用于檢測(cè)人乳頭瘤病毒并提供頭頸部鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明描述了用于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的診斷及確定其預(yù)后的方法和試劑盒。一種用于診斷受試者中的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)的示例性方法可包括測(cè)定得自所述受試者的唾液樣品的總蛋白、solCD44和HPV的存在性，以及在多變量分析中使用總蛋白、HPV和CD44水平的組合以確定綜合分?jǐn)?shù)，分?jǐn)?shù)增加到截止點(diǎn)以上因而將患有HNSCC、或其將來(lái)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)升高的受試者與沒(méi)有HNSCC或其將來(lái)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較低的受試者區(qū)分開(kāi)來(lái)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于檢測(cè)人乳頭瘤病毒并提供頭頸部鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后的方 法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本專(zhuān)利申請(qǐng)要求2011年11月15日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)第61/559, 974號(hào)以 及2012年6月1日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)第61/654,595號(hào)的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，它們各自整 體以引用方式并入本文。
[0003] 政府支持確認(rèn)
[0004] 本發(fā)明根據(jù)國(guó)立衛(wèi)生研究院的第R01CA118584-NIH號(hào)資助在政府支持下完成。政 府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005] 本文所公開(kāi)的主題一般涉及用于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的檢測(cè)、治療和預(yù)后的方法和 試劑盒。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC)每年在美國(guó)影響著50,000人并在全世界影響著 600, 000人。主要風(fēng)險(xiǎn)因素包括吸煙和飲酒以及人乳頭瘤病毒（HPV)感染。
[0008] 迄今為止，尚無(wú)得到廣泛接受的HNSCC篩查方案或檢驗(yàn)（參見(jiàn)例如Vokes等 人，N Engl J Med, 328:184-94 (1993) ;Lingen 等人，Curr Opin Oncol, 13:176-82 (2001); Forastiere 等人，N Engl J Med345:1890-1900 (2001) ；Patton, Orol 0ncol,39:708-723(2003) ;0, Hara 等人，Clin 0tolaryngol,27:133-4(2002); Smart，Cancer72:1061-5(1993) ;Sankaranarayanan 等人，Cancer,88:664-73(2000); Sankaranarayanan 等人，Lancet365:1927-33(2005))，原因是金標(biāo)準(zhǔn)（通過(guò)體檢 篩查然后進(jìn)行活組織檢查）具有有限的靈敏性和特異性（分別為64 %和74 % ) (Brocklehurst 等人，Cochrane Database Syst Rev, 11:CD004150(2010))并且分子 診斷測(cè)試仍在開(kāi)發(fā)中（Nagler, Oral Oncol.，45:1006-10 (2009) ;Mahfouz 等人，Eur Arch Otorhinolaryngol，267:851-60 (2010))。使用染料、自體熒光或脫落細(xì)胞學(xué) 的檢測(cè)口腔癌的輔助技術(shù)是可用的，但是最近的評(píng)論提出了它們是否改善早期檢出 率的疑問(wèn)（Patton 等人，J Am Dent Assoc, 139:896-905(2008) ;Lingen 等人，Oral 0ncol44:10-22(2008))。因此，努力已集中于分子診斷工具。測(cè)試唾液的RNA表達(dá)譜 的多項(xiàng)研究（Li 等人，Clin Cancer Res, 10:8442-8450(2004))、微 RNA 發(fā)現(xiàn)（Park 等 人，Clin Cancer Res, 15:5473-5477 (2009))和蛋白質(zhì)組學(xué)分析（Hu 等人，Clin Cancer Res, 14:6246-6252 (2008))顯示出前景，但是有些復(fù)雜并且未得到驗(yàn)證（Nagler, Oral Oncol.，45:1006-10 (2009) ;Mahfouz 等人，Eur Arch Otorhinolaryngol，267:851-60 (2010 ))。因此，大部分患者在晚期才被診斷，此時(shí)治愈率為40%或更低。因此，需要早期檢測(cè)測(cè) 試。 發(fā)明概要
[0009] 根據(jù)在本文具體體現(xiàn)并廣泛描述的所公開(kāi)的材料、化合物、組合物和方法的目的， 所公開(kāi)的主題在一個(gè)方面涉及用于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌檢測(cè)、治療及提供其預(yù)后的方法和試 劑盒。
[0010] 另外的優(yōu)點(diǎn)將在下文的描述中部分地示出，并部分地將通過(guò)該描述顯而易見(jiàn)，或 可通過(guò)實(shí)踐下述方面得以了解。下述優(yōu)點(diǎn)將通過(guò)在所附權(quán)利要求書(shū)中具體指出的要素和組 合而實(shí)現(xiàn)和得到。應(yīng)當(dāng)理解，前文一般性描述和下文詳細(xì)描述均僅僅為示例性和闡釋性的， 而非限制性的。
[0011] 附圖簡(jiǎn)述
[0012] 圖1A至1B是示出了研究中的患者的無(wú)進(jìn)展生存率（PFS)(圖1A)和總生存率（0S) (圖1B)的圖。圖1C是示出了在12、24和36個(gè)月的中位PFS、PFS率和0S的表格。圖1D 是示出了總、中位、最小、最大、平均0S和PFS以及標(biāo)準(zhǔn)偏差的表格。
