專利名稱：一種石蠟細(xì)胞芯片接種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種石蠟細(xì)胞芯片接種方法，用于制備石蠟細(xì)胞芯片。
背景技術(shù)：
細(xì)胞芯片技術(shù)是基因細(xì)胞芯片技術(shù)的發(fā)展和延伸，與組織細(xì)胞芯片、蛋白細(xì)胞芯片、抗體細(xì)胞芯片一樣，屬于一種特殊生物細(xì)胞芯片技術(shù)。細(xì)胞芯片技術(shù)可以將數(shù)十個(gè)甚至上千個(gè)不同個(gè)體的臨床細(xì)胞標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計(jì)的順序排列在一張玻片進(jìn)行分析研究，是一種高通量、多樣本的分析工具。細(xì)胞芯片技術(shù)使科研人員能同時(shí)對幾百甚至上千種組織樣本同時(shí)進(jìn)行分析，進(jìn)行某一個(gè)或多個(gè)特定的基因，或與其相關(guān)的表達(dá)產(chǎn)物的研究。該技術(shù)不僅可以與傳統(tǒng)的病理學(xué)技術(shù)、組織化學(xué)及免疫組化技術(shù)相結(jié)合，還可以與DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗體等技術(shù)相結(jié)合，并且可在基因、基因轉(zhuǎn)錄和相關(guān)表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)功能三個(gè)水平上進(jìn)行研究。這對人類基因組學(xué)的研究與發(fā)展，尤其對基因和蛋白質(zhì)與疾病關(guān)系的研究，疾病相關(guān)基因的驗(yàn)證、新藥物的開發(fā)與篩選、疾病的分子診斷，治療過程的追蹤和預(yù)后等方面具有重要的實(shí)際意義和廣闊的市場前景。目前，細(xì)胞芯片的制備還缺乏有效的方法，暫借助于傳統(tǒng)的組織細(xì)胞芯片制備的方法，主要依靠機(jī)械化細(xì)胞芯片制備儀來完成。制備儀包括操作平臺、特殊的打孔采樣裝置和一個(gè)定位系統(tǒng)。打孔采樣裝置對供體細(xì)胞蠟塊進(jìn)行采樣，同時(shí)也可對受體蠟塊進(jìn)行打孔，其孔徑與采樣直徑相同，兩者均可精確定位。制備儀的定位裝置可使穿刺針或受體蠟塊線性移動，從而制備出孔徑、孔距、孔深完全相同的組織微陣列蠟塊。通過切片輔助系統(tǒng)將其轉(zhuǎn)移并固定到硅化和膠化玻片上即成為細(xì)胞芯片。根據(jù)樣本直徑(0.2 2.0mm)不同，在一張45mmX25mm的玻片上可以排列40 2000個(gè)以上的組織標(biāo)本。一般按照樣本數(shù)目的多少，將細(xì)胞芯片分為低密度細(xì)胞芯片(< 200點(diǎn))、中密度細(xì)胞芯片(200 600點(diǎn))和高密度細(xì)胞芯片(> 600點(diǎn))。但目前依據(jù)上述方法制備細(xì)胞芯片有以下不足:第一，現(xiàn)有細(xì)胞芯片制作成本很高。