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一種能特異結(jié)合河豚毒素的dna適配子及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:6176063閱讀:580來源:國知局
專利名稱:一種能特異結(jié)合河豚毒素的dna適配子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明具體涉及一種能特異結(jié)合河豚毒素的DNA適配子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)
河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)是毒性最強的非蛋白類神經(jīng)毒素之一,存在于河豚等多種海洋生物以及蠑螈、火晰蜴、青蛙、蟾蜍等動物體內(nèi),某些細(xì)菌(如弧菌屬、假單胞菌屬等)也可分泌TTX。TTX的分子式為C11H17N3O8,相對分子量為319. 271,是一種小分子物質(zhì)。TTX是鈉離子通道阻斷劑,直接影響神經(jīng)肌肉興奮性的傳導(dǎo),使得神經(jīng)肌肉呈麻痹狀態(tài),甚至引起死亡。河豚毒素性質(zhì)穩(wěn)定,可使水源和食物等長期染毒,易經(jīng)消化道吸收中毒,分散呈氣溶膠狀態(tài)的河豚毒素,亦可通過呼吸道吸入中毒。河豚毒素是一種強神經(jīng)毒素,毒性大大超過包括有機磷毒劑在內(nèi)的所有合成毒劑,它比氰化鈉的毒性大1000多倍,國內(nèi)外因食用河豚或織紋螺而導(dǎo)致河豚毒素中毒死亡的案例時有發(fā)生。此外,由于TTX已可人工化學(xué)合成,存在可能被恐怖分子利用的潛在威脅。這些使得對TTX的檢測越來越被人們所重視。河豚毒素檢測方法有很多,包括生物法、酶免疫分析法、氣相色譜法、液相色譜法、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法等,但目前還未見分子生物學(xué)快速篩選檢測方法。適配子(aptamer)是通過指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution ofligands by exponential enrichment, SELEX)技術(shù)從人工合成的 DNA 或 RNA 隨機庫中篩選出來的,與非核酸靶物質(zhì)特異結(jié)合的高親和性單鏈寡核苷酸序列。SELEX技術(shù)是利用分子生物學(xué)技術(shù),人工合成單鏈隨機寡核苷酸文庫(20 - 60個堿基),將隨機寡核苷酸文庫與靶物質(zhì)相互作用,保留結(jié)合的寡核苷酸序列,經(jīng)反復(fù)擴增、篩選,即可使與該靶物質(zhì)特異結(jié)合的寡核苷酸序列得到富集。SELEX技術(shù)發(fā)展非常迅速,已成功應(yīng)用于許多靶物質(zhì)如蛋白質(zhì)、肽、病毒、細(xì)菌、有機物,甚至金屬離子等的適配子的篩選。適配子包括DNA適配子和RNA適配子,DNA適配子的穩(wěn)定性較好。適配子與靶物質(zhì)的結(jié)合是由適配子的三維結(jié)構(gòu)通過氫鍵、范德華力等與靶物質(zhì)的特定區(qū)域結(jié)合的。適配子具有親和力高、特異性強、靶物質(zhì)范圍廣、制備及修飾容易、穩(wěn)定性好、與靶物質(zhì)的結(jié)合條件可調(diào)控、應(yīng)用靈活等特點,在分子生物學(xué)、環(huán)境檢測、食品衛(wèi)生檢驗、生物毒素檢測、毒理學(xué)等研究領(lǐng)域都有廣闊的應(yīng)用前景,凡是涉及抗體的診斷領(lǐng)域幾乎都可以用適配子代替,且優(yōu)于抗體。因此,本發(fā)明以河豚毒素為靶物質(zhì),采用SELEX技術(shù),結(jié)合克隆、測序、親和力測定等方法制備了能特異結(jié)合河豚毒素的DNA適配子,并建立了河豚毒素的DNA適配子-染料直接檢測法,將制備的DNA適配子應(yīng)用于河豚毒素的分子生物學(xué)檢測,達(dá)到簡便、快遞篩選河豚毒素的目的。

發(fā)明內(nèi)容
