專利名稱：一種定量檢測(cè)蛋白乙酰化水平的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)，涉及一種定量檢測(cè)乙酰化蛋白的方法。
背景技術(shù)：
蛋白乙?；揎検且环N重要的翻譯后修飾，其參與多種細(xì)胞生物過(guò)程的調(diào)控，比如基因轉(zhuǎn)錄(Bioessays, 1998, 20(8) :615-626)、細(xì)胞調(diào)亡(Molecularcell,2004. 13(5):627-638),細(xì)胞分化(The Journal of Immunology, 2008, 181(7):4545)、DNA 修復(fù)(Journal of Biological Chemistry, 2010，285 (7) :4398),同時(shí)乙酸化修飾與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也有密切關(guān)系(Science’s STKE, 2000, 19(6) :1176)。但在研究乙?；g后修飾中，存在蛋白質(zhì)乙?；揎椵^難產(chǎn)生親和力強(qiáng)的抗體，且利用抗原-抗體相互作用免疫沉淀反應(yīng)富集細(xì)胞中的乙?；鞍踪|(zhì)非常困難等問(wèn)題；從化學(xué)的角度講，乙?；鄬?duì)穩(wěn)定，尚未找到合適的，類似于磷酸化(Molecular& Cellular Proteomics, 2007，6 (9) : 1656-1665)和糖基化修飾(Journal of ProteomeResearch, 2009, 8 (2) : 662-672)基于化學(xué)鍵結(jié)合的富集材料。因此目前還缺乏快速、非放射定量檢測(cè)蛋白乙?；降膶?shí)用方法?；谝陨咸攸c(diǎn)，蛋白芯片具有樣品處理簡(jiǎn)單，樣品用量少，高通量，特異性和靈敏度高，可以定量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞因子，凝集素等。專利中描述了制備蛋白芯片以及利用蛋白芯片檢測(cè)蛋白乙?；椒椒?，該法克服了用乙酰化抗體直接免疫沉淀富集時(shí)抗體親和力弱而難以高效富集的弊端，為建立高通量蛋白質(zhì)乙?；揎棽町愖V分析提供技術(shù)平`臺(tái)，有利于探討乙?；綘顟B(tài)對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速簡(jiǎn)便的定量檢測(cè)乙?；鞍椎姆椒?。本發(fā)明利用抗原抗體相互作用原理，制備蛋白芯片，應(yīng)用蛋白芯片定量檢測(cè)蛋白乙?；健１景l(fā)明提供的一種定量檢測(cè)蛋白乙?；降姆椒ǎ唧w步驟如下
(1)制備蛋白芯片
利用芯片點(diǎn)樣儀器，在三維凝膠芯片上點(diǎn)l-3nL蛋白抗體PBS溶液，點(diǎn)好后儲(chǔ)存于4°C冰箱待用，其中所述蛋白抗體PBS溶液的質(zhì)量-體積濃度為100-30(^g/ml ；
(2)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
將上述制備好的蛋白芯片，用山羊血清PBS-T溶液封閉1-2小時(shí)，洗滌，甩干；之后用磷酸緩沖液稀釋得到的10倍稀釋的肝癌病人血清作為稀釋液稀釋乙酰化蛋白抗原得到的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)乙?；鞍卓乖芤悍跤?-2小時(shí)，洗滌，甩干；接著用生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體PBS溶液孵育1-2小時(shí)，洗滌，甩干；再用熒光標(biāo)記的鏈霉素PBS溶液孵育0. 5-1小時(shí)，洗滌，甩干；最后利用激光共聚焦芯片掃描儀掃描上述處理完畢的芯片，檢測(cè)點(diǎn)樣點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)乙酰化蛋白抗原溶液濃度和信號(hào)之間的線性關(guān)系；其中，所述山羊血清PBS-T溶液的體積百分比濃度為O. 1%_10%，所述標(biāo)準(zhǔn)乙?；鞍卓乖芤旱馁|(zhì)量-體積濃度分別為 O. 25Pg/ml、0. 5Pg/ml、0. 75Pg/ml、lPg/ml、2Pg/ml、4Pg/ml、6Pg/ml、8Pg/ml，所述生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體為生物素標(biāo)記的乙?；贵w，所述生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體PBS溶液質(zhì)量-體積濃度為O. 5-2. 5Mm/ml，所述熒光標(biāo)記的鏈霉素PBS溶液質(zhì)量-體積濃度范圍為5-20Mm/ml ；
