料標(biāo)記方面不同。
[0066]探針也可以相互組合，其適用于FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)作為檢測法。
[0067]幾種以不同熒光染料標(biāo)記的不同探針的應(yīng)用增加測量中獲得的相關(guān)信號的特異性。另外，Α-β單體的屏蔽也因此變成可能。如果探針和捕獲分子相同，或者二者識別交叉的表位，則Α-β單體的檢測可以尤其被避免。
[0068]在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，使用對特定的A-β聚集體種類特異性的探針，諸如A-β (χ-40，)，Α-β (χ-42)或焦谷氨酸 A-β (3_χ)、焦谷氨酸 A-β (11_χ)。X 為 I 和 40 之間的全體自然數(shù)或42，其中本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)他們對Α-β肽序列的認(rèn)識確定將使用的序列的長度。在其它替代方案中，可以使用對特定的Α-β聚集體形式特異的探針，諸如可商購獲得的抗體“Α-11”或“1-1I”。
[0069]A-β聚集體-特異性的或A-β寡聚物-特異性的探針的使用或用途因此也是本發(fā)明的主題。這些探針特異性結(jié)合特定的Α-β聚集體、或Α-β寡聚物，優(yōu)選地前述的種類。通過特異性結(jié)合特定的A-β聚集體或A-β寡聚物，可以測定A-β聚集體或A-β寡聚物的特性和/或尺寸和結(jié)構(gòu)。
[0070]A-β聚集體-特異性的或A-β寡聚物-特異性的探針因此也是本發(fā)明的主題。
[0071]在其它替代方案中，用熒光染料標(biāo)記的A-β肽可用作探針。
[0072]作為待測的樣品，可以使用體液或組織。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，樣品選自脊髓液(CSF)、血液、血漿和尿。樣品可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同制備步驟完成。
[0073]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是在未處理的樣品、優(yōu)選CSF中測定A-β聚集體的可能。
[0074]測定A-β聚集體的組成、尺寸和/或形式的方法因此也是本發(fā)明的主題。在該方法中，使用上面提及和描述的操作步驟。
[0075]所標(biāo)記的聚集體的檢測通過掃描或其它類型的表面成像法進(jìn)行。檢測優(yōu)選通過共聚焦熒光顯微術(shù)或熒光相關(guān)光譜法(FCS)、尤其與交叉相關(guān)和單粒子免疫溶劑激光掃描檢測法和/或激光掃描顯微術(shù)(LSM)結(jié)合實(shí)施。
[0076]在本發(fā)明的一個替代方案中，檢測以共聚焦激光掃描顯微術(shù)進(jìn)行。
[0077]在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，為此使用激光聚焦，例如應(yīng)用于激光掃描顯微術(shù)、或FCS (熒光相關(guān)光譜系統(tǒng))中，和使用相應(yīng)的超分辨率模式諸如STED或SIM。作為此實(shí)施方式的替代方式，可以用TIRF顯微鏡、及其相應(yīng)的超分辨率模式，諸如STORM或dSTORM進(jìn)行檢測。
[0078]因此在本發(fā)明方法的實(shí)施方式中不包括基于非空間分辨信號的方法,如ELISA或夾心ELISA。
[0079]在檢測中，高空間分辨率是有利的。在本發(fā)明方法的一個實(shí)施方式中，收集其中很多數(shù)據(jù)點(diǎn)使得能夠相對背景信號檢測一個聚集體，其中背景信號例如由儀器-特定的噪聲、其它非特定的信號或非特異性結(jié)合的探針產(chǎn)生。以這種方式，只要空間分辨的事件諸如象素存在就讀出盡可能多的值(讀出值)。通過空間分辨，相對各自的背景測定每一事件因而代表與沒有空間分辨信號的ELISA法相比較的優(yōu)點(diǎn)。
[0080]在一個替代方案中，幾種不同的探針應(yīng)用于本發(fā)明的方法中。結(jié)果，信息，即讀出值，倍增，因?yàn)閷τ诿恳粋€點(diǎn)，對于每一個聚集體或?qū)τ诿恳粋€檢測事件，依賴于產(chǎn)生信號的特定探針接受到分離的信息項(xiàng)。因此對于每個事件信號的特異性增加。因此對于所檢測的每一個聚集體，也可以測定其組成，即聚集體的特性，即Α-β種類，諸如Α-β (1-40)、A-β (1-42)、焦谷氨酸Α-β (3-40/42、11-40/42)或它們的混合物的組成。
[0081]不同探針的數(shù)目在本發(fā)明中只受將要使用的熒光染料的干涉限制。因此可以使用
1、2、3、4種或更多不同的探針-染料組合。
[0082]空間分辨信息對根據(jù)上面描述的方法的評價是必要的。這可以例如是熒光的特性和/或強(qiáng)度。在評價這些所有使用和檢測的探針的數(shù)據(jù)時，根據(jù)本發(fā)明測定聚集體的數(shù)目、及其形式、尺寸和/或它們的其組成。本發(fā)明中可以直接或間接地獲得關(guān)于寡聚物的尺寸的信息，依賴于顆粒是否比所使用的成像方法的空間分辨率小或大，在一個實(shí)施方式中可以使用背景最小化的算法和/或可以應(yīng)用強(qiáng)度閾值。
[0083]作為熒光染料，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的染料。作為替代，可以使用GFP(綠色熒光蛋白)、其軛合物和/或融合蛋白、和量子點(diǎn)。
[0084]通過運(yùn)用內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法，試驗(yàn)結(jié)果客觀地可相互比較因此富有意義。
[0085]在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，運(yùn)用內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法量化A-β聚集體。
[0086]基于對突光強(qiáng)度分布的分析(FIDA-突光強(qiáng)度分布分析)，本發(fā)明的方法為所謂的表面 FIDA(Surface-FIDA)。
[0087]通過選擇俘獲分子和探針分子，可以確定必須具有多大尺寸的寡聚物以便能促進(jìn)檢測(信號)。
[0088]此外，用本發(fā)明的方法對小的、自由擴(kuò)散的A-β聚集體進(jìn)行精確分析也是可能的。由于它們的尺寸，該尺寸低于它們的光學(xué)顯微鏡的分辨率，這些小的Α-β寡聚物可困難地與背景熒光區(qū)分開來(例如由未結(jié)合的抗體產(chǎn)生的)。