除特殊的儀器設(shè)備外(數(shù)十萬元)，制作I個(gè)細(xì)胞芯片的費(fèi)用在萬元以上，每張切片單價(jià)在50 100元；第二，僅能在已有的石蠟細(xì)胞塊上取樣，組織來源受到限制；第三，根據(jù)現(xiàn)有設(shè)備和方法制備的細(xì)胞芯片，切片量僅約50張，因?yàn)槭窃谠邢瀴K上點(diǎn)孔取樣，細(xì)胞標(biāo)本厚度有限；第四，高密度細(xì)胞芯片雖然通量大，但由于每枚組織微小，難以提供足夠的信息；第五，聚合過程中，細(xì)胞容易彌散，導(dǎo)致不同病例間相互污染；第六，僅在大型研究單位，才有經(jīng)費(fèi)和條件進(jìn)行細(xì)胞芯片的相關(guān)研究，難以推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是開發(fā)一種簡易細(xì)胞芯片接種方法，制備低密度和中密度細(xì)胞芯片，兼顧樣本通量、組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞芯片產(chǎn)量等多方面的要求，尤其可有效避免不同病例間的彌散導(dǎo)致的相互污染，使細(xì)胞芯片技術(shù)的作用得到充分發(fā)揮。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種石蠟細(xì)胞芯片接種方法，其特征在于，具體步驟為:第一步:將細(xì)胞用福爾馬林固定過的腸衣包裹，隨同病理科常規(guī)組織處理程序進(jìn)行處理，至浸蠟的步驟，得到浸好蠟的細(xì)胞標(biāo)本；第二步:將浸好蠟的細(xì)胞標(biāo)本連同腸衣加熱至融化狀態(tài)，打開腸衣，將細(xì)胞及液態(tài)石蠟刮入EP管，混勻后，塑形成所需形狀的細(xì)胞芯片，留存；第三步:將蠟加熱直至融化狀態(tài)，將蠟?zāi)Ｖ苽淇蚍旁谙災(zāi)０迳?，將蠟倒入蠟?zāi)Ｖ苽淇蛑芯酆希灳酆虾?，放?10°C -20°c冰箱2 lOmin，取出，撤下蠟?zāi)０?；第四?將所得的蠟?zāi)＿B同蠟?zāi)Ｖ苽淇蚍胖糜?0 70°C孵箱中5 8min，使蠟?zāi)Ｂ宰冘浐笕〕?，在蠟?zāi)５慕臃N范圍內(nèi)鉆孔，將第二步所得的細(xì)胞芯片種入蠟?zāi)Ｏ鄳?yīng)的孔中；第五步:將第四步中所得的蠟?zāi)７旁诤銣胤跤鋬?nèi)聚合，升溫至54 56°C，I 3h后停止加熱，自然冷卻；第六步:將蠟?zāi)：拖災(zāi)Ｖ苽淇蛑萌?10°C -20°C冰箱10 20min，取出后，側(cè)敲蠟?zāi)Ｖ苽淇?，將蠟?zāi)Ｅc蠟?zāi)Ｖ苽淇蚍蛛x，將所得的蠟?zāi)Ｇ衅螅吹檬灱?xì)胞芯片。優(yōu)選地，所述第二步中的細(xì)胞柱的形狀為長方體形、正方體形、管狀或圓柱狀。優(yōu)選地，所述第三步中的臘模制備框?yàn)槟透邷夭牧现谱?，長為30mm 40mm,寬為15mm 30mm,高為 10mm 15mm,壁厚為 2mm 4mmη優(yōu)選地，所述第三步中的臘模板為耐高溫材料制作，長為60mm 70mm,寬為30mm 40mm,厚為5mm IOmm,其中央設(shè)有一個(gè)由四條凹槽圍成的長方形區(qū)域,所述的凹槽的寬為2mm 4mm,深為Imm,凹槽可與臘?？蚯逗?