專利名稱：煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的酶聯(lián)免疫測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及煙草及煙草制品中黃曲霉毒素(AFT)的測定技術(shù)，具體說是涉及一種煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的酶聯(lián)免疫測定方法。
背景技術(shù)：
煙草是世界許多地區(qū)的主要經(jīng)濟作物。但是，在煙葉初加工、貯運、煙廠生產(chǎn)和煙制品銷售等環(huán)節(jié)中，一旦溫度、濕度和水分等環(huán)境條件適宜，極易滋生各種微生物而使煙葉發(fā)霉變質(zhì)，致使煙葉及其制品產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降，造成重大的經(jīng)濟損失。在煙草行業(yè)中，控制煙葉的霉變，不僅僅為了降低因煙葉霉變造成的經(jīng)濟損失，更是出于保障卷煙產(chǎn)品安全性的目的。已報道的能使煙葉、煙絲和卷煙霉變的霉菌多達130屬231種。常見霉菌的優(yōu)勢菌主要有曲霉、青霉和毛霉等。這些霉菌除了影響煙葉品質(zhì)外，還包括黃曲霉、赭曲霉、煙曲霉、構(gòu)巢曲霉、桔青霉等產(chǎn)毒霉菌，產(chǎn)毒霉菌會通過自身代謝產(chǎn)生對人體有顯著毒性霉菌毒素，如黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等。其中，黃曲霉毒素是目前發(fā)現(xiàn)最強的化學(xué)致癌物質(zhì)，其毒性是氰化鉀的10倍，是砒霜的68倍。目前，食品及飼料中真菌毒素的檢測已引起了國際上許多國家的高度重視。我國針對食品及飼料中的真菌毒素制定了嚴格的檢測標準和限量要求，是重要的安全性評價指標。卷煙作為一種供消費者吸食的特殊商品，其衛(wèi)生指標和安全性一直受到消費者和煙草行業(yè)的高度關(guān)注。目前，還沒有相關(guān)文獻和專利報道我國煙草及煙草制品中真菌毒素的測定方法。目前針對食品中黃曲霉毒素的檢測方法主要為兩種，一種是液相色譜與熒光檢測器或質(zhì)譜檢測器聯(lián)用技術(shù)，另一種是酶聯(lián)免疫測定方法(ELISA)。后者利用免疫、酶及生化技術(shù)聯(lián)用實現(xiàn)黃曲霉毒素含量的測定。該方法具有特異性好，檢測結(jié)果穩(wěn)定準確，實驗操作簡便，檢測通量高、可實現(xiàn)現(xiàn)場分析等優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術(shù)狀況而提供一種適用于煙草及煙草制品中黃曲霉毒素測定的酶聯(lián)免疫測定方法，本發(fā)明通過優(yōu)化煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的提取方法，使用表面修飾抗體，內(nèi)部包埋辣根過氧化物酶(HRP酶)的脂質(zhì)體作為信號放大技術(shù)，提高酶聯(lián)免疫檢測方法的靈敏度。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
一種煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的酶聯(lián)免疫測定方法，包括以下工藝步驟
(1)樣品前處理煙葉樣品或煙絲在40°C下烘干，在粉碎機上粉碎，過40目篩；
(2)樣品中黃曲霉毒素的提取稱取5g經(jīng)前處理的煙末樣品和O. 5 g氯化鈉置于100mL具塞錐形燒瓶中，加入20 mL的80%的甲醇水溶液，蓋好蓋子置于振蕩器上高速振蕩5分鐘，靜置3分鐘使樣品沉淀，用玻璃纖維濾紙過濾10 mL萃取液，收集濾液到干凈容器中，取5 mL卒取液，加入20 mL水稀釋，混勾后待測；
(3)標準工作液的配制用16%的甲醇水溶液配制不同濃度的黃曲霉毒素標準工作溶液，濃度分別為 I ng/mL, 2 ng/mL, 7. 5 ng/mL, 25 ng/mL, 100 ng/mL。
(4)酶聯(lián)免疫法測定在96孔板表面固定黃曲霉毒素-牛血清白蛋白(AFT-BSA)偶聯(lián)物，加入標準工作溶液或檢測樣品，隨后立即加入表面抗體修飾、辣根酶包埋的脂質(zhì)體溶液，反應(yīng)20分鐘后清除微孔板內(nèi)溶液并洗滌，加入含有1%十二烷基磺酸鈉(SDS)的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物，避光反應(yīng)20分鐘，加入終止液，在450nm處檢測紫外吸收。本發(fā)明中，在酶標板中進行偶聯(lián)抗原的包被，通過對包被抗原濃度進行優(yōu)化，偶聯(lián)物濃度達到25Pg/mL時為最佳，向96孔微孔板中加入由包被液稀釋的25Pg/mL的偶聯(lián)抗原(AFT-BSA)，每孔 10(^L，4°C過夜。酶聯(lián)免疫法測定的具體步驟如下
(1)抗原包被酶標板中加入由包被液稀釋的25Pg/mL的黃曲霉毒素-牛血清白蛋白(AFT-BSA)偶聯(lián)抗原，每孔10(^L，4°C過夜；
(2)洗板用PBS緩沖液洗板3次，每次5min；
(3)封閉每孔加入IOOPL封閉液，37°C封閉lh，重復(fù)洗板過程；