[0089]以及極高的靈敏性，本發(fā)明的方法在A-β聚集體的數(shù)目的大范圍內(nèi)還表現(xiàn)出線性。
[0090]本臨時發(fā)明的其它主題是小的、自由擴(kuò)散的A-β聚集體作為檢測和鑒定蛋白質(zhì)聚集疾病、特別是AD的生物標(biāo)志物的用途。本發(fā)明還涉及鑒定和/或檢測蛋白質(zhì)聚集疾病、特別是AD的方法，其特征在于，用上面所述的本發(fā)明方法分析來自患者的體液樣品，優(yōu)選 CSF。
[0091 ] 在本發(fā)明的一種變化中，采用內(nèi)標(biāo)或外標(biāo)。
[0092]這種量化寡聚物或致病性聚集體的標(biāo)準(zhǔn)物，其中寡聚物或致病性聚集體表征蛋白質(zhì)聚集疾病或淀粉樣變性或蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病，其特征在于，聚合物由多肽序列構(gòu)建，其中多肽序列就它們的序列方面在相應(yīng)的部分區(qū)域中與內(nèi)源蛋白質(zhì)是相同的或與內(nèi)源蛋白質(zhì)在相應(yīng)的部分區(qū)域上具有至少50%的同源性，其表征蛋白質(zhì)聚集疾病或淀粉樣變性或蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病，其中聚合物不聚集。
[0093]在本發(fā)明的意義下，作為標(biāo)準(zhǔn)物，描述普遍有效和接受的、固定的參考量，其用于比較和測定特性和/或量，特別是用于測定內(nèi)源蛋白質(zhì)致病聚集體的大小和量。本發(fā)明意義下的標(biāo)準(zhǔn)物可用于儀器和/或測量的校準(zhǔn)。
[0094]在本發(fā)明的意義下，術(shù)語“蛋白質(zhì)聚集疾病”，也包括淀粉樣變性和蛋白質(zhì)錯誤折置疾病。此類疾病的實(shí)例和與此相關(guān)的內(nèi)源蛋白質(zhì)為:關(guān)于AD的A-β蛋白和Tau蛋白，關(guān)于帕金森氏病的α-共核蛋白或關(guān)于朊病毒病例如人克雅氏病(CJD)、羊瘙癢病和牛海綿腦病(BSB)的朊蛋白。
[0095]“同源序列”，在本發(fā)明的意義下，意味著氨基酸序列與造成蛋白質(zhì)聚集疾病的內(nèi)源致病聚集體或寡聚物的氨基酸序列具有至少50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%的同一性。在本說明中，代替術(shù)語“同一性”，同等意義地使用術(shù)語“同源的”或“同源物”。兩個核酸序列或多肽序列之間的同一性通過借助于基于Smith, T.F.和Waterman, M.S(Adv.App1.Math.2:482-489(1981))的算法的BESTFIT程序的比較來計算，通過設(shè)置下列對于氨基酸的參數(shù):空隙產(chǎn)生罰分(Gap creat1n penalty):8,和空隙延伸罰分(Gap extens1npenalty):2 ;和下列對于核酸的參數(shù):空隙產(chǎn)生罰分:50，和空隙延伸罰分:3。優(yōu)選地，兩個核酸序列或多肽序列之間的同一性通過核酸序列/多肽序列相對于各自的總序列長度來確定，如它們通過借助于基于 Needleman, S.B.和 ffunsch, C.D.(J.Mol.B1l.48:443-453)的算法的GAP程序在下列對于氨基酸的參數(shù)的設(shè)置下比較進(jìn)行計算:空隙產(chǎn)生罰分:8和空隙延伸罰分:2 ;和下列對于核酸的參數(shù):空隙產(chǎn)生罰分:50和空隙延伸罰分:3。
[0096]如果兩個氨基酸序列具有相同的氨基酸序列，則它們在本發(fā)明意義上相同。
[0097]術(shù)語內(nèi)源蛋白質(zhì)的“相應(yīng)的部分區(qū)域”理解為這樣的肽序列，其根據(jù)本發(fā)明的定義，具有相同的或以給定百分?jǐn)?shù)同源的單體肽序列，由其構(gòu)建根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物。
[0098]對于根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物根本的是，標(biāo)準(zhǔn)物不聚集，優(yōu)選地通過使用不聚集的單體序列，這是因?yàn)閮?nèi)源蛋白質(zhì)的“相應(yīng)的部分區(qū)域”不對聚集負(fù)責(zé)，或者由于封阻，對聚集負(fù)責(zé)的基團(tuán)不聚集。
[0099]本發(fā)明意義下的聚集體為:
[0100]-顆粒，其由多個優(yōu)選相同的、不是相互共價結(jié)合的結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成，和/或
[0101]-多個單體的非共價團(tuán)聚。
[0102]在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)準(zhǔn)物具有準(zhǔn)確定義的數(shù)目的表位，其為了相應(yīng)探針的結(jié)合而共價地相互連接(間接地或通過氨基酸、間隔子和/或官能團(tuán))。
[0103]本發(fā)明意義下的探針選自由下列組成的組:抗體、納米抗體(Nanobody)和親和抗體(Affibody)。此外，探針是對于待檢測的聚集體具有充分的結(jié)合特異性的所有分子，例如，染料(硫磺素T、剛果紅等)。
[0104]表位的數(shù)目通過使用多肽序列來測定，所述多肽序列就其序列而言與形成表位的內(nèi)源蛋白質(zhì)的那個部分區(qū)域相同，或與該部分區(qū)域具有至少50%的同源性，并且在這種情況下具有表位的生物學(xué)活性。在根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物的構(gòu)建中以所希望的數(shù)目嵌入經(jīng)如此選擇的多肽序列和/或根據(jù)本發(fā)明相互連接。
[0105]根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物為聚合物，其由上面所描述的多肽序列，優(yōu)選地表位構(gòu)建，視情況，包含其他組成要素。
[0106] 在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，上面所描述的多肽序列，優(yōu)選地表位，和/或其具有相應(yīng)表位的生物學(xué)活性的同源物，提供相對于各標(biāo)準(zhǔn)物的剩余單體類型之一的數(shù)目而言和/或相對于所有其他單體的數(shù)目而言相等或更多數(shù)目的單體。