長方形區(qū)域的長為30mm 40mm,寬為15mm 30mm,長方形區(qū)域內(nèi)設(shè)有4 10條橫向凹槽及6 15條縱向凹槽,橫向凹槽和縱向凹槽將長方形區(qū)域分隔成24 150凸出的網(wǎng)格，網(wǎng)格長Imm 3mm,寬Imm 3mm,其中橫向第一排網(wǎng)格表面刻有鏡像數(shù)字或鏡像字母狀凹陷，縱向第一排第二個(gè)網(wǎng)格起刻有鏡像字母或鏡像數(shù)字狀凹陷，其余網(wǎng)格表面有一直徑為1_的圓形凸起。本發(fā)明的接種方法中，細(xì)胞由腸衣包裹后浸蠟，可以保證細(xì)胞量在操作過程中不流失，聚合時(shí)不需要完全融化石蠟，即可使細(xì)胞芯片與周圍蠟完美聚合，防止細(xì)胞芯片融化后細(xì)胞彌散。本發(fā)明利用石蠟易溶解、易聚合的特性，使需要的細(xì)胞在一定溫度下接種在石蠟上，按照一定的順序排列，石蠟將組織疏松地黏附在一起，最后用石蠟將細(xì)胞完全聚合，切片后便得到所需要的細(xì)胞芯片。本發(fā)明具有廉價(jià)、方便、簡潔、快速、產(chǎn)量高、塑形多樣的優(yōu)點(diǎn)，能普及至每一個(gè)病理科及相關(guān)研究單位。


圖1為蠟?zāi)Ｖ苽淇蚝拖災(zāi)０迨疽鈭D；圖2為蠟?zāi)Ｖ谱鬟^程示意圖；圖3為蠟?zāi)Ｊ疽鈭D；圖4為鋼針鉆孔示意圖；圖5為細(xì)胞芯片接種不意圖；圖6為接種細(xì)胞芯片的臘|旲不意圖7為包埋細(xì)胞芯片的蠟塊示意圖。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更明顯易懂，茲以優(yōu)選實(shí)施例，并配合附圖作詳細(xì)說明如下。實(shí)施例1—種石蠟細(xì)胞芯片接種方法，具體步驟為:(I)細(xì)胞芯片的獲取:將細(xì)胞用福爾馬林固定過的腸衣包裹，隨同病理科常規(guī)組織處理程序進(jìn)行處理，至浸蠟的步驟，得到浸好蠟的細(xì)胞標(biāo)本，留存。將浸好蠟的細(xì)胞標(biāo)本連同腸衣加熱至融化狀態(tài)，打開腸衣，將細(xì)胞及液態(tài)石蠟刮入EP管，混勻后，塑形成圓柱狀細(xì)胞芯片，留存。所述的細(xì)胞芯片組織大小和形狀可根據(jù)研究需要自行確定，要求包埋面平整。(2)蠟?zāi)５闹苽?如圖1所示，準(zhǔn)備蠟?zāi)Ｖ苽淇騃和蠟?zāi)０?，蠟?zāi)Ｖ苽淇騃為耐高溫材料制作，長為36mm,寬為29mm,高為IOmm,壁厚為0.2mm,臘模板2為耐高溫塑料制作，長為70mm,寬為40mm,厚為IOmm,其中央設(shè)有一個(gè)由四條凹槽圍成的長方形區(qū)域,所述的凹槽的寬為3mm,深為Imm,凹槽可與臘模框嵌合，長方形區(qū)域的長為36mm,寬為29mm,長方形區(qū)域內(nèi)設(shè)有9條橫向凹槽及12條縱向凹槽，橫向凹槽和縱向凹槽將長方形區(qū)域分隔成108個(gè)凸出的網(wǎng)格，網(wǎng)格長3mm,寬3mm,其中橫向第一排網(wǎng)格表面刻有鏡像數(shù)字狀凹陷，縱向第一排第二個(gè)網(wǎng)格起刻有鏡像字母狀凹陷，其余網(wǎng)格表面有一直徑為1_的圓形凸起。