(3)實(shí)際樣品檢測(cè)
將步驟(I)中制備的蛋白芯片用山羊血清PBS-T溶液封閉后，用待測(cè)樣品孵育，洗滌，甩干；接著用生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體孵育，洗滌，甩干；再用熒光標(biāo)記的鏈霉素孵育，洗滌甩干，其中所述生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體為生物素標(biāo)記的乙?；贵w，反應(yīng)具體條件同步驟
(2);芯片處理完畢后，利用激光共聚焦芯片掃描儀掃描，檢測(cè)點(diǎn)樣點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量待測(cè)樣品的蛋白乙?；?。本發(fā)明中，步驟(I)中所述蛋白抗體為牛血清白蛋白抗體或者馬肌紅蛋白抗體；步驟(2)中所述標(biāo)準(zhǔn)乙?；鞍卓乖瓰橐阴；Ｑ灏椎鞍谆蛘咭阴；R肌紅蛋白。本發(fā)明中，步驟(I)中蛋白抗體PBS溶液的質(zhì)量-體積濃度為20(^g/ml。本發(fā)明中，步驟(2)中所述山羊血清PBS-T溶液的體積百分比濃度為5%，所述生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體PBS溶液的質(zhì)量-體積濃度為2Pg/ml ;所述熒光標(biāo)記的鏈霉素PBS溶液質(zhì)量-體積濃度為10Mm/ml。本發(fā)明中，步驟(2 )中，用山羊血清PBS-T溶液封閉1. 5小時(shí)后，放入TBST溶液中，在搖床上搖晃洗滌5-10分鐘，用無(wú)塵紙吸干芯片表面溶液，之后用磷酸緩沖液稀釋得到10倍稀釋的肝癌病人血清作為樣品稀釋液，稀釋得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)乙?；Ｑ灏椎鞍兹芤悍跤?. 5小時(shí)，放入TBST溶液中，在搖床上搖晃洗滌5-10分鐘，用無(wú)塵紙吸干芯片表面溶液；接著用生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體PBS溶液孵育1. 5小時(shí)，放入TBST溶液中，在搖床上搖晃洗滌5-10分鐘，用無(wú)塵紙吸干芯片表面溶液；再用熒光標(biāo)記的鏈霉素PBS溶液孵育I小時(shí)，放入TBST溶液中，在搖床上搖晃洗滌5-10分鐘，用甩干機(jī)甩干；
本發(fā)明中，乙?；鞍卓乖暮铣煞椒▍⒁妳⒖嘉墨I(xiàn)I。本發(fā)明應(yīng)用蛋白芯片的方法定量檢測(cè)蛋白乙?；?，克服了用乙?；贵w直接免疫沉淀富集時(shí)抗體親和力弱而難以高效富集乙?；鞍椎谋锥耍焖?、簡(jiǎn)便地定量檢測(cè)蛋白乙?；?，使用的樣品量較少，有利于不同樣品之間的差異比較，同時(shí)為建立研究高通量蛋白質(zhì)乙?；揎棽町愖V分析提供了技術(shù)平臺(tái)，有利于探討乙?；癄顟B(tài)對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值。


圖1是整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程圖和方案。圖2是實(shí)施例3中樣品檢測(cè)的線性范圍。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明提出的利用蛋白芯片檢測(cè)蛋白乙?；?shí)現(xiàn)定量分析的方法的進(jìn)一步說(shuō)明。
本發(fā)明中，乙?；Ｑ灏椎鞍椎闹苽浞椒ㄈ缦?br> 取20mg牛血清白蛋白，溶于5ml0. lmol/L的碳酸氫銨溶液中。依次加入50μ1乙酸酐和200μ1吡啶，在30°C烘箱反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物用快速蛋白純化儀純化除鹽，得到乙?；Ｑ灏椎鞍椎?0mmol/mLTriS溶液，經(jīng)過(guò)蛋白定量技術(shù)測(cè)得濃度是500ug/mL，產(chǎn)物放置于-80°C保存、本發(fā)明中，磷酸緩沖液(PBS)的pH為7. 2。實(shí)施例1制備蛋白芯片