[0107]在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，表位是A- β肽的表位，其選自部分區(qū)域 A-β 1-8 (SEQ ID NO:2)、Α-β 1-11 (SEQ ID NO:3) , A-β 1-16 (SEQ ID NO:4)、A-β 3-11 (SEQ ID NO:5)和pyroGluA-β 3-11 (SEQ ID NO:6)、Α_ β 11-16 (SEQ ID NO:7)和pyroGluA- β 11-16 (SEQ ID NO:8)，例如人N末端表位(具有下列序列:DAEFRHDSGYE (1-11 ；相應(yīng)于 SEQ ID NO:3) ο
[0108]PyroGlu是焦谷氨酸的縮寫，其可以由A-β肽的3和/或11位的谷氨酸殘基形成，在N-末端的殘基被分裂出去之后。
[0109]根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物分子由上面所定義的多肽序列構(gòu)建的聚合物。本發(fā)明意義下的寡聚物為由 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個單體形成的聚合物(單體，理解為上面提到的多肽序列)，或其多倍物，優(yōu)選地2-16、4-16、8-16，特別優(yōu)選地8或16，或其多倍物。
[0110]因此，根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物為根據(jù)本發(fā)明的寡聚物或者聚合物。
[0111]在本發(fā)明的一個備選方案中，所述標(biāo)準(zhǔn)物是水溶性的。
[0112]在本發(fā)明的一個備選方案中，根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物由相同的多肽序列構(gòu)建。
[0113]在本發(fā)明的一個備選方案中，根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物由不同的多肽序列構(gòu)建。
[0114]在本發(fā)明的一個備選方案中，這樣的上面所定義的多肽序列以線性構(gòu)型相互排列。
[0115]在本發(fā)明的一個備選方案中，這樣的上面所定義的多肽序列相互排列成支化的、根據(jù)本發(fā)明的寡聚物。
[0116]在本發(fā)明的一個備選方案中，這樣的上面所定義的多肽序列相互排列成交聯(lián)的、根據(jù)本發(fā)明的寡聚物。
[0117]支化的或交聯(lián)的、根據(jù)本發(fā)明的寡聚物可以借助于賴氨酸或借助于點(diǎn)擊化學(xué)通過單個構(gòu)件的連接來制備。
[0118]如上面所描述的，根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物，即根據(jù)本發(fā)明的寡聚物或聚合物，除了以準(zhǔn)確定義的數(shù)目存在的多肽序列，優(yōu)選地表位外，還可以包含額外的氨基酸、間隔子和/或官能團(tuán)，通過其，多肽序列，優(yōu)選地表位，共價地相互連接。
[0119]在一個備選方案中，排除多肽序列，優(yōu)選地表位與半胱氨酸，特別是借助于半胱氨酸的二硫橋接的直接連接(以避免還原劑解開橋接)。同樣，在另一個變化形式中，排除一方面間隔子與多肽序列和另一方面與半胱氨酸的直接連接。
[0120]在一個備選方案中，本發(fā)明涉及標(biāo)準(zhǔn)物分子，其包含A-β肽的氨基末端部分的拷貝或由Α-β肽的氨基末端部分的拷貝構(gòu)建，所述氨基末端部分選自部分區(qū)域Α-β 1-8 (SEQID NO:2),A-β 1-11(SEQ ID NO:3)、A_β 1-16(SEQ ID NO:4)、A_β 3-11(SEQ ID NO:5)和pyroGluA-β 3-ll(SEQ ID NO:6)、A_β 11-16(SEQ ID NO:7)和 pyroGluA-β 11-16(SEQ IDNO:8)，例如人N末端表位(具有下列序列:DAEFRHDSGYE (1-11)。
[0121]通過官能團(tuán)的表位復(fù)制可以在單個構(gòu)件的合成之前或之后進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物的特征是，多肽序列的共價連接。
[0122]根據(jù)本發(fā)明的待使用的多肽序列可以與A-β全長肽的序列是相同的或者顯示與A-β 全長肽的序列 50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%的同源性。
[0123]備選地，也使用這樣的多肽序列以構(gòu)建根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物分子，其與A-β全長肽的部分區(qū)域是相同的或者顯示與Α-β全長肽的部分區(qū)域50、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%的同源性。
[0124]對于根據(jù)本發(fā)明所使用的序列重要的是，其不(或僅根據(jù)條件受控地)聚集的特性和/或其作為表位的活性。
[0125]在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)物以樹枝體(Dendrimere)構(gòu)建。根據(jù)本發(fā)明的樹枝體從上面所描述的根據(jù)本發(fā)明待使用的多肽序列構(gòu)建并且可以包含中心支架分子。優(yōu)選的是，所述支架分子為鏈霉抗生物素蛋白單體，特別優(yōu)選地聚合物，尤其是四聚體。
[0126]在一個變化形式中，根據(jù)本發(fā)明的樹枝體包含這樣的多肽序列，其具有與A- β肽的部分區(qū)域是相同的或顯示與相應(yīng)的部分區(qū)域至少50%的同源性的序列。
[0127]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“至少50%的同源性”，也理解為更高的同源性，其選自由50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%組成的組。