[0013] 圖2A至2RR是示出了如下表征的受試者中的PFS(圖2A、2C、2E、2G、2I、2K、2M、 20、2Q、2S、2U、2W、2Y、2AA、2CC、2EE、2GG、2II、2KK、2MM、200、2QQ)和 0S(圖 2B、2D、2F、2H、 2J、2L、2N、2P、2R、2T、2V、2X、2Z、2BB、2DD、2FF、2HH、2JJ、2LL、2NN、2PP、2RR)的圖：pl6 細(xì)胞 核對(duì)細(xì)胞質(zhì)/無(wú)染色（圖2A-2B)、pl6+對(duì)pl6_染色（圖2C-2D)、solCD44彡10ng/ml對(duì) solCD44〈10ng/ml (圖 2E-2F)、總蛋白〈lmg/ml 對(duì)彡總蛋白 lmg/ml (圖 2G-2H)、CD44 染色 對(duì)⑶44無(wú)染色（圖21-2J)、⑶44僅細(xì)胞膜/普遍染色對(duì)⑶44無(wú)染色/其他（圖2K-2L)、 EGFR細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)染色對(duì)EGFR細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)無(wú)染色/其他（圖2M-2N)、EGFR細(xì)胞膜 和細(xì)胞質(zhì)對(duì)其他對(duì)無(wú)染色（圖20-2P)、EGFR細(xì)胞膜對(duì)細(xì)胞質(zhì)/無(wú)染色（圖2Q-2R)、EGFR細(xì) 胞膜對(duì)僅細(xì)胞質(zhì)對(duì)無(wú)染色（圖2S-2T)、角質(zhì)化對(duì)非角質(zhì)化（圖2U-2V)、現(xiàn)時(shí)吸煙者對(duì)未/ 曾吸煙者（圖2W-2X)、無(wú)酒精對(duì)輕度/中度酒精對(duì)重度酒精暴露（圖2Y-2Z)、重度對(duì)輕度 /無(wú)酒精暴露（圖2AA-2BB)、唇和口腔癌對(duì)口咽癌（圖2CC-2DD)、I/II期對(duì)III/IV期癌 (圖 2EE-2FF)、I/II/III 期對(duì) IV 期癌（圖 2GG-2HH)、T1-T3 對(duì) T4 癌（圖 2II-2JJ)、N0 對(duì) Nl-N3、Nx (圖2KK-2LL)、女性對(duì)男性（圖2MM-2NN)、白人對(duì)黑人（圖200-2PP)或西班牙對(duì) 非西班牙人（圖2QQ-2RR)。
[0014] 圖3A-3C是示出了⑶44過(guò)表達(dá)增加了增殖（圖3A)、遷移（圖3B)和順鉬耐藥性 (圖3C)的圖。
[0015] 圖4A是⑶44下調(diào)的穩(wěn)定克隆的Western印跡。圖4B是示出了與亂序或野生型 CAL27相比對(duì)于兩個(gè)⑶44siRNA克隆而言在裸小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)抑制。
[0016] 圖5包括組織學(xué)載玻片，其示出了在用⑶44siRNA或亂序序列處理后在CAL27異 種移植物中的CD44、EGFR和pEGFR(Y1068)染色。CD44下調(diào)抑制CAL27異種移植物中的 EGFR表達(dá)及其磷酸化（Y1068)。
[0017] 圖6示出了 pl6_癌癥中pl6、⑶44和EGFR的免疫組織化學(xué)（IHC)染色，其中pl6 染色為細(xì)胞質(zhì)和擴(kuò)散的。在此情況下，CD44在細(xì)胞膜以及在整個(gè)腫瘤中普遍染色。CD44和 EGFR在細(xì)胞膜上共定位，并且也存在一定的EGFR細(xì)胞質(zhì)染色。
[0018] 圖7示出了 pl6+腫瘤中pl6、CD44和EGFR的IHC染色，其中對(duì)于pl6而言細(xì)胞核 強(qiáng)烈染色，并且也存在一定的細(xì)胞質(zhì)染色。然而，CD44細(xì)胞膜染色喪失，僅入侵淋巴細(xì)胞保 持⑶44表達(dá)。EGFR表達(dá)完全未觀察到。 具體實(shí)施萬(wàn)式
[0019] 本文所述的材料、化合物、組合物和方法可通過(guò)參考所公開(kāi)主題的具體方面的以 下詳細(xì)描述以及其中所含的實(shí)施例而容易地理解。
[0020] 在公開(kāi)和描述本發(fā)明的材料、化合物、組合物和方法之前，應(yīng)當(dāng)理解下述方面不限 于具體的合成方法或具體的試劑，因?yàn)樗鼈儺?dāng)然可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本文所用的術(shù)語(yǔ)只 是為了描述特定的方面，并非旨在進(jìn)行限制。
[0021] 另外，在此整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，參考了各種出版物。這些出版物的公開(kāi)內(nèi)容整體據(jù)此以 引用方式并入本申請(qǐng)，以便更全面地描述所公開(kāi)的主題所屬的現(xiàn)有技術(shù)。所公開(kāi)的參考文 獻(xiàn)對(duì)于在該參考文獻(xiàn)所處的句子中討論的其所含內(nèi)容也單獨(dú)地且具體地以引用方式并入 本文。
[0022] 定義
[0023] 在本說(shuō)明書(shū)及其之后的權(quán)利要求書(shū)中，將提及許多術(shù)語(yǔ)，它們應(yīng)被定義為具有以 下含義：
[0024] 在整個(gè)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，詞語(yǔ)"包括"及該詞語(yǔ)的其他形式（諸如"包含"和 "含有"）意指包括但不限于，而并非意圖將其他添加劑、組分、整數(shù)或步驟排除在外。
[0025] 如在說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中所用，單數(shù)形式"一"、"一個(gè)/種"和"該/所述" 包括多個(gè)指代物，除非上下文另有明確指出。
[0026] "任選的"或"任選地"意指隨后描述的事件或情況會(huì)發(fā)生或不會(huì)發(fā)生，并且該描述 包括其中所述事件或情況發(fā)生的情形以及不發(fā)生的情形。
[0027] 范圍可在本文表示為從"約" 一個(gè)特定值和/或至"約"另一個(gè)特定值。"約"可意 指指定值的5%以?xún)?nèi)。當(dāng)表達(dá)這樣的范圍時(shí)，另一個(gè)方面包括從所述一個(gè)特定值和/或至另 一個(gè)特定值。相似地，當(dāng)通過(guò)使用先行詞"約"將值表示為近似值時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解，所述特定值 形成另一個(gè)方面。還應(yīng)當(dāng)理解，范圍每一個(gè)的端點(diǎn)在與另一個(gè)端點(diǎn)的關(guān)系中均是重要的并 獨(dú)立于另一個(gè)端點(diǎn)。也應(yīng)當(dāng)理解，存在本文所公開(kāi)的許多值，并且每個(gè)值也在本文公開(kāi)為除 了該值本身外還包括"約"該特定值。例如，如果公開(kāi)了值"2000"，則也公開(kāi)了"約2000"。 也應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)公開(kāi)一個(gè)值時(shí)，則也公開(kāi)了"小于或等于該值"、"大于或等于該值"以及值之 間的可能范圍，如技術(shù)人員適當(dāng)?shù)乩斫?。例如，如果公開(kāi)了值"2000"，則也公開(kāi)了"小于或等 于2000"以及"大于或等于2000"。也應(yīng)當(dāng)理解，在整個(gè)申請(qǐng)中，以許多不同的格式提供了 數(shù)據(jù)，并且該數(shù)據(jù)代表端點(diǎn)和起點(diǎn)以及數(shù)據(jù)點(diǎn)任何組合的范圍。例如，如果公開(kāi)了特定數(shù)據(jù) 點(diǎn)"10"和特定數(shù)據(jù)點(diǎn)"15"，則應(yīng)當(dāng)理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10 和15以及10和15之間也應(yīng)被視為進(jìn)行了公開(kāi)。也應(yīng)當(dāng)理解，還公開(kāi)了兩個(gè)特定單位之間 的每個(gè)單位。例如，如果公開(kāi)了 1〇和15,則也公開(kāi)了 11、12、13和14。