利用北京博奧公司的芯片點(diǎn)樣儀器，在三維凝膠芯片上點(diǎn)牛血清白蛋白抗體。蛋白抗體的濃度是20(^g/ml，儀器保持50%的濕度。每張芯片總共12個(gè)矩陣，每個(gè)矩陣中的樣品點(diǎn)數(shù)為6行8列，總共48點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)點(diǎn)樣一次，其抗體體積大概Inl，點(diǎn)好的芯片從點(diǎn)樣儀器取下，儲(chǔ)存于4°C冰箱待用。實(shí)施例2利用不同種類蛋白檢測(cè)芯片特異性
(1)用質(zhì)量-體積濃度為3μ g/ml的牛血清白蛋白PBS溶液，質(zhì)量-體積濃度為3 μ g/ml的乙?；Ｑ灏椎鞍譖BS溶液，質(zhì)量-體積濃度為3 μ g/ml的乙酰化馬肌紅蛋白PBS溶液，質(zhì)量-體積濃度為3 μ g/ml的馬肌紅蛋白PBS溶液，體積百分比濃度為5%的山羊血清PBS溶液，作為下一步的樣品；
(2)將實(shí)施例1制備的蛋白芯片，用20μ1的體積百分比濃度為5%的山羊血清PBS-T溶液封閉1. 5h，用20μ1的樣品孵育1. 5h，用TBST溶液洗滌3次，甩干；用質(zhì)量-體積濃度為
2μ g/ml的生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，即生物素標(biāo)記的乙酰化抗體PBS溶液20μ1孵育1. 5h,用TBST洗滌3次，甩干；用質(zhì)量-體積濃度為熒光標(biāo)記的鏈霉素PBS溶液孵育lh，用TBST洗滌3次，甩干；
(3)利用激光共聚焦芯片掃描儀掃描芯片，
打開激光共聚焦芯片掃描儀LuXScanTM10K掃描儀器以及相應(yīng)的熒光532通道，放入處理完畢的蛋白芯片，掃描分辨率95%，激光強(qiáng)度600。結(jié)果如表I所示，發(fā)現(xiàn)只有乙?；Ｑ灏椎鞍撞庞休^強(qiáng)的信號(hào)，這說(shuō)明該芯片具有較好的靈敏度和特異性。表I芯片特異性的檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種定量檢測(cè)蛋白乙酰化水平的方法，其特征在于具體步驟如下(1)制備蛋白芯片利用芯片點(diǎn)樣儀器，在三維凝膠芯片上點(diǎn)l-3nL蛋白抗體PBS溶液，點(diǎn)好后儲(chǔ)存于4°C冰箱待用，其中所述蛋白抗體PBS溶液的質(zhì)量-體積濃度為100-30(^g/ml ；(2)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線將步驟(I)制備好的蛋白芯片，用山羊血清PBS-T溶液封閉1-2小時(shí)，洗滌，甩干；之后用磷酸緩沖液稀釋得到的10倍稀釋的肝癌病人血清作為稀釋液稀釋乙?；鞍卓乖玫降牟煌瑵舛鹊臉?biāo)準(zhǔn)乙酰化蛋白抗原溶液孵育1-2小時(shí)，洗滌，甩干；接著用生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體PBS溶液孵育1-2小時(shí)，洗滌，甩干；再用熒光標(biāo)記的鏈霉素PBS溶液孵育O. 5-1小時(shí)，洗滌，甩干；最后利用激光共聚焦芯片掃描儀掃描上述處理完畢的芯片，檢測(cè)點(diǎn)樣點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)乙?；鞍卓乖芤旱臐舛群托盘?hào)之間的線性關(guān)系；其中，所述山羊血清PBS-T溶液的體積百分比濃度為1%_10%，所述標(biāo)準(zhǔn)乙?；鞍卓乖芤旱馁|(zhì)量 _ 體積濃度分別為 O. 25Pg/ml、0. 5Pg/ml、0. 75Pg/ml、lPg/ml、2Pg/ml、4Pg/ml、6Pg/ml、8Pg/ml，所述生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體為生物素標(biāo)記的乙?；贵w，所述生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體PBS溶液質(zhì)量-體積濃度為O. 