[0128]標(biāo)準(zhǔn)物，有利地在水中具有較高的溶解度、作為內(nèi)源蛋白質(zhì)致病聚集體或寡聚物的，在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案中由這樣的多肽序列形成，其與Α-β肽的N-末端區(qū)是相同的或具有與其至少50%的的同源性。根據(jù)本發(fā)明，Α-β多肽的N-末端區(qū)，理解為氨基酸序列 A-β 1-8 (SEQ ID NO:2)、A-β 1-11 (SEQ ID NO:3)、A-β 1-16 (SEQ ID NO:4)、A-β 3-11 (SEQ ID NO:5)和pyroGluA-β 3-11 (SEQ ID NO:6)、A_ β 11-16 (SEQ ID NO:7)和pyroGluA-β 11-16 (SEQ ID NO:8)。
[0129]根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物分子可以包含針對至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個不同探針的表位。
[0130]因此可以將對于不同探針特征性的表位嵌入在根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物中，即，使用這樣的多肽序列，其與Α-β肽的不同區(qū)是相同的，或具有與其至少50%的同源性，但具有相應(yīng)表位的活性。
[0131]為此在一個實(shí)施方案中，使用這樣的多肽序列，其與A-β多肽的N-末端區(qū)是相同的或具有至少50%的同源性，以及這樣的多肽序列，其與Α-β多肽的C-末端區(qū)是相同的或具有至少50%的同源性。
[0132]在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)準(zhǔn)物分子包含所謂的間隔子。
[0133]“間隔子”，理解為這樣的分子，其通過共價鍵被嵌入標(biāo)準(zhǔn)物分子中并且具有確定的物理和/或化學(xué)性質(zhì)，通過其標(biāo)準(zhǔn)物分子的性質(zhì)被改變。在根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物的一個實(shí)施方案中，使用親水性或疏水性，優(yōu)選地親水性間隔子。親水性間隔子選自由聚乙二醇、糖、甘油、聚-L-賴氨酸或β-丙氨酸形成的分子的組。
[0134]在本發(fā)明的一個備選方案中，根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物包含(另外的)官能團(tuán)。
[0135]官能團(tuán)，理解為與標(biāo)準(zhǔn)物分子共價連接的分子。在一個變化形式中，所述官能團(tuán)包含生物素基團(tuán)。由此與鏈霉抗生物素蛋白的強(qiáng)的共價鍵合成為可能。因此，包含生物素基團(tuán)的標(biāo)準(zhǔn)物分子可以與包含鏈霉抗生物素蛋白基團(tuán)的分子相連接。如果根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物分子包含生物素和/或鏈霉抗生物素蛋白基團(tuán)，那么可以構(gòu)建更大的標(biāo)準(zhǔn)物或?qū)⒏嗟?，可能地，不同的?biāo)準(zhǔn)物分子連接在一個支架上。
[0136]在本發(fā)明的另一個備選方案中，標(biāo)準(zhǔn)物分子包含用于分光光度測定的染料和/或芳族氨基酸。芳族氨基酸為例如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或組氨酸，或選自該組。由于色氨酸的嵌入，使得溶液中標(biāo)準(zhǔn)物濃度的分光光度法測定成為可能。
[0137]本發(fā)明的進(jìn)一步的目標(biāo)是包含多肽的樹枝體，其就其序列而言在相應(yīng)的部分區(qū)域中與內(nèi)源蛋白質(zhì)是相同的或與內(nèi)源蛋白質(zhì)在相應(yīng)的部分區(qū)域上具有至少50%的同源性，所述內(nèi)源蛋白質(zhì)作為蛋白質(zhì)聚集疾病的特征。
[0138]根據(jù)本發(fā)明的樹枝體可以包含標(biāo)準(zhǔn)物的每個上面所描述的特征或每個其任意組口 ο
[0139]在本發(fā)明的另一個備選方案中，它們是:
[0140]包含準(zhǔn)確定義數(shù)目的用于探針的共價結(jié)合的表位
[0141]包含A-β肽的表位的樹枝體，
[0142]所述樹枝體的特征在于，其在水中具有比作為蛋白質(zhì)聚集疾病的特征的內(nèi)源蛋白質(zhì)致病聚集體更高的溶解度，
[0143]包含官能團(tuán)的樹枝體，
[0144]包含至少一個間隔子分子的樹枝體和/或
[0145]包含用于分光光度法測定的染料和/或芳族氨基酸的樹枝體。
[0146]根據(jù)本發(fā)明，所述樹枝體具有輻射對稱。
[0147]在一個變化形式中,樹枝體第一代的支化通過賴氨酸,特別是三個賴氨酸來實(shí)現(xiàn)。
[0148]在本發(fā)明的另一個備選方案中，在標(biāo)準(zhǔn)物，特別是樹枝體中，所述多肽序列優(yōu)選地表位，不通過與硫原子的鍵合，不通過硫醚鍵和/或不通過半胱氨酸(可能地，借助于通過半胱氨酸的二硫橋接)相互地或與標(biāo)準(zhǔn)物的其他組成要素例如氨基酸、間隔子和/或官能團(tuán)和/或其他上面所描述的組成要素相連接，特別是共價地結(jié)合。同樣，在另一個變化形式中，多肽序列，優(yōu)選地表位，和與其結(jié)合的間隔子不通過與硫原子的鍵合，不通過硫醚鍵和/或不通過半胱氨酸相互地或與標(biāo)準(zhǔn)物的其他組成要素例如氨基酸、其他間隔子和/或官能團(tuán)和/或其他上面所描述的組成要素相連接，特別是共價地結(jié)合。
[0149]本發(fā)明還涉及用于制備如上面所描述的標(biāo)準(zhǔn)物的方法。
[0150]在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物借助于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的肽合成或重組方法制備。
[0151]本發(fā)明的另一個目標(biāo)是上面所描述的標(biāo)準(zhǔn)物或上面所描述的樹枝體用于量化作為蛋白質(zhì)聚集疾病的特征的內(nèi)源蛋白質(zhì)致病聚集體或寡聚物的用途。
[0152]在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，使用標(biāo)準(zhǔn)物以量化A-β寡聚物。