[0028] 在說(shuō)明書(shū)和最后的權(quán)利要求書(shū)中提及組合物中特定要素或組分的重量份是指組 合物或制品中該要素或組分與任何其他要素或組分之間以重量份表示的重量關(guān)系。因此， 在包含2重量份組分X和5重量份組分Y的配混物中，X和Y以2:5的重量比存在，并且無(wú) 論組合物中是否包含另外的組分均以該比率存在。
[0029] 除非具體指出有相反含義，否則組分的重量百分比（重量％ )基于包含該組分的 制劑或組合物的總重量。
[0030] 術(shù)語(yǔ)"個(gè)體"、"宿主"、"受試者"和"患者"可互換使用以指代為診斷、預(yù)后、施用或 治療目標(biāo)的任何個(gè)體。受試者可以是脊椎動(dòng)物，例如，哺乳動(dòng)物。因此，受試者可以是人類(lèi) 或獸醫(yī)患者。
[0031] "生物標(biāo)志物"是其在組織或細(xì)胞中的表達(dá)水平與正?；蚪】导?xì)胞或組織的表達(dá) 水平相比發(fā)生改變的任何基因或蛋白。
[0032] 術(shù)語(yǔ)"預(yù)后"是本領(lǐng)域中公認(rèn)的并包括關(guān)于疾病的可能過(guò)程或疾病進(jìn)展的預(yù)測(cè)， 特別是關(guān)于疾病緩解、疾病再現(xiàn)、腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡的可能性。"良好預(yù)后"是指受癌癥 (諸如頭頸部鱗狀細(xì)胞癌）影響的患者將保持無(wú)疾?。?，無(wú)癌癥）的可能性。"不良預(yù)后" 意在表示潛在癌癥或腫瘤的再現(xiàn)或復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡的可能性。被歸類(lèi)為具有"良好轉(zhuǎn)歸" 的癌癥患者保持無(wú)潛在癌癥或腫瘤。相比之下，"不良轉(zhuǎn)歸"的癌癥患者經(jīng)歷疾病再現(xiàn)、腫 瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡。在特定的實(shí)施方案中，用于評(píng)估預(yù)后和轉(zhuǎn)歸的時(shí)間范圍為例如短于一 年、一年、兩年、三年、四年、五年、六年、七年、八年、九年、十年、十五年、二十年或更多年。如 本文所用，用于評(píng)估預(yù)后或無(wú)疾病生存時(shí)間的相關(guān)時(shí)間從手術(shù)摘除腫瘤或腫瘤生長(zhǎng)得到控 制、減輕或抑制開(kāi)始。因此，例如，在特定的實(shí)施方案中，"良好預(yù)后"是指頭頸部鱗狀細(xì)胞癌 患者將保持無(wú)潛在癌癥或腫瘤至少五年的一段時(shí)間，更特別是至少十年的一段時(shí)間的可能 性。在本發(fā)明的另外方面，"不良預(yù)后"是指頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者在短于五年，更特別是短 于十年內(nèi)經(jīng)歷疾病再現(xiàn)，腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡的可能性。上面提供的用于評(píng)價(jià)預(yù)后和轉(zhuǎn)歸 的時(shí)間范圍是例證性的，并非意圖進(jìn)行限制。
[0033] 術(shù)語(yǔ)"治療"是指以治愈、改善、穩(wěn)定或預(yù)防疾病、病理狀態(tài)或病癥為目的對(duì)患者進(jìn) 行的醫(yī)學(xué)管理。該術(shù)語(yǔ)包括積極療法，即專(zhuān)門(mén)以改善疾病、病理狀態(tài)或病癥為目的的治療， 并且還包括病因治療，即以除去相關(guān)疾病、病理狀態(tài)或病癥的病因?yàn)槟康牡闹委煛４送?，?術(shù)語(yǔ)還包括姑息治療，即設(shè)計(jì)用于緩解癥狀而非治愈疾病、病理狀態(tài)或病癥的治療；預(yù)防性 治療，即以最大程度降低或者部分或完全抑制相關(guān)疾病、病理狀態(tài)或病癥的發(fā)展為目的的 治療；以及支持性治療，即用于補(bǔ)充另一種以改善相關(guān)疾病、病理狀態(tài)或病癥為目的的特定 療法的治療。
[0034] 術(shù)語(yǔ)"抗體"是指選擇性結(jié)合目標(biāo)抗原的天然或合成抗體。該術(shù)語(yǔ)包括多克隆和 單克隆抗體。除了完整的免疫球蛋白分子外，那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物以及選 擇性結(jié)合目標(biāo)抗原的免疫球蛋白分子的人類(lèi)或人源化形式也包括在術(shù)語(yǔ)"抗體"的范圍內(nèi)。
[0035] 另外，本文公開(kāi)的是可用于所公開(kāi)的方法和組合物的產(chǎn)品、可與所公開(kāi)的方法和 組合物的產(chǎn)品聯(lián)合使用、可用于制備所公開(kāi)的方法和組合物的產(chǎn)品或?yàn)樗_(kāi)的方法和組 合物的產(chǎn)品的材料、化合物、組合物和組分。這些及其他材料在本文予以公開(kāi)，并且應(yīng)當(dāng)理 解，當(dāng)公開(kāi)這些材料的組合、子集、相互作用、群組等時(shí)，雖然可能不會(huì)明確地具體提及這些 化合物的每一個(gè)和集體組合以及排列，但是在本文具體設(shè)想和描述每一個(gè)。例如，如果公開(kāi) 了一種組合物并且討論了可對(duì)該組合物的許多組分進(jìn)行的許多修改，則除非具體地相反指 出，否則具體設(shè)想了可能的每一種組合和排列。該概念適用于本公開(kāi)的所有方面，包括但不 限于組合物以及在制備和使用所公開(kāi)的組合物的方法中的步驟。因此，如果存在可以執(zhí)行 的多個(gè)另外的步驟，則應(yīng)當(dāng)理解，這些另外的步驟的每一個(gè)可通過(guò)所公開(kāi)的方法的任一具 體的方面或多個(gè)方面的組合而執(zhí)行，并且具體設(shè)想了每一個(gè)這樣的組合，它們應(yīng)被視為都 予以了公開(kāi)。
[0036] 現(xiàn)在將詳細(xì)參考所公開(kāi)的材料、化合物、組合物、組分、裝置、制品和方法的具體方 面，其實(shí)例在以下的描述和實(shí)施例中以及在附圖及其之前和以下的描述中不出。
[0037] 生物標(biāo)志物測(cè)定法