5-2. 5Mm/ml，所述熒光標(biāo)記的鏈霉素PBS溶液質(zhì)量-體積濃度范圍為5-20Mm/ml ；(3)實(shí)際樣品檢測(cè)將步驟(I)中制備的蛋白芯片用山羊血清封閉后，用待測(cè)樣品孵育，洗滌，甩干；接著用生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體孵育，洗滌，甩干；再用熒光標(biāo)記的鏈霉素孵育，洗滌甩干，其中所述生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體為生物素標(biāo)記的乙?；贵w，反應(yīng)具體條件同步驟(2);芯片處理完畢后，利用激光共聚焦芯片掃描儀掃描，檢測(cè)點(diǎn)樣點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量待測(cè)樣品的蛋白乙?；健?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)蛋白乙?；降姆椒?，其特征在于步驟(I)中所述蛋白抗體為牛血清白蛋白抗體或者馬肌紅蛋白抗體；步驟(2)中所述標(biāo)準(zhǔn)乙?；鞍卓乖瓰橐阴；Ｑ灏椎鞍谆蛘咭阴；R肌紅蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)蛋白乙?；降姆椒?，其特征在于步驟(I)中所述蛋白抗體PBS溶液的質(zhì)量-體積濃度為20(^g/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)蛋白乙?；降姆椒?，其特征在于步驟(2)中所述山羊血清PBS-T溶液的體積百分比濃度為5%，所述生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體PBS溶液的質(zhì)量-體積濃度為2Pg/ml ;所述熒光標(biāo)記的鏈霉素PBS溶液質(zhì)量-體積濃度為10Mm/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)蛋白乙?；降姆椒?，其特征在于步驟(2)中，用山羊血清PBS-T溶液封閉1. 5小時(shí)后，放入TBST溶液中，在搖床上搖晃洗滌5-10分鐘，用無(wú)塵紙吸干芯片表面溶液，之后用磷酸緩沖液稀釋得到10倍稀釋的肝癌病人血清作為樣品稀釋液稀釋乙?；鞍卓乖玫降牟煌瑵舛鹊臉?biāo)準(zhǔn)乙?；鞍卓乖芤悍跤?. 5小時(shí)，放入TBST溶液中，在搖床上搖晃洗滌5-10分鐘，用無(wú)塵紙吸干芯片表面溶液；接著用生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體PBS溶液孵育1. 5小時(shí)，放入TBST溶液中，在搖床上搖晃洗滌5-10分鐘，用無(wú)塵紙吸干芯片表面溶液；再用熒光標(biāo)記的鏈霉素PBS溶液孵育I小時(shí)，放入TBST溶液中，在搖床上搖晃洗滌5-10分鐘，用甩干機(jī)甩干。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種定量檢測(cè)蛋白乙?；降姆椒?。具體包括蛋白芯片制備，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)際樣品檢測(cè)。該法克服了用乙?；贵w直接免疫沉淀富集時(shí)抗體親和力弱而難以高效富集乙?；鞍椎谋锥?，能快速，簡(jiǎn)便地定量檢測(cè)蛋白乙?；?，使用的樣品量較少，有利于不同樣品之間的差異比較，同時(shí)研究乙?；町愖V圖為建立高通量蛋白質(zhì)乙?；揎棽町愖V分析提供技術(shù)平臺(tái)，有利于探討乙?；癄顟B(tài)對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N33/52GK103048471SQ20131000700
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2013年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月9日
發(fā)明者姚斐娜, 樊惠芝, 楊芃原, 李穎 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)