[0153]根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的寡聚物或聚合物用作量化內(nèi)源蛋白質(zhì)的致病性聚集體或寡聚物的方法中的標(biāo)準(zhǔn)物，其中內(nèi)源蛋白質(zhì)用于表征蛋白質(zhì)聚集疾病或淀粉樣變性或蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病。
[0154]本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物應(yīng)用于本發(fā)明的一個實(shí)施方式中用于表面FIDA方法、Elisa(夾心Elisa)或FACS中的校準(zhǔn)。
[0155]在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物的試劑盒。可以將本發(fā)明的試劑盒的化合物和/或組分包裝在容器中，可能地具有/在緩沖液和/或溶液中。備選地，可以將幾個組分包裝在相同的容器中。除此之外或備選地，可以將一個或多個組分吸附在固體載體，例如玻璃板、芯片或尼龍膜上或微滴定板的孔上。試劑盒還可以包含對任一個實(shí)施方案的對于試劑盒的用法的說明書。
[0156]在本發(fā)明的一個備選方案中，通過下列來使用用于量化內(nèi)源蛋白質(zhì)致病聚集體或寡聚物的標(biāo)準(zhǔn)物:
[0157]在第一步中，用探針標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)物或樹枝體并測定與標(biāo)準(zhǔn)物或樹枝體結(jié)合的探針的數(shù)目，
[0158]在第二步中，用探針標(biāo)記作為蛋白質(zhì)聚集疾病的特征的內(nèi)源蛋白質(zhì)致病聚集體或寡聚物，測定各自結(jié)合至致病聚集體或寡聚物的探針的數(shù)目，
[0159]在第三步中，比較來自第I步與來自第2步的各自結(jié)合至標(biāo)準(zhǔn)物或樹枝體的探針的數(shù)目，和
[0160]在第四步中，來自體液的寡聚物的數(shù)目和大小由此得到測定。
[0161]在本發(fā)明的一個變化形式中，根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物，優(yōu)選地樹枝體，被用于表面-FIDA-法的校準(zhǔn)。在第一步中，將來自體液的內(nèi)源致病聚集體，例如A- β聚集體，通過捕捉分子，例如捕捉抗體，固定在玻璃表面上。在A- β聚集體的情況下，可以為此使用N-末端結(jié)合捕捉抗體。在固定化后，通過兩個不同的探針標(biāo)記聚集體。在Α-β聚集體的情況下，使用例如Α-β抗體，兩者都通過N-末端結(jié)合表位結(jié)合。將檢測探針用優(yōu)選地不同的熒光染料標(biāo)記。由此它們在顯微鏡下，例如激光掃描顯微鏡下是可見的。
[0162]根據(jù)本發(fā)明，排除內(nèi)源多肽的單體檢測，通過在檢測系統(tǒng)中使用三種不同的或三種不同地標(biāo)記的探針，其與相似的或相同的表位結(jié)合。備選地或另外地，可以排除單體的檢測，因?yàn)榫哂休^低強(qiáng)度的信號因強(qiáng)度切分點(diǎn)不被評價。這是因?yàn)檩^大的聚集體具有更多個對于這兩個具有不同地標(biāo)記的染料的探針的結(jié)合位點(diǎn)，單體檢測備選地或另外地可以由于這些信號的交叉關(guān)聯(lián)而被排除。
[0163]本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)物可用作檢測中的內(nèi)標(biāo)或外標(biāo)。
[0164]還有本發(fā)明的主題為用于根據(jù)上面所述的方法選擇性量化A-β聚集體的試劑盒。此種試劑盒可含有一種或多種下列組分:
[0165]-玻璃基材，其以疏水物質(zhì)、優(yōu)選右旋糖酐、優(yōu)選羧甲基右旋糖酐涂覆；
[0166]-標(biāo)準(zhǔn)物；
[0167]-捕獲分子；
[0168]-探針；
[0169]-含捕獲分子的基材。
[0170]本發(fā)明試劑盒的化合物和/或組分可包裝在容器中，任選地與緩沖劑和/或溶液一起/在緩沖劑溶液中。作為替代許多組分可包裝在相同的容器中。除這之外或作為這的替代，一種或多種組分可吸收在固體支持體，諸如玻璃板、芯片或尼龍膜上或吸附在微量滴定板的孔上。此外，試劑盒可含有任何一個實(shí)施方案的試劑盒的使用說明。
[0171]在試劑盒的其它改進(jìn)中，上面所述的捕獲分子固定在基材上。此外，試劑盒可含有溶液和/或緩沖液。為了保護(hù)固定在其上的右旋糖酐表面和/或捕獲分子，這些可用溶液或緩沖液覆蓋。
[0172]本發(fā)明的其它主題為本發(fā)明的方法用于AD的診斷、早期診斷和/或預(yù)后的應(yīng)用。
[0173]本發(fā)明的其它主題為本發(fā)明的方法用于監(jiān)測AD的治療和用于監(jiān)測和/或檢驗(yàn)活性物質(zhì)的效力和/或治療的應(yīng)用。這可用于臨床試驗(yàn)、研究中以及用于治療監(jiān)測中。為此，根據(jù)本發(fā)明的方法對樣品進(jìn)行試驗(yàn)并將結(jié)果進(jìn)行比較。
[0174]本發(fā)明的其它主題為本發(fā)明的方法和生物標(biāo)志物用于決定在臨床研究中一個人是否被接受的用途。為此，根據(jù)本發(fā)明的方法對樣品進(jìn)行試驗(yàn)并將參考極限值作出決定。
[0175]本發(fā)明的其它主題為利用本發(fā)明的方法測定活性物質(zhì)的效力和/或治療的方法，在該方法中將由樣品得到的結(jié)果相互比較。樣品為在施用活性物質(zhì)或?qū)嵤┲委熤盎蛑蟆⒒蛟谑┯没钚晕镔|(zhì)或?qū)嵤┲委熤蟮牟煌瑫r間采出的體液?；谠摻Y(jié)果，選擇活性物質(zhì)和/或治療，通過這Α-β聚集體降低發(fā)生。根據(jù)本發(fā)明將結(jié)果與不經(jīng)受活性物質(zhì)和/或治療的對照比較。
實(shí)施例:
[0176]1.在CSF中測定A- β寡聚物(Α- β聚集體)
[0177]1.基材制備
[0178]將玻璃載片在超聲波浴中清潔15分鐘。表面用水沖洗三次并在氮?dú)饬髦懈稍?。將清潔過的載片持浸于3: I (V/V)濃硫酸和過氧化氫的混合物中至少30分鐘以活化羥基基團(tuán)。然后將其用水沖洗直至沖洗水具有中性的pH。在一秒鐘的漂洗步驟中使用99%乙醇然后將載片在氮?dú)饬髦懈稍?。將玻璃載片浸于1-7%的3-氨基-丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)在無水甲苯中的溶液中I至4小時。用5%的APTES和2小時的溫育時間獲得良好的結(jié)果。然后將載玻片用丙酮和水沖洗并在氮?dú)饬髦懈稍铩?