為了提供一種分子生物學(xué)快速篩選檢測河豚毒素的方法,本發(fā)明提供了一種能特異結(jié)合河豚毒素的DNA適配子, 并建立一種簡便、快速篩選檢測河豚毒素的DNA適配子-染料直接法。
本發(fā)明提供了一種DNA適配子,所述適配子是應(yīng)用SELEX技術(shù),從人工合成的全長為78個堿基的ssDNA文庫中篩選獲得的單鏈DNA (ssDNA),能特異結(jié)合河豚毒素。所述DNA適配子的核苷酸序列為(SEQ ID NO.1)
5 ^-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACCCTGCCGGGGGCTTCTCCTTGCTGCTCTGCTCTGTTCGACATGAGGCCCGGATC-3 ‘。 本發(fā)明另外還提供了上述DNA適配子的應(yīng)用,是將所述DNA適配子用于篩選檢測
河豚毒素。所述DNA適配子用于篩選檢測河豚毒素是采用DNA適配子-染料法,其能在2小時內(nèi)快速篩選檢測河豚毒素。 所述DNA適配子-染料法的具體步驟如下
取5KL濃度為10pmol/L的DNA適配子的dsDNA于1. 5mL離心管中,加入589M-LPH7. 5的O. Olmol/L磷酸緩沖液,再加入6μ 河豚毒素待測樣品,同時以1%乙酸溶液代替河豚毒素待測樣品作為空白對照,室溫下孵育lh。孵育結(jié)束后,取孵育后的溶液198PL于酶標(biāo)微孔中,同時以O(shè). 01mol/L磷酸緩沖液作為背景信號對照,各加入2PL染料Eva Green,充分結(jié)合IOmin后,用多功能酶標(biāo)儀于激發(fā)波長為485nm、發(fā)射波長為533nm處測定熒光強度值,當(dāng)對照溶液與待測樣品的熒光差值大于背景信號時,可判定為河豚毒素初篩陽性。DNA適配子-染料直接法篩選檢測河豚毒素的檢出限為10_6mol/L,即為
3.19X104mg/mL。本發(fā)明的顯著優(yōu)點
目前,河豚毒素檢測方法有生物法、酶免疫分析法、色譜法、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法等。鼠生物法是測定TTX的傳統(tǒng)方法,但該法與小鼠個體差異顯著相關(guān),且操作復(fù)雜。用酶免疫分析法測定河豚毒素,需要制備河豚毒素的抗體,而河豚毒素是小分子物質(zhì),其抗體尤其是單克隆抗體很難制備。色譜法、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法等雖然特異性強、靈敏度高,但都需要昂貴的儀器。本發(fā)明以河豚毒素為靶物質(zhì),采用SELEX技術(shù),制備了能特異結(jié)合河豚毒素的DNA適配子,并建立了河豚毒素的DNA適配子-染料直接檢測法,將制備的DNA適配子應(yīng)用于河豚毒素的分子生物學(xué)檢測,檢測限低。本發(fā)明的DNA適配子可通過PCR擴增或人工合成的方式制備,易于獲得、長期保存。建立的河豚毒素DNA適配子-染料直接檢測法,無需昂貴的儀器和復(fù)雜的操作,具有操作簡便、成本低廉、快速、靈敏等優(yōu)點。


圖1為適配子的二級結(jié)構(gòu);
圖2為應(yīng)用DNA適配子檢測TTX的原理示意 圖3為反應(yīng)體系的pH值對熒光強度檢測的影響;
圖4為染料結(jié)合時間對熒光強度檢測的影響;
圖5為TTX檢出限的測定結(jié)果。
具體實施例方式實施例所需的試驗材料河豚毒素購自成都曼思特生物科技有限公司,純度> 99% (HPLC),用1%乙酸溶液將河豚毒素稀釋至濃度為lmol/L,4°C保存?zhèn)溆?。根?jù)體外人工合成的ssDNA文庫的兩端固定序列,設(shè)計并合成以下引物
引物 I (SEQ ID NO. 2) :5,-GGG AGC TCA TAA ACG CTC AA-3,,
引物 II (SEQ ID NO. 3) :5,-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3,,
引物III (SEQ ID N0.4) :5,-地高辛-GGG AGC TCA TAA ACG CTC AA-3,,