將蠟放入蠟壺，用電爐加熱直至融化狀態(tài)，將蠟?zāi)Ｖ苽淇騃放在蠟?zāi)０?上，如圖2所示，將蠟3倒入蠟?zāi)Ｖ苽淇騃內(nèi)聚合，待蠟3聚合后，放入-20°C冰箱5min，取出，撤下蠟?zāi)０?，蠟?zāi)０?上的刻度顯示在如圖3所示的蠟?zāi)?上，此面即為細(xì)胞芯片接種面。將制備好蠟?zāi)?連同蠟?zāi)Ｖ苽淇騃置于60°C孵箱中5min，使蠟?zāi)?略變軟后取出(注意時(shí)間不宜太久，以免蠟?zāi)Ｈ刍?，?dǎo)致蠟?zāi)Ｃ娌黄秸?;(3)在臘模接種面的選定點(diǎn),如圖4所示,用鋼針5鉆孔,種入標(biāo)記起始點(diǎn)的細(xì)胞芯片6 ;然后依次在接種范圍區(qū)鉆孔，深度根據(jù)細(xì)胞芯片6的長度調(diào)整，如圖5所示，將已準(zhǔn)備好的細(xì)胞芯片6種入蠟?zāi)?相應(yīng)的孔中，此時(shí)蠟?zāi)?有很大的韌性，孔的大小可根據(jù)即將接種的細(xì)胞芯片6的大小而決定。通常鉆一個(gè)孔，接種一個(gè)細(xì)胞芯片6，以免順序混亂，接種后立即記錄相應(yīng)細(xì)胞芯片6在蠟?zāi)?中的位置；接種過程中，蠟?zāi)?逐漸變硬，可再置入60°C孵箱中5min，待蠟?zāi)?變軟后繼續(xù)接種，直至完成接種，得到如圖6所示的接種細(xì)胞芯片的蠟?zāi)? ;蠟?zāi)Ｈ暨€有剩余位置，可留待以后繼續(xù)接種細(xì)胞芯片。(4)將接種細(xì)胞芯片的蠟?zāi)?放在恒溫孵育箱內(nèi)進(jìn)行聚合，升溫至56 °C，2h后停止加熱，自然冷卻；連同臘模制備框I 一同取下。(5)將接種細(xì)胞芯片的蠟?zāi)?置入_20°C冰箱IOmin后取出，輕輕側(cè)敲蠟?zāi)Ｖ苽淇?，將接種細(xì)胞芯片的蠟?zāi)?與蠟?zāi)Ｖ苽淇騃分離，接種細(xì)胞芯片的蠟?zāi)?即可脫出，取下，包埋細(xì)胞芯片的蠟塊8即制備完成，如圖7所示，用常規(guī)切片機(jī)切片，撈片時(shí)請注意起始點(diǎn)順序。
權(quán)利要求
1.一種石蠟細(xì)胞芯片接種方法，其特征在于，具體步驟為: 第一步:將細(xì)胞用福爾馬林固定過的腸衣包裹，隨同病理科常規(guī)組織處理程序進(jìn)行處理，至浸蠟的步驟，得到浸好蠟的細(xì)胞標(biāo)本； 第二步:將浸好蠟的細(xì)胞標(biāo)本連同腸衣加熱至融化狀態(tài)，打開腸衣，將細(xì)胞及液態(tài)石蠟刮入EP管，混勻后，塑形成所需形狀的細(xì)胞芯片，留存； 第三步:將蠟加熱直至融化狀態(tài)，將蠟?zāi)Ｖ苽淇蚍旁谙災(zāi)０迳?，將蠟倒入蠟?zāi)Ｖ苽淇蛑芯酆?，待蠟聚合后，放?10°C -20°C冰箱2 lOmin，取出，撤下蠟?zāi)０澹? 第四步:將所得的蠟?zāi)＿B同蠟?zāi)Ｖ苽淇蚍胖糜?0 70°C孵箱中5 8min，使蠟?zāi)Ｂ宰冘浐笕〕觯谙災(zāi)５慕臃N范圍內(nèi)鉆孔，將第二步所得的細(xì)胞芯片種入蠟?zāi)Ｏ鄳?yīng)的孔中； 第五步:將第四步中所得的蠟?zāi)７旁诤銣胤跤鋬?nèi)聚合，升溫至54 56°C，I 3h后停止加熱，自然冷卻； 第六步:將蠟?zāi)：拖災(zāi)Ｖ苽淇蛑萌?10°C -20°C冰箱10 20min，取出后，側(cè)敲蠟?zāi)Ｖ苽淇?，將蠟?zāi)Ｅc蠟?zāi)Ｖ苽淇蚍蛛x，將所得的蠟?zāi)Ｇ衅螅吹檬灱?xì)胞芯片。