[0179]為了用右旋糖酐包覆，將玻璃表面羥基化然后用氨基基團(tuán)活化。將羧甲基右旋糖酐(CMD)以10mg/ml的濃度溶于水中并與N-乙基-N-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)(200mM)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) (50mM)混合。在10分鐘的預(yù)溫育之后，將溶液于室溫再溫育2小時。然后將玻璃載片用水洗滌。
[0180]2.將作為捕獲分子的抗體固定在包覆的基材上。
[0181]另一表面的活化用EDC/NHS的溶液(200或50mM)進(jìn)行5分鐘。將抗體的溶液加入到該溶液中并于4°C溫育2小時。結(jié)果抗體與CMD-包覆的玻璃表面共價結(jié)合。然后為了使CMD間隔子上剩余的活性羧基端基團(tuán)失活，用IM在DMSO中的乙醇胺溫育15分鐘。然后將基材用PBS洗滌三次。
[0182]3.將A-β聚集體固定在預(yù)處理過的基材上
[0183]將待檢測的樣品在基材上溫育I小時，然后用TBST(0.1% ) (ff/ff)、在TBS緩沖液中的吐溫-20、TBS:50nM Tris_HCl、0.15M nacl, pH7.4)洗滌兩次。
[0184]4.樣品與熒光染料連接用于其標(biāo)記
[0185]使用Nab228、抗小鼠Alexa 633和6 ElO Alexa 488抗體。Nab228 抗體用KIT(熒光標(biāo)記的KIT Alexa-647,Molecular Probes,Karlsruhe,德國)按照廠家的說明進(jìn)行標(biāo)記。將標(biāo)記的抗體在黑暗中于4°C貯存在含有2mM疊氮化鈉的PBS中。
[0186]5.用探針標(biāo)記聚集體
[0187]所用抗體的量依賴于期望的標(biāo)記程度。加入探針并于室溫溫育I小時，然后用TBST洗滌五次和用TBS洗滌兩次。
[0188]6.聚集體的檢測和樣品的試驗(yàn)
[0189]用共聚焦激光掃描顯微鏡LSM 710 (Carl Zeiss, Jena, Germany)進(jìn)行測量。顯微鏡安裝有氬離子激光器和三個氦氖激光器。將激光束聚焦于衍射-限制的0.25飛升的體積點(diǎn)上。測定1000x1000象素的區(qū)域的熒光強(qiáng)度。由于使用不同的探針，進(jìn)行共定位分析。為了獲得代表值，在載片上若干位點(diǎn)處測量該區(qū)域。
[0190]用得自Carl Zeiss, Jena，德國的ZEN2008軟件進(jìn)行測量。
[0191]7.CSF樣品的分析
[0192]用本發(fā)明的方法對26份來自不同患者的CSF樣品進(jìn)行分析。樣品分別源自14位AD患者和12位對照患者(不同年齡的關(guān)于蛋白質(zhì)聚集疾病是健康的)。結(jié)果匯總于附圖1中。結(jié)果表明明顯的組間的差別是可能的。在AD組中Α-β寡聚物的平均值顯著高于對照組。
[0193]8.與MMSE的相關(guān)性
[0194]將本發(fā)明的分析結(jié)果與提供者的MMSE(簡易精神狀態(tài)測試)比較。結(jié)果匯總于附圖2中。根據(jù)該結(jié)果，MMSE試驗(yàn)的評價和本發(fā)明的析的評價之間相關(guān)性變得清晰。
[0195]I1.聚集體標(biāo)準(zhǔn)物的檢測
[0196]1.聚集體標(biāo)準(zhǔn)物的制備
[0197]在一個實(shí)施例中，構(gòu)建A-β寡聚物標(biāo)準(zhǔn)物，其針對結(jié)合A-β抗體的N端具有16個表位(與A-β-(1-11)相對應(yīng)的表位，序列:DAEFRHDSGYE)。
[0198]首先，合成多抗原肽(MAP)，其由四個N端A-β表位Α_β1_11構(gòu)成。將這些多抗原肽按照附圖3Α與三重賴氨酸核偶聯(lián)，其用于通過UV/VIS光譜學(xué)進(jìn)行MAP濃度的精確測定，含有兩個色氨酸。此外，生物素尾端與N-末端連接。這用于四個4-ΜΑΡ單位分別與四聚體的偶合，如附圖3中B部分所示。在4-ΜΑΡ和抗生蛋白鏈菌素的溫育后形成16-ΜΑΡ，如附圖3中C部分所示。通過尺寸排阻色譜法將16-ΜΑΡ與保溫混合物的其它組分分離。
[0199]下一步，將ΜΑΡ-16在PBS中連續(xù)稀釋并用于s F I DA試驗(yàn)檢測A-β寡聚物。
[0200]I玻璃板的制備
[0201]將玻璃微量滴定板在超聲波浴中清潔15分鐘然后用血漿清潔器處理10分鐘。為了活化玻璃表面，將孔在5Μ NaOH中溫育至少3小時，用水沖洗然后在氮?dú)饬髦懈稍?。為了用右旋糖酐包覆，將玻璃表面羥基化然后用氨基基團(tuán)活化。為此，將玻璃板在5Μ乙醇胺在DMSO中的溶液中溫育過夜。下一步，將玻璃用水沖洗并在氮?dú)饬髦懈稍?。將羧甲基右旋糖?CMD)以20mg/ml的濃度溶于水中并與N-乙基-N-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，(200mM)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，(50mM)混合。在10分鐘的預(yù)溫育之后，將溶液于室溫再溫育2小時。然后將玻璃板用水洗滌。
[0202] 3.將作為捕獲分子的抗體固定在包覆的玻璃上
[0203]另一活化用EDC/NHS的溶液(200或50mM)進(jìn)行5分鐘。將抗體的溶液加入到該溶液中并于4°C溫育2小時。結(jié)果，抗體共價結(jié)合于CMD-活化的玻璃表面上。然后為了使CMD間隔子上剩余的活性羧基端基團(tuán)失活，用IM在DMSO中的乙醇胺溫育5分鐘。然后將玻璃用PBS洗滌三次。
[0204]4.將MAP-16固定在預(yù)處理過的玻璃上
[0205]將待檢測的含有MAP-16的樣品在玻璃上溫育I小時，然后用TBST (0.1%) (W/W)、在 TBS 緩沖液中的吐溫-20，TBS:50nM Tris-HCl.0.15M NaCl，ρΗ7.4)洗滌三次。
[0206]5.用熒光染料標(biāo)記探針
[0207]使用6E10-Alexa_488抗體和IC-16抗體。IC16抗體用試劑盒(熒光標(biāo)記的試劑盒Alexa-647,Molecular Probes, Karlsruhe,德國)按照廠家的說明進(jìn)行標(biāo)記。將標(biāo)記的抗體在黑暗中于4°C貯存在含有2mM疊氮化鈉的PBS中。
[0208]6.用探針標(biāo)記聚集體
[0209]加入探針并于室溫溫育I小時，然后用TBST洗滌五次和用水洗滌兩次。
[0210]7.聚集體標(biāo)準(zhǔn)物的檢測