[0038] 描述了用于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC)的診斷及確定其預(yù)后的有效、低成本、非 侵入性測(cè)定法。所公開(kāi)的測(cè)定法涉及檢測(cè)得自受試者的樣品中的一種或多種生物標(biāo)志物， 諸如CD44(例如可溶性CD44(solCD44))。Franzmann等人的美國(guó)專(zhuān)利第8, 088, 591號(hào)對(duì)于 其可用于診斷和監(jiān)測(cè)受試者中的HNSCC的生物標(biāo)志物的描述整體以引用方式并入。這些生 物標(biāo)志物的水平升高能夠以高準(zhǔn)確度和特異性將癌癥患者與對(duì)照區(qū)分開(kāi)來(lái)。然而，這些生 物標(biāo)志物在某些受試者群體中降低，盡管存在HNSCC。
[0039] 因此，本發(fā)明公開(kāi)可用于提高HNSCC測(cè)定法的準(zhǔn)確度和特異性的另外的生物標(biāo)志 物和風(fēng)險(xiǎn)因素。例如，已表明，相結(jié)合的solCD44和總蛋白水平在區(qū)分HNSCC與對(duì)照方面比 任一單獨(dú)的標(biāo)志物更有效。然而， S〇lCD44水平在具有人乳頭瘤病毒（HPV)感染的受試者 中可能較低。事實(shí)上，使用s〇lCD44和總蛋白水平的雙變量分析在黑人中最有效，在黑人中 HPV感染不太常見(jiàn)。因此，在多變量分析中包括HPV狀態(tài)可提高測(cè)定法的靈敏性和準(zhǔn)確度并 使得能夠檢測(cè)HPV+HNSCC。
[0040] 其他與HNSCC檢測(cè)或預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物可與總蛋白、sol⑶44和HPV檢測(cè)結(jié)合 使用以提高所公開(kāi)的方法的靈敏性和/或準(zhǔn)確度。例如，s 〇lCD44水平可根據(jù)年齡和吸煙 狀況而變化?？捎糜诙嘧兞糠治龅腍NSCC風(fēng)險(xiǎn)因素和人口因素的實(shí)例包括煙草暴露、酒精 暴露、種族、民族、牙齒健康、性別、教育水平、年齡、一般健康狀況、癌癥家族史、性經(jīng)驗(yàn)和社 會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況，以及在多變量分析中使用一個(gè)或多個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素或人口因素以確定綜合分?jǐn)?shù)。
[0041] 因此，公開(kāi)了涉及所公開(kāi)的生物標(biāo)志物和風(fēng)險(xiǎn)因素的多變量分析以確定各個(gè)受試 者的綜合分?jǐn)?shù)的測(cè)定法以及將所述測(cè)定法用于診斷和預(yù)后的方法。然后可將綜合分?jǐn)?shù)用于 確定受試者中HNSCC的存在性或HNSCC復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。具體地講，可通過(guò)比較陽(yáng)性和陰性對(duì) 照值從經(jīng)驗(yàn)上確定綜合分?jǐn)?shù)截止值。
[0042] 本文所述的生物標(biāo)志物包括基因和蛋白。此類(lèi)生物標(biāo)志物包括含有編碼生物標(biāo)志 物的核酸序列或此序列的互補(bǔ)序列的完整或部分序列的DNA。生物標(biāo)志物核酸還包括含有 所關(guān)注的任何核酸序列的完整或部分序列的RNA。生物標(biāo)志物蛋白是由本發(fā)明的DNA生物 標(biāo)志物編碼的或?qū)?yīng)于本發(fā)明的DNA生物標(biāo)志物的蛋白。生物標(biāo)志物蛋白包含任何生物標(biāo) 志物蛋白或多肽的完整或部分氨基酸序列。生物標(biāo)志物基因和蛋白的片段和變體也包括在 本發(fā)明的范圍內(nèi)。所謂"片段"是指多核苷酸的一部分或氨基酸序列并因而編碼的蛋白的 一部分。為生物標(biāo)志物核苷酸序列的片段的多核苷酸通常包含至少10、15、20、50、75、100、 150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1，000、1，100、1，200、 1，300或1，400個(gè)連續(xù)的核苷酸，或最多存在于本文所公開(kāi)的全長(zhǎng)生物標(biāo)志物多核苷酸中 的核苷酸個(gè)數(shù)。生物標(biāo)志物多核苷酸的片段將通常編碼至少15、25、30、50、100、150、200或 250個(gè)連續(xù)氨基酸，或存在于本發(fā)明的全長(zhǎng)生物標(biāo)志物蛋白中的氨基酸的總數(shù)。"變體"旨在 表示基本上相似的序列。一般來(lái)講，本發(fā)明的特定生物標(biāo)志物的變體將具有通過(guò)序列比對(duì) 程序測(cè)定的與所述生物標(biāo)志物至少約40 %、45 %、50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列同一性。
[0043] 本文所述的生物標(biāo)志物是其過(guò)表達(dá)與癌癥（尤其是HNSCC)預(yù)后相關(guān)的基因和蛋 白。在特定的實(shí)施方案中，在患者樣品中所關(guān)注的生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物組合的選擇性 過(guò)表達(dá)表明不良癌癥預(yù)后。所謂"表明不良預(yù)后"是指特定生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物組合 的過(guò)表達(dá)與潛在癌癥或腫瘤的再現(xiàn)或復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡的可能性增加相關(guān)，如上文所定義。 例如，"表明不良預(yù)后"可表示潛在癌癥或腫瘤的再現(xiàn)或復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或五年內(nèi)（更特別是十 年內(nèi)）死亡的可能性增加。表明不良預(yù)后的生物標(biāo)志物可在本文稱(chēng)為"不良轉(zhuǎn)歸生物標(biāo)志 物"。在其他實(shí)施方案中，不存在所關(guān)注的生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物組合的過(guò)表達(dá)表明良好 預(yù)后。如本文所用，"表明良好預(yù)后"是指患者將保持無(wú)癌癥的可能性增加，如上文所定義。 在一些實(shí)施方案中，"表明良好預(yù)后"是指患者將保持無(wú)癌癥至少五年，更特別是至少十年 的可能性增加。此類(lèi)生物標(biāo)志物可稱(chēng)為"良好轉(zhuǎn)歸生物標(biāo)志物"。