2.按權(quán)利要求1所述的石蠟細(xì)胞芯片接種方法，其特征在于，所述第二步中的細(xì)胞柱的形狀為長方體形、正方體形、管狀或柱狀。
3.按權(quán)利要求1所述的石蠟細(xì)胞芯片接種方法，其特征在于，所述第三步中的蠟?zāi)Ｖ苽淇驗(yàn)槟透邷夭牧现谱鳎L為30mm 40mm,寬為15mm 30mm,高為IOmm 15mm,壁厚為2mm 4mm η
4.按權(quán)利要求1所述的石蠟細(xì)胞芯片接種方法，其特征在于，所述第三步中的蠟?zāi)０鍨槟透邷夭牧现谱鳎L為60mm 70mm,寬為30mm 40mm,厚為5mm IOmm,其中央設(shè)有一個(gè)由四條凹槽圍成的長方形區(qū)域，所述的凹槽的寬為2mm 4mm,深為Imm,凹槽可與臘?？蚯逗希L方形區(qū)域的長為30mm 40mm,寬為15mm 30mm,長方形區(qū)域內(nèi)設(shè)有4 10條橫向凹槽及6 15條縱向凹槽，橫向凹槽和縱向凹槽將長方形區(qū)域分隔成24 150凸出的網(wǎng)格，網(wǎng)格長Imm 3mm,寬Imm 3mm,其中橫向第一排網(wǎng)格表面刻有鏡像數(shù)字或鏡像字母狀凹陷，縱向第一排第二個(gè)網(wǎng)格起刻有鏡像字母或鏡像數(shù)字狀凹陷，其余網(wǎng)格表面有一直徑為Imm的圓形凸起。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種石蠟細(xì)胞芯片接種方法，其特征在于，具體步驟為將細(xì)胞用福爾馬林固定過的腸衣包裹，處理至浸蠟的步驟，得到浸好蠟的細(xì)胞標(biāo)本，加熱至融化狀態(tài)，打開腸衣，將細(xì)胞及液態(tài)石蠟刮入EP管，混勻后，塑形成所需形狀的細(xì)胞芯片；將蠟?zāi)Ｖ苽淇蚍旁谙災(zāi)０迳希瑢⑾灥谷胂災(zāi)Ｖ苽淇蛑芯酆?，取出，撤下蠟?zāi)０?；將所得的蠟?zāi)＿B同蠟?zāi)Ｖ苽淇蚍胖糜诜跸渲?，使蠟?zāi)Ｂ宰冘浐笕〕觯谙災(zāi)５慕臃N范圍內(nèi)鉆孔，將細(xì)胞芯片種入蠟?zāi)Ｏ鄳?yīng)的孔中；蠟?zāi)７旁诤銣胤跤鋬?nèi)聚合；將蠟?zāi)：拖災(zāi)Ｖ苽淇蛑萌氡?，取出后，?cè)敲蠟?zāi)Ｖ苽淇?，將蠟?zāi)Ｅc蠟?zāi)Ｖ苽淇蚍蛛x，將所得的蠟?zāi)Ｇ衅?，即得石蠟?xì)胞芯片。本發(fā)明具有廉價(jià)、方便、快速、產(chǎn)量高、塑形多樣的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N1/36GK103091151SQ20131000223
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月4日
發(fā)明者侯英勇, 石園, 胡沁, 何德明, 蔣冬先, 宿杰阿克蘇, 曾海英, 譚云山 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院