[0211]用共聚焦激光掃描顯微鏡LSM710(Carl Zeiss，Jena，德國)進(jìn)行測量。顯微鏡安裝有氬離子激光器和三個氦氖激光器。以瓷磚掃描模型(Tile-Scan-Modus)進(jìn)行測量，其中對孔中的鄰接面進(jìn)行測量并裝配顯像。每個瓷磚掃描含有3x2單獨(dú)的影像，且每個影像具有213x213 μ m的面積。
[0212]作為替代，在TIRF顯微鏡(TIRF =全內(nèi)反射)進(jìn)行測量，其中TIRF顯微鏡由倒置顯微鏡DMI6000、激光盒和Hamamatsu EM-CXD c9100照相機(jī)構(gòu)成。在瓷磚掃描模式3x3單獨(dú)的顯像中每個的尺寸為109.9x109.9 μ m。
[0213]用軟件“Image J” 進(jìn)行評價((http://rsbweb.nih.goV/i j/)。通過使用不同的探針，可以實(shí)施共定位分析。為此，首先從單獨(dú)象素的強(qiáng)度值中減去截止值(定義為不含MAP-16的陰性對照)。下一步，加入許多共定位的象素，其強(qiáng)度高于零。
[0214]附圖4顯示測量的結(jié)果?？汕宄乜闯鰏FIDA信號，即共定位的象素的量，與MAP-16分子的濃度相關(guān)。
[0215]II1.Α-β聚集體(Α-β寡聚物)與Α-β單體的比較
[0216]1.通過 sFIDA 測定
[0217]為了能排除Α-β單體也被sFIDA檢測到因而Α-β寡聚物的信號被扭曲的可能性，按照J(rèn)ohannson等，F(xiàn)EBS J.2006，273，第2618-2630頁的方案制備A-β單體和寡聚物(由合成的A-β構(gòu)成)，并用系統(tǒng)測試。另外，將A-β寡聚物在PBS中連續(xù)稀釋并在濃度系列中檢驗(yàn)試驗(yàn)的線性。按照上面的描述進(jìn)行測量，Zeiss LSM 710顯微鏡用于檢測并記錄2x25圖像，其中每個圖像的尺寸為213x213 μ m和1024x1024象素。結(jié)果如附圖5所示。A-β寡聚物產(chǎn)生清晰的sFIDA信號，然而Α-β單體不是這樣。根據(jù)附圖5Β可以看出sFIDA信號與Α-β寡聚物的濃度相關(guān)聯(lián)而且非常低的A-β寡聚物濃度對產(chǎn)生正信號是必要的。
[0218]2.FRET 測量
[0219]為了確定對于sFIDA除之前所選擇的數(shù)量的交叉-相關(guān)的象素外的另一信號是否也可產(chǎn)生，進(jìn)行fret測量。fret代表F0rster共振能量轉(zhuǎn)移。在fret中將所激發(fā)的熒光染料的能量轉(zhuǎn)入另一熒光染料中。FRET強(qiáng)度尤其依賴于供體(Donor)和受體(Akz印tor)之間的距離且在最高1nm的范圍內(nèi)可被觀察到。因此在sFIDA中使用FRET以將A-β單體與Α-β寡聚物區(qū)分將是可能的。將與供體染料偶聯(lián)的抗Α-β抗體(例如6E10-Alexa488)和適于此的與能接受的染料偶聯(lián)的抗A-β抗體(例如IC-16-Alexa647)在A-β寡聚物上相互在直接接近處結(jié)合，F(xiàn)RET由于空間接近成為可能。6E10-Alexa-488和IC_16_Alexa647與兩個偶然在彼此的距離小于1nm處固定的A-β單體結(jié)合，將在統(tǒng)計學(xué)上是非常不大可能的。如果占據(jù)以俘獲抗體覆蓋的表位的抗體用于檢測，則概率可降低至零。對于該實(shí)驗(yàn)，A-β單體和Α-β寡聚物通過尺寸排阻色譜法來制備并被固定，而對于sFIDA測量，按照上面的描述進(jìn)行。在以Leica熒光顯微鏡進(jìn)行的隨后的測量中，熒光染料以488nm的波長激動并在705nm的波長下檢測FRET發(fā)射。作為對照，還測量了兩份樣品，其中在每份樣品中僅加入一種熒光染料-偶聯(lián)的抗體。
[0220]在附圖6中很清楚，測量結(jié)果是僅Α-β寡聚物產(chǎn)生FRET信號，而A-β單體或?qū)φ掌凡划a(chǎn)生FRET信號。
[0221]IV.在阿爾茨海默病小鼠模型的脊髓液中測定A-β聚集體
[0222]在進(jìn)一步的研究中，研究了是否sFIDA也適合于在阿爾茨海默病小鼠模型的脊髓液中檢測Α-β聚集體，如果適合的話，在什么稀釋度下進(jìn)行檢測。至于實(shí)驗(yàn)步驟，將來自APP/Psl小鼠的脊髓液和非轉(zhuǎn)基因的對照動物在PBS緩沖液中以1: 10、I: 50和1: 250稀釋并通過sFIDA試驗(yàn)。
[0223]實(shí)驗(yàn)步驟跟上面描述的相似，不過在Leica公司的LSM上進(jìn)行測量。發(fā)現(xiàn)在來自轉(zhuǎn)基因小鼠的兩份樣品之一中甚至在250-倍稀釋度下顯著高的sFIDA信號還可檢測到，除來自非轉(zhuǎn)基因的對照動物的樣品外。每個孔，檢測了 25個1024x4024象素的區(qū)域(每個246 μ m),即孔面積的16%。
[0224]結(jié)果如附圖7所示。結(jié)果表明sFIDA不僅適合于在人中的早期診斷，而且適合于監(jiān)測實(shí)際研究中治療的效力。
[0225]圖表的說明:
[0226]附圖1
[0227]在患者的CSF中測定A- β聚集體
[0228]附圖2
[0229]附圖1的結(jié)果與麗SE的相關(guān)性
[0230]附圖3:
[0231]A-β寡聚物標(biāo)準(zhǔn)物的結(jié)構(gòu)，含16個結(jié)合N端的Α-β抗體的表位，其對應(yīng)于A-β的第一 11個氨基酸(序列:DAEFRHDSGYE)。A)合成4-MAP，由4個與三重賴氨酸核偶聯(lián)的N端Α-β表位1-11構(gòu)成，其含有兩個用于通過UV/VIS光譜學(xué)濃度測定的色氨酸。B和C)為了在各種情況下制備16-ΜΑΡ,四個4-ΜΑΡ通過抗生蛋白鏈菌素四重體(-Teramer)偶聯(lián)。通過尺寸排阻色譜法將ΜΑΡ-16與其它溫育混合物的其它組分分離。
[0232]附圖4:
[0233]在各種濃度下進(jìn)行ΜΑΡ-16的sFIDA測量，在PBS緩沖液中稀釋。不含MAP-16的PBS緩沖液用作陰性對照。A)在激光掃描顯微鏡上進(jìn)行測量(Zeiss LSM 710)。B).在TIRF顯微鏡(Leica)上進(jìn)行測量。
[0234]附圖5:
[0235]A) sFIDA對A- β單體不敏感，但B)檢測A- β寡聚物濃度-依賴地、線性地且具有高靈敏性。Α-β單體和寡聚物由合成的Α-β通過尺寸排阻色譜制備且在PBS緩沖液中稀釋。
[0236]附圖6:
[0237]sFIDA以FRET信號在A- β單體和A- β寡聚物上測量。PBS用作陰性對照。作為其它對照，對樣品進(jìn)行檢測，其中在每份樣品中僅加入一種染料-偶聯(lián)的抗體。供體染料為與Α-β抗體6Ε10偶聯(lián)的Alexa488，且受體染料為與Α-β抗體IC-16偶聯(lián)的Alexa 647。