[0044] 所公開(kāi)的生物標(biāo)志物包括其過(guò)表達(dá)（與對(duì)照相比）與HNSCC預(yù)后相關(guān)的基因和/ 或蛋白?；蚧虻鞍着c對(duì)照相比可過(guò)表達(dá)10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90 %、100 %、200 %、300 %、400 %、500 %或更多。生物標(biāo)志物包括表明不良HNSCC預(yù)后的基 因和蛋白（即，不良轉(zhuǎn)歸生物標(biāo)志物）以及表明良好預(yù)后的那些基因和蛋白（即，良好轉(zhuǎn)歸 生物標(biāo)志物）。尤其關(guān)注的生物標(biāo)志物包括在細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的調(diào)控、細(xì)胞周期控制、DNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管生成/淋巴生成或轉(zhuǎn)移中涉及到的基因和蛋白。在 一些實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物調(diào)控組織重塑、細(xì)胞外基質(zhì)降解和相鄰組織浸潤(rùn)中涉及到的 蛋白酶系統(tǒng)。其他生物標(biāo)志物包括基因表達(dá)（諸如高甲基化）的調(diào)控子或微RNA。雖然其 表達(dá)模式表明HNSCC預(yù)后的任何生物標(biāo)志物均可用于實(shí)踐本發(fā)明所公開(kāi)的方法和測(cè)定法， 但是在特定的實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物選自HPV、總蛋白和CD44。在一個(gè)實(shí)施方案中，CD44 生物標(biāo)志物為sol⑶44。
[0045] HPV感染可通過(guò)直接或間接測(cè)量HPV而測(cè)定。三類(lèi)分子測(cè)定法目前可用于檢測(cè)組 織和脫落細(xì)胞樣品中的HPV感染。它們?nèi)慷蓟跈z測(cè)HPV DNA并包括：（1)非擴(kuò)增雜交測(cè) 定法（Southern轉(zhuǎn)移雜交（STH)、斑點(diǎn)印跡雜交（DB)和原位雜交（ISH)) ; (2)信號(hào)擴(kuò)增雜交 測(cè)定法，諸如雜交捕獲測(cè)定法；以及（3)靶標(biāo)擴(kuò)增測(cè)定法，諸如PCR和原位PCR。Southern 印跡雜交需要大量DNA、費(fèi)力并且無(wú)法重現(xiàn)，而原位雜交對(duì)于HPV僅具有中度的靈敏性?；?于PCR的HPV檢測(cè)及其靈敏而又具有特異性。使用該方法，通過(guò)DNA聚合酶在體外擴(kuò)增病 毒DNA以生成足量的靶標(biāo)，然后直接在凝膠上可視化，或（更特異性的方法）使用傳統(tǒng)雜交 方法通過(guò)特異性探針進(jìn)行檢測(cè)。在實(shí)踐中，基于PCR的方法的靈敏性在100ng細(xì)胞DNA的 背景下為約10-100個(gè)HPV病毒基因組。由于PCR可以非常小量的DNA(10-100ng)進(jìn)行，因 此理想的是用于具有低DNA含量的標(biāo)本。
[0046] 目前，唯一可用的經(jīng)FDA批準(zhǔn)的HPV檢測(cè)方法是第二代雜交捕獲測(cè)定法（Hybrid capture II assay) (Qiagen, Valencia, CA)。在該測(cè)定法中，將 HPV DNA 雜交到 RNA 探針，然 后捕獲并通過(guò)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)RNA-DNA雜交體。該測(cè)定法的靈敏性類(lèi)似于基于PCR的測(cè) 定法，其中高靈敏性通過(guò)信號(hào)而實(shí)現(xiàn)，而非靶標(biāo)擴(kuò)增。當(dāng)前的第二代雜交捕獲（HC II)測(cè)定 法具有檢測(cè)每毫升樣品中的lpg HPV(約50, 000個(gè)拷貝）的靈敏性。正確的樣品采集對(duì)于 實(shí)現(xiàn)最高的靈敏性必不可少，并且已表明刷子采樣裝置是最佳的。HC II測(cè)定法包含與13 種高風(fēng)險(xiǎn)（類(lèi)型 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68)和5種低風(fēng)險(xiǎn)（6、11、42、 43、44) HPV類(lèi)型的基因組序列互補(bǔ)的合成的RNA探針。
[0047] 作為另外一種選擇，HPV感染可通過(guò)檢測(cè)病毒mRNA轉(zhuǎn)錄物或通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞蛋白 P16而測(cè)定。HPV要導(dǎo)致癌癥，允許病毒致癌基因 E6和E7 (最初在基底細(xì)胞層中，然后在整 個(gè)上皮中）高水平表達(dá)的持續(xù)性感染和細(xì)胞環(huán)境必不可少。因此，檢測(cè)E6/E7mRNA可比DNA 方法鑒定臨床上更顯著的感染。
[0048] 周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑2A(CDKN2A、pl6Ink4A、pl6)是致癌E6/E7mRNA的表達(dá)增 加的細(xì)胞關(guān)聯(lián)物。HPV致癌基因的主要作用是通過(guò)E6下調(diào)p53,并因而取消細(xì)胞凋亡并從 pRb釋放E2F，其導(dǎo)致細(xì)胞周期的連續(xù)激活。在生理上，E2F激活由Rb蛋白的磷酸化介導(dǎo)。 該通路受到一系列阻斷酶磷酸化PRB(周期蛋白依賴(lài)性激酶）的周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制 劑（尤其是P16)的嚴(yán)格調(diào)控。在具有轉(zhuǎn)化HPV感染的細(xì)胞中，Rb-E2F通路的調(diào)控受到E7 的干擾，并且P16的激活無(wú)下游效應(yīng)。因此，pl6強(qiáng)烈過(guò)表達(dá)并在細(xì)胞中蓄積。已在宮頸癌 前期和宮頸癌的絕大部分中證實(shí)了 P16過(guò)表達(dá)，而在正常組織中，只在極少數(shù)情況下發(fā)現(xiàn) 了 pl6表達(dá)。
[0049] HPV感染的表觀遺傳效應(yīng)也可用于檢測(cè)HPV。HPV+與HPVT1NSCC細(xì)胞系之間的差 異甲基化基因座在Sartor MA等人，Epigenetics6 (6) :777-87(2011)中有所描述，其對(duì)于這 些表觀遺傳譜以引用方式并入。
[0050] 因此，可使用特異性結(jié)合pl6INK4a的抗體檢測(cè)HPV感染。作為另外一種選擇，HPV感 染可通過(guò)檢測(cè)HPVDNA、RNA或蛋白而確定。同樣，HPV感染可通過(guò)檢測(cè)病毒致癌基因（例如 E6/E7)或表觀遺傳改變而確定。
[0051] 方法
[0052] 本發(fā)明公開(kāi)了用于診斷受試者中的HNSCC、對(duì)受試者中的HNSCC腫瘤分期、監(jiān)測(cè) HNSCC治療的效果、或確定經(jīng)診斷患有HNSCC的受試者的預(yù)后、或預(yù)測(cè)HNSCC在受試者中的 復(fù)發(fā)的方法。這些方法各自包括對(duì)得自受試者的身體樣品測(cè)定總蛋白、sol⑶44和HPV的存 在性?？偟鞍住PV和CD44水平的組合可用于多變量分析以確定綜合分?jǐn)?shù)。該方法還可以 包括測(cè)定身體樣品的透明質(zhì)酸（HA)、透明質(zhì)酸酶（HAase)、IL-8或其組合的存在性。HNSCC 風(fēng)險(xiǎn)因素和/或人口因素也可與總蛋白、S〇lCD44和HPV檢測(cè)結(jié)合使用以提高所公開(kāi)的方 法的靈敏性和/或準(zhǔn)確性。