引物IV (SEQ ID N0.5) :5,-生物素-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3,。引物用TE溶液(ρΗ8· O)稀釋至濃度為10 μ mol/L,_20°C保存?zhèn)溆?。染料EvaGreen購自北京美萊博醫(yī)學(xué)有限公司(Biotium,美國)。實施例1 :能特異結(jié)合河豚毒素的DNA適配子1、DNA適配子的核苷酸序列
從體外人工合成的兩端為固定序列、中間為35個隨機序列、全長為78個堿基的ssDNA文庫,采用SELEX技術(shù)、結(jié)合誘變PCR技術(shù),通過克隆、測序、親和力測定等手段,篩選獲得與河豚毒素(TTX)特異結(jié)合的單克隆DNA適配子。DNA適配子的核苷酸序列為
權(quán)利要求
1.一種DNA適配子,其特征在于所述適配子是應(yīng)用SELEX技術(shù),從人工合成的全長為78個堿基的ssDNA文庫中篩選獲得的單鏈DNA,能特異結(jié)合河豚毒素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種DNA適配子,其特征在于所述DNA適配子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA適配子的應(yīng)用,其特征在于將所述DNA適配子用于篩選檢測河豚毒素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA適配子的應(yīng)用,其特征在于將所述DNA適配子用于篩選檢測河豚毒素是采用DNA適配子-染料法,能在2小時內(nèi)快速篩選檢測河豚毒素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA適配子的應(yīng)用,其特征在于DNA適配子-染料法的具體步驟如下取5ML濃度為10pmol/L的DNA適配子的dsDNA于1. 5mL離心管中,加入589MLPH7. 5的0. Olmol/L磷酸緩沖液,再加入6ML河豚毒素待測樣品,同時以1%乙酸溶液代替河豚毒素待測樣品作為空白對照,室溫下孵育Ih ;孵育結(jié)束后,取孵育后的溶液198ML于酶標(biāo)微孔中,同時以0. 01mol/L磷酸緩沖液作為背景信號對照,各加入2ML染料Eva Green,充分結(jié)合IOmin后,用多功能酶標(biāo)儀于激發(fā)波長為485nm、發(fā)射波長為533nm處測定熒光強度值,當(dāng)對照溶液與待測樣品的熒光差值大于背景信號時,可判定為河豚毒素初篩陽性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA適配子的應(yīng)用,其特征在于DNA適配子-染料直接法篩選檢測河豚毒素的檢出限為10_6mol/L,即為3. 19X 10_4mg/mL。
全文摘要
為了提供一種分子生物學(xué)快速篩選檢測河豚毒素的方法,本發(fā)明提供了一種能特異結(jié)合河豚毒素的DNA適配子,并建立一種簡便、快速篩選檢測河豚毒素的DNA適配子-染料直接法。所述適配子是應(yīng)用SELEX技術(shù),從人工合成的全長為78個堿基的ssDNA文庫中篩選獲得的單鏈DNA(ssDNA),能特異結(jié)合河豚毒素。所述DNA適配子的核苷酸序列為如SEQIDNO.1所示;本發(fā)明將制備的DNA適配子應(yīng)用于河豚毒素的分子生物學(xué)檢測,檢測限低。本發(fā)明的DNA適配子可通過PCR擴增或人工合成的方式制備,易于獲得、長期保存。建立的河豚毒素DNA適配子-染料直接檢測法,無需昂貴的儀器和復(fù)雜的操作,具有操作簡便、成本低廉、快速、靈敏等優(yōu)點。
文檔編號G01N21/64GK103045602SQ20131000734
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月9日
發(fā)明者邵碧英, 楊方, 陳文炳, 王云才, 繆婷玉, 彭娟 申請人:福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
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