[0238]附圖7:
[0239]在轉(zhuǎn)基因的(Tg)阿爾茨海默病小鼠模型(APP/PS1)的脊髓液和在非轉(zhuǎn)基因的對照動物(K)中進(jìn)行Α-β寡聚物的sFIDA檢測。作為陰性對照，使用純緩沖液樣品。
【權(quán)利要求】
1.一種選擇性量化和/或表征A-β聚集體的方法，包括下列步驟: a)將待測樣品施加于基材上， b)加入用于檢測的經(jīng)標(biāo)記的探針，其通過特異性結(jié)合Α-β聚集體標(biāo)記這些Α-β聚集體和 c)檢測標(biāo)記的A-β聚集體，其中 步驟a)可在步驟b)之前實(shí)施。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在步驟a)之前將捕獲分子固定在基材上。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，進(jìn)行樣品的預(yù)處理。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，使用玻璃基材。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，基材具有親水性涂層。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，基材用右旋糖酐涂覆。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，所述捕獲分子與基材或與涂層共價結(jié)
8.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，所述捕獲分子用熒光染料標(biāo)記。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，所述捕獲分子為抗A-β抗體。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，所述抗A-β抗體特異性結(jié)合A-β聚集體的表位。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，使用A-β肽-特異性探針。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，所述探針為熒光染料-標(biāo)記的抗A-β抗體。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，使用兩種或兩種以上不同的探針。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，使用兩種或兩種以上具有不同標(biāo)記的熒光染料的探針。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，至少一種探針為特異性結(jié)合A-β肽的N端表位的抗A- β抗體。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，檢測通過空間分辨熒光顯微術(shù)進(jìn)行。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，檢測通過共聚焦熒光顯微術(shù)、熒光相關(guān)光譜法(FCS)進(jìn)行，任選地與交叉相關(guān)和單粒子免疫溶劑激光掃描法、激光掃描顯微術(shù)(LSM)、Wetfeld顯微鏡和/或TIRF顯微鏡，以及相應(yīng)的超分辨率模式STED、SM、STORM、dSTORM 結(jié)合。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于，在檢測中收集很多數(shù)據(jù)點(diǎn)使得能夠相對背景信號檢測單一聚集體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于，只要空間分辨事件存在就讀出盡量多的值。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，腦脊液(CSF，腦脊液)、血液和/或尿用作測量試樣。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，使用內(nèi)標(biāo)或外標(biāo)用于量化A-β聚集體。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，用于量化A-β聚集體的標(biāo)準(zhǔn)物為由多肽序列構(gòu)建的聚合物，其中所述多肽序列就其序列而言在相應(yīng)的部分區(qū)域中與內(nèi)源蛋白質(zhì)是相同的或與那內(nèi)源蛋白質(zhì)在相應(yīng)的部分區(qū)域上具有至少50%的同源性，所述內(nèi)源蛋白質(zhì)引起蛋白質(zhì)聚集疾病或淀粉樣變性或蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病，其中聚合物不聚集。
23.用于根據(jù)前述權(quán)利要求之一來選擇性量化A-β聚集體的試劑盒，含有一種或多種的下列組分: -用疏水物質(zhì)涂覆的玻璃基材， -標(biāo)準(zhǔn)物； -捕獲分子； -探針； -含捕獲分子的基材； -溶液；和 -緩沖液。
24.一種測定活性物質(zhì)和/或用于治療AD的治療方法的效力的方法，其特征在于，實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求1-22之一的方法，并將活性物質(zhì)和/或治療方法根據(jù)它們對A-β聚集體形成的作用相互比較，其中選擇出與對照相比表現(xiàn)出更低的Α-β聚集體形成的那些活性物質(zhì)和/或治療方法。
25.決定在臨床研究或試驗(yàn)中的個體接納的方法，其特征在于，量化和/或表征根據(jù)權(quán)利要求1-22之一的Α-β聚集體并將測量值與閾值比較。
26.Α-β聚集體-特異性的探針。
27.Α-β聚集體-特異性的或A-β寡聚物-特異性的探針的用途，用于特異性結(jié)合特定的Α-β聚集體或A-β寡聚物。
【文檔編號】G01N33/68GK104080807SQ201280064163
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月23日
【發(fā)明者】D·威爾伯爾德, S·A·豐克, L·旺-迪特里希, E·比克曼, O·班納赫 申請人:于利希研究中心有限公司