[0053] 多變量分析基于多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)的統(tǒng)計(jì)原理，其涉及一次觀察并分析多于一個(gè)統(tǒng)計(jì) 轉(zhuǎn)歸變量。例如，存在若干可與多變量分析一起使用的回歸方法，包括但不限于廣義線性和 非線性回歸、邏輯和泊松回歸、監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)算法、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、支持向量機(jī)、響應(yīng)面建模和多 元自適應(yīng)回歸樣條。在一些實(shí)施方案中，使用邏輯回歸。
[0054] 例如，多變量分析可首先涉及確定總蛋白、sol⑶44和pl6水平基于諸如種族、性 另IJ、吸煙和飲酒的風(fēng)險(xiǎn)變量而變化的方式。然后可開(kāi)發(fā)數(shù)學(xué)模型，其術(shù)語(yǔ)包括生物標(biāo)志物水 平和風(fēng)險(xiǎn)變量以預(yù)測(cè)癌癥的概率。與術(shù)語(yǔ)相關(guān)的統(tǒng)計(jì)顯著性反映其對(duì)預(yù)測(cè)的重要性。然后 可將數(shù)學(xué)模型用于估計(jì)預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)，其允許建立癌癥的總體概率分?jǐn)?shù)。例如，在研究標(biāo)志物水 平和風(fēng)險(xiǎn)變量（例如種族、性別、吸煙和飲酒）與轉(zhuǎn)歸的關(guān)聯(lián)方式（包括相互作用）后，可 得到涉及生物標(biāo)志物和協(xié)變量的對(duì)數(shù)優(yōu)勢(shì)的擬合模型?；谠撃Ｐ?，可在模型所包括的所 有變量的指定值下估計(jì)患癌癥的分?jǐn)?shù)或預(yù)測(cè)概率。
[0055] 在一些實(shí)施方案中，綜合（預(yù)測(cè)）分?jǐn)?shù)增加到截止點(diǎn)以上可區(qū)分患有HNSCC的受 試者與沒(méi)有HNSCC或其將來(lái)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較低的那些受試者。在一些實(shí)施方案中，綜合分?jǐn)?shù)增 加到截止點(diǎn)以上可確定HNSCC腫瘤分期、預(yù)測(cè)HNSCC治療的有效性、預(yù)測(cè)經(jīng)診斷患有HNSCC 的受試者的預(yù)后或預(yù)測(cè)HNSCC復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。例如，分?jǐn)?shù)增加到截止點(diǎn)以上可與不良預(yù)后或 復(fù)發(fā)可能性相關(guān)。
[0056] 所公開(kāi)的測(cè)定法和方法可用于指導(dǎo)患有HNSCC的受試者或處于發(fā)生HNSCC風(fēng)險(xiǎn)的 受試者的治療性治療。例如，可向具有低綜合分?jǐn)?shù)的受試者給予單模式治療，諸如單獨(dú)的手 術(shù)或放療而非聯(lián)合療法。這將導(dǎo)致與治療相關(guān)的發(fā)病率降低。相比之下，可向具有高綜合 分?jǐn)?shù)的受試者提供更積極的治療，諸如手術(shù)、放療和化療，因?yàn)殍b于疾病的較高死亡風(fēng)險(xiǎn)， 將會(huì)發(fā)生較高的治療相關(guān)發(fā)病率。因此，所公開(kāi)的方法還可以包括通過(guò)手術(shù)、放療、化療、光 動(dòng)力療法、靶向療法或其任何組合對(duì)經(jīng)診斷患有HNSCC或經(jīng)確定具有不良HNSCC預(yù)后的受 試者進(jìn)行治療。
[0057] 所公開(kāi)的生物標(biāo)志物的每一者可使用身體樣品在受試者中進(jìn)行檢測(cè)。所謂"身體 樣品"是指對(duì)可在其中檢測(cè)生物標(biāo)志物的表達(dá)的細(xì)胞、組織或體液的任何取樣。此類(lèi)身體樣 品的實(shí)例包括但不限于血液、淋巴、尿液、婦科體液、活組織檢查樣品和涂片?？捎糜诒景l(fā)明 的體液包括但不限于血液、尿液、唾液、乳頭抽吸液、灌洗液或任何其他身體分泌物或其衍 生物。血液可包括全血、血漿、血清或血液的任何衍生物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，身體樣品 包括口腔含漱液。采集各種身體樣品的方法是本領(lǐng)域中熟知的。
[0058] 所述方法可用于檢測(cè)存在頭頸癌風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體，例如吸煙者、酗酒者和暴露于HPV 病毒的受試者。本文所述的方法還允許與其他已知預(yù)后指標(biāo)的分析相比增強(qiáng)對(duì)HNSCC預(yù)后 的評(píng)估。在特定的方面，靈敏性和特異性等于或大于已知癌癥預(yù)后評(píng)價(jià)方法的靈敏性和特 異性。用于評(píng)估特異性和靈敏性的終點(diǎn)是將使用本發(fā)明的方法預(yù)測(cè)的預(yù)后或轉(zhuǎn)歸（即，在 診斷時(shí)或附近）與實(shí)際的臨床轉(zhuǎn)歸（即，患者是保持無(wú)癌癥還是在規(guī)定的時(shí)間周期內(nèi)出現(xiàn) 復(fù)發(fā)）進(jìn)行比較。如本文所用，"特異性"是指本發(fā)明的方法可準(zhǔn)確鑒定真陰性所處的水平。 在臨床研究中，通過(guò)將真陰性的數(shù)量除以真陰性和假陽(yáng)性的總和而計(jì)算特異性。所謂"靈敏 性"是指本發(fā)明的方法可準(zhǔn)確鑒定真陽(yáng)性樣品所處的水平。在臨床研究中，通過(guò)將真陽(yáng)性的 數(shù)量除以真陽(yáng)性和假陰性的總和而計(jì)算靈敏性。在一些實(shí)施方案中，用于評(píng)價(jià)HNSCC的本 發(fā)明所公開(kāi)的方法的靈敏性為至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高。此外，本發(fā)明的 方法的特異性?xún)?yōu)選地為至少約 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高。在另外的實(shí)施方案中，對(duì) 本發(fā)明的預(yù)后方法的靈敏性和特異性綜合值進(jìn)行評(píng)估。所謂"靈敏性和特異性綜合值"是 指如上文所定義的各個(gè)特異性和靈敏性值的總和。本發(fā)明的方法的靈敏性和特異性綜合值 優(yōu)選地為至少約 105%、110%、115%、120%、130%、140%、150%、160%或更高。
[0059] 如本文所用，"真"和"假"陽(yáng)性和陰性的定義將取決于所考慮的生物標(biāo)志物或生物 標(biāo)志物組合是良好轉(zhuǎn)歸還是不良轉(zhuǎn)歸生物標(biāo)志物。也就是說(shuō)，就良好轉(zhuǎn)歸生物標(biāo)志物（即， 表明良好預(yù)后的那些生物標(biāo)志物）而言，"真陽(yáng)性"是指表現(xiàn)出所關(guān)注的生物標(biāo)志物的過(guò)表 達(dá)的那些樣品（如通過(guò)體檢然后通過(guò)活組織檢查所確定）。病理學(xué)陽(yáng)性活組織檢查表明樣 品是陽(yáng)性還是陰性。
[0060] 如上所述，在一些實(shí)施方案中，使用兩個(gè)或更多個(gè)生物標(biāo)志物，更優(yōu)選地，兩個(gè)或 更多個(gè)互補(bǔ)生物標(biāo)志物。所謂"互補(bǔ)"是指檢測(cè)身體樣品中生物標(biāo)志物的組合導(dǎo)致與僅使 用一種生物標(biāo)志物時(shí)所鑒定的相比在更大百分比的情況下準(zhǔn)確確定癌癥預(yù)后。因此，在一 些情況下，可通過(guò)使用所公開(kāi)的生物標(biāo)志物中的至少兩種更準(zhǔn)確地確定癌癥預(yù)后。
[0061] 在本領(lǐng)域中可用于檢測(cè)生物標(biāo)志物表達(dá)的任何方法均包括在本文中。本發(fā)明的生 物標(biāo)志物的表達(dá)可在核酸水平或蛋白水平上檢測(cè)。所謂"檢測(cè)表達(dá)"是指確定生物標(biāo)志物 基因或蛋白的量或存在性。因此，"檢測(cè)表達(dá)"涵蓋以下情況：確定生物標(biāo)志物未表達(dá)、未以 可檢測(cè)的程度表達(dá)、以低水平表達(dá)、以正常水平表達(dá)或過(guò)表達(dá)。為了確定過(guò)表達(dá)，可將待檢 驗(yàn)的身體樣品與相應(yīng)的樣品進(jìn)行比較。例如，相應(yīng)的身體樣品源于健康人。也就是說(shuō)，"正 常的"表達(dá)水平是生物標(biāo)志物在例如得自未患有HNSCC的人類(lèi)受試者或患者的樣品中的表 達(dá)水平。還可以將身體樣品與得自進(jìn)行HNSCC治療的受試者的相應(yīng)身體樣品進(jìn)行比較。這 樣的樣品可以標(biāo)準(zhǔn)形式存在。在一些實(shí)施方案中，確定生物標(biāo)志物過(guò)表達(dá)不需要身體樣品 與源自健康人的相應(yīng)身體樣品之間的比較。例如，檢測(cè)腫瘤樣品中表明不良預(yù)后的生物標(biāo) 志物的過(guò)表達(dá)可無(wú)需與源自健康人的相應(yīng)樣品進(jìn)行比較。此外，在本發(fā)明的一些方面，所關(guān) 注的生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物組合無(wú)表達(dá)、低表達(dá)或正常表達(dá)（即，不存在過(guò)表達(dá)）提供關(guān) 于患者預(yù)后的有用信息。
[0062] 用于檢測(cè)本發(fā)明的生物標(biāo)志物的表達(dá)的方法包括在核酸或蛋白水平上確定生物 標(biāo)志物的量或存在性的任何方法。此類(lèi)方法在本領(lǐng)域中是熟知的，并包括但不限于橫向流 "試紙"、Western印跡、Northern印跡、Southern印跡、ELISA、免疫沉淀、免疫突光、流式細(xì) 胞術(shù)、免疫組織化學(xué)、核酸雜交技術(shù)、核酸逆轉(zhuǎn)錄方法以及核酸擴(kuò)增方法，例如PCR。在特定 的實(shí)施方案中，使用例如抗特異性生物標(biāo)志物蛋白的抗體在蛋白水平上檢測(cè)生物標(biāo)志物的 表達(dá)。這些抗體可用于各種方法中，諸如Western印跡、ELISA、免疫沉淀或免疫組織化學(xué)技 術(shù)。同樣，可將組織的免疫染色與本領(lǐng)域已知的臨床信息評(píng)估、常規(guī)預(yù)后方法和分子標(biāo)志物 (例如？16°"^和solCD44)的表達(dá)相結(jié)合。以此方式，本發(fā)明所公開(kāi)的方法可允許更準(zhǔn)確地 確定HNSCC預(yù)后。
[0063] 試劑盒
[0064] 本文還提供用于診斷受試者患有HNSCC或確定患有HNSCC的受試者的預(yù)后的試劑 盒。該試劑盒可包含用于測(cè)定pl6 INK4a、sol⑶44和/或總蛋白的裝置。例如，該試劑盒可包 含特異性結(jié)合pl6INK4a的多種抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體包括E6H4抗體克隆的個(gè)體基因 型。該試劑盒還可以包含用于檢測(cè)所包含的抗體的檢測(cè)劑（例如二抗和/或比色劑）。該 試劑盒還可以包含特異性結(jié)合⑶44(例如sol⑶44)的多種抗體。該試劑盒還可以包含用 于確定樣品中的總蛋白濃度的試劑。該試劑盒也可以包含pl6 Iffi4a和/或sol⑶44的參比 樣品。該試劑盒還可以包含試劑盒的使用說(shuō)明（例如，診斷受試者的說(shuō)明）、容器和/或托 架。具體地講，該試劑盒可包含計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)或超鏈接，其使用算法和參考表將檢測(cè)值轉(zhuǎn) 化成綜合分?jǐn)?shù)。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒為橫向流免疫測(cè)定試劑盒。作為另外一種選 擇，該試劑盒可包含多孔板，其任選地包被有特異性結(jié)合pl6 INK4a的抗體、特異性結(jié)合CD44 的抗體或其組合。
[0065] 以下實(shí)施例旨在進(jìn)一步闡述本文所述的方法和組合物的某些方面，而非意圖限制 權(quán)利要求書(shū)的范圍。
[0066] 實(shí)施例
[0067] 在下文示出以下實(shí)施例以闡述根據(jù)所公開(kāi)的主題的方法和結(jié)果。這些實(shí)施例并非 意圖包括本文所公開(kāi)的主題的所有方面，而是闡述代表性方法和結(jié)果。這些實(shí)施例并非意 圖排除對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的本發(fā)明的等同形式和變型形式。
[0068] 已作出了努力以確保關(guān)于數(shù)值（例如量、溫度等）的準(zhǔn)確性，但是應(yīng)當(dāng)考慮一些誤 差和偏差。除非另外指明，否則份數(shù)均為重量份，溫度均以1：表示或處于環(huán)境溫度下，并且 壓力為大氣壓或接近大氣壓。存在反應(yīng)條件（例如組分濃度、溫度、壓力和其他反應(yīng)范圍） 以及可用于優(yōu)化通過(guò)所述工藝得到的產(chǎn)物純度和收率的條件的多種變型形式和組合。將只 需要合理的常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)優(yōu)化此類(lèi)工藝條件。
[0069] 實(shí)施例1 :
[0070] 通過(guò)考察本文所述的標(biāo)志物在其腫瘤為pl6INK4a陽(yáng)性的患者中改善的方式而研究 了本文所述的測(cè)試與HPV相關(guān)HNSCC之間的關(guān)系。對(duì)十四名口咽癌受試者進(jìn)行了評(píng)價(jià)。對(duì) 于各受試者，獲得了得自其腫瘤組織的Pl6 lffi4a免疫組織化學(xué)結(jié)果以及得自其口腔含漱液的 solCD44和蛋白結(jié)果。solCD44和蛋白水平的平均水平在HPV+病例（CD44 :3. 17對(duì)4. 2, p =0.55 ;蛋白：0.83對(duì)1.07,p = 0.49)中較低，但差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性。將使用得自口 腔含漱液的上清液進(jìn)行的s〇lCD44和蛋白測(cè)試與使用得自相同口腔含漱液的沉淀檢測(cè)的 P16INK4a水平相結(jié)合。
[0071] 進(jìn)行了體外測(cè)定以定量測(cè)定得自口腔含漱液沉淀的裂解樣品中的人Pl6lffi4a蛋 白。將相同的沉淀置于200 μ L含有蛋白酶抑制劑（Thermo Scientific)的細(xì)胞裂解緩沖液 (SIGMA)中，以使溶解的pl6INK4a穩(wěn)定化。然后將樣品在95°C加熱10分鐘，其有利于細(xì)胞完 全裂解以更好地檢測(cè)pl6 Iffi4a。使用比色ELISA夾心技術(shù)對(duì)pl6Iffi4a蛋白進(jìn)行了定量，其中使 用包被有pl6 INK4a特異性單克隆抗體E6H4?(Roche mtm laboratories AG)和第二種用HRP標(biāo) 記的pl6INK4a特異性單克隆抗體的微量滴定板。通過(guò)生成基于pl6 INK4a水平（標(biāo)準(zhǔn)品1-6)的 標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行了定量。測(cè)試樣品中的水平通過(guò)基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)推法而確定。將酶標(biāo)儀用 于在450nm的波長(zhǎng)下（參考波長(zhǎng)：620nm)測(cè)量各孔中的吸光度。將基于4參數(shù)方法的計(jì)算 程序用于獲得最終pl6 INK4a樣品濃度。結(jié)果以U/mL陳述，并且對(duì)研究樣品一式兩份地進(jìn)行 測(cè)量，各自的體積為1〇〇μ L。經(jīng)確認(rèn)15U/mL的截止值為適當(dāng)?shù)拈撝?，以通過(guò)多中心臨床研 究（方案號(hào) 9502-06-REG-DE-001)將各個(gè)臨床標(biāo)本分類(lèi)為 Cervatec?pl6INK4a ELISA(Roche mtm laboratories AG)結(jié)果陽(yáng)性。
[0072] 使用該組合方法，在14名HNSCC患者中測(cè)試了與⑶44和蛋白相結(jié)合的pl6INK4a，這 些患者包括患有口腔或口咽鱗狀細(xì)胞癌（CA)或未知原發(fā)癌（UK1CA)的患者。還測(cè)試了三 名健康自愿者（HV)(參見(jiàn)表1)。具有低水平⑶44(截止值設(shè)定為2. 7ng/ml)和蛋白（截止 值設(shè)定為1. 〇mg/ml)的兩名患者具有高于15U/ml的截止值的pl6Iffi4a水平。⑶44和蛋白還 各自鑒定出了未被其他測(cè)試法檢出的腫瘤。因此，向檢查中增加 Pl6lffi4a提高了靈敏性。所 測(cè)試的3名健康自愿者均具有低于截止值的各標(biāo)志物水平。
[0073] 表 1
[0074]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于診斷受試者中的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC)的方法，包括測(cè)定得自所述受 試者的唾液樣品的總蛋白、s 〇lCD44和HPV的存在性，以及在多變量分析中使用總蛋白、HPV 和CD44水平的組合以確定綜合分?jǐn)?shù)，分?jǐn)?shù)增加到截止點(diǎn)以上因而將患有HNSCC、或其將來(lái) 復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)升高的受試者與沒(méi)有HNSCC或其將來(lái)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較低的受試者區(qū)分開(kāi)來(lái)。
2. -種用于確定經(jīng)診斷患有（HNSCC)的受試者的預(yù)后的方法，包括測(cè)定得自所述受試 者的唾液樣品的總蛋白、sol⑶44和HPV的存在性，在多變量分析中使用總蛋白、HPV和⑶44 水平的組合以確定綜合分?jǐn)?shù)，分?jǐn)?shù)增加到截止點(diǎn)以上因而與較差的預(yù)后相關(guān)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的方法，還包括通過(guò)手術(shù)、放療、化療、光動(dòng)力療 法、靶向療法或其任何組合對(duì)經(jīng)診斷患有HNSCC的或經(jīng)確定具有不良預(yù)后的受試者進(jìn)行治 療。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)檢測(cè)pl6INK4a來(lái)檢測(cè)HPV。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)檢測(cè)HPV DNA或RNA、HPV蛋白 或表觀遺傳改變來(lái)檢測(cè)HPV。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，還包括對(duì)所述受試者評(píng)估選自由煙草暴 露、酒精暴露、種族、民族、口腔健康、性別、教育水平和年齡組成的組的一個(gè)或多個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因 素或人口統(tǒng)計(jì)因素，以及在所述多變量分析中使用所述一個(gè)或多個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素或人口統(tǒng)計(jì)因 素以確定所述綜合分?jǐn)?shù)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述唾液樣品為口腔含漱液。
8. -種試劑盒，包括： 特異性結(jié)合pl6INK4a的至少一種抗體； 特異性結(jié)合⑶44的至少一種抗體；以及 用于確定樣品中的總蛋白濃度的試劑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中特異性結(jié)合pl6Iffi4a的所述至少一種抗體包括 E6H4抗體克隆的個(gè)體基因型。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的試劑盒，還包含⑶44參比樣品、pl6參比樣品或其組 合。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)所述的試劑盒，還包含用于檢測(cè)特異性結(jié)合pl6INK4a 的所述抗體、特異性結(jié)合CD44的所述抗體或其組合的一種或多種比色劑。
12. 根據(jù)權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述試劑盒為橫向流免疫測(cè)定 試劑盒。
13. 根據(jù)權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括任選包被有特 異性結(jié)合pl6Iffi4a的所述抗體、特異性結(jié)合CD44的所述抗體或其組合的多孔板。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK104067126SQ201280067010
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2012年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月15日
【發(fā)明者】E·弗蘭茲曼, L·佩雷拉, I·M·賴(lài)斯, R·C·鄧肯 申請(qǐng)人:邁阿密大學(xué)