(4)加AFT標準品和抗體 標記的脂質(zhì)體加入50μ 不同濃度的AFT標準品或待測樣品；隨后加入50μ 表面標記抗體內(nèi)部包埋HRP酶的脂質(zhì)體溶液，室溫下孵育30min，進行間接競爭ELISA反應(yīng)，重復(fù)洗板過程，最后一次清洗完成后，倒掉孔中溶液，然后翻轉(zhuǎn)微孔板在吸水紙上拍干；
(5)加入底物每孔加入IOOPL含有1%十二烷基磺酸鈉(SDS)的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物，室溫下避光反應(yīng)30min ；
(6)終止反應(yīng)每孔加入ιοομ 終止液,終止反應(yīng)；
(7)檢測用紫外可見分光光度計測定450nm處的吸光度。本發(fā)明所采用的包被液為碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，PH9. 6 ;洗滌液磷酸鹽緩沖液，pH7. 3 ;封閉液含1%BSA的磷酸鹽緩沖液；抗體稀釋液磷酸鹽緩沖液，PH7. 3 ;終止液IM鹽酸。本發(fā)明中制備AFT-BSA偶聯(lián)物的方法由于黃曲霉毒素是小分子半抗原，因此采用碳二亞胺方法將其與載體蛋白進行偶聯(lián)。其反應(yīng)原理是利用碳二亞胺使羧基和氨基間脫水形成酰胺鍵，半抗原上的羧基先與EDC反應(yīng)生成一個中間物，然后再BSA蛋白交聯(lián)形成偶聯(lián)物。本發(fā)明中制備表面標記抗體，包埋HRP酶的脂質(zhì)體的方法脂質(zhì)體可以通過內(nèi)部包埋或表面修飾等方法，成為多種功能團分子的通用載體。脂質(zhì)體的內(nèi)部水相可以包裹幾乎任何標記物，脂質(zhì)體表面可以通過各種物理或化學(xué)方法修飾官能團。本方法中，通過脂質(zhì)體制備過程中加入HRP酶成份，從而在脂質(zhì)體內(nèi)部包埋HRP酶。此外，通過在脂質(zhì)體的制備原料中加入含有氨基基團的PE成分，從而在脂質(zhì)體表面引入氨基。通過戊二醛共價交聯(lián)法在脂質(zhì)體表面標記兔抗黃曲霉毒素抗體。本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有黃曲霉毒素酶聯(lián)免疫測定方法的不足，利用表面修飾抗體，內(nèi)部包埋HRP酶的脂質(zhì)體作為信號放大技術(shù)提高了檢測靈敏度，簡化了樣品前處理步驟，加快了樣品檢測速度，并優(yōu)化了實驗條件。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明方法具有如下優(yōu)良效果
①利用表面修飾抗體，內(nèi)部包埋HRP酶的脂質(zhì)體作為信號放大技術(shù)提高了檢測靈敏度。
②本發(fā)明方法具有操作步驟簡單，成本低，消耗少的特點。③本方法具有高通量的優(yōu)勢，能同時實現(xiàn)96個樣品的同時測定。④本發(fā)明具有操作準確、靈敏度高及重復(fù)性好的優(yōu)點。方法檢出限為O. 524ng/mL,平均回收率為101. 0%，平均相對標準偏差為5. 2%。


圖1.本發(fā)明的測定方法流程圖。
圖2.黃曲霉毒素的標準工作曲線示圖。
圖3.脂質(zhì)體中腦磷脂成分含量的優(yōu)化示圖。
圖4.黃曲霉毒素-牛血清白蛋白偶聯(lián)抗原的包被濃度的優(yōu)化示圖。
具體實施方式
具體實施例方式本發(fā)明以下結(jié)合附圖將具體的工藝過程進一步詳述如下1.樣品前處理稱取煙葉樣品或煙草制品約20克，不立即分析的樣品應(yīng)置于冰箱中冷藏保存。將收集的煙葉樣品或煙絲樣品在40°C下烘干，然后粉碎并過40目篩，并在取樣前充分混合。2.樣品中黃曲霉毒素的提取稱取5g (精確到O.1g)煙末樣品和O. 5g氯化鈉置于IOOmL具塞錐形燒瓶中。加入20mL的80%的甲醇水溶液。蓋好蓋子置于振蕩器上高速渦旋5分鐘。靜止3分 鐘使樣品沉淀。用玻璃纖維濾紙過濾IOmL萃取液。收集濾液到干凈各器中。取5mL卒取液，加入20mL水稀釋，混勾后待測。3. AFT-BSA偶聯(lián)物的制備將AFT (25mg，O.1 mmol)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(13. 8mg,O. 12mmol)、碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC) (23. Omg,O. 12mmol)溶于 ImL 無水 DMF 中，室溫下攪拌5h，離心取上清液。30mg牛血清白蛋白(BSA)溶于2mL的碳酸鹽緩沖液中，逐滴加入50μ 上清液，室溫下攪拌4h，反應(yīng)結(jié)束后，裝入透析管，用磷酸緩沖液(O. 01mol/L,pH7. 4)透析，每8h換液一次，共換液3次。透析后保存于4°C待用。4.工作曲線的繪制用本方法對不同濃度的黃曲霉毒素標準工作溶液進行測定，測定結(jié)果如圖2所示，當黃曲霉毒素濃度在l_25ng/mL范圍內(nèi)，吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=-O. 0736X+2. 6365，相關(guān)系數(shù)R2為O. 9933。根據(jù)空白溶劑檢測值加三倍標準偏差對應(yīng)的信號值，計算得出最低檢測限為O. 524ng/mL。5.包埋HRP酶的脂質(zhì)體的制備包埋HRP酶的脂質(zhì)體是參考文獻報道的步驟制備的，過程如下稱取Img的卵磷脂(PC)和腦磷脂(PE)的磷脂混合物置于5毫升的圓底燒瓶中。磷脂混合物用體積比為6:1的氯仿、甲醇混合溶液分散。然后有機溶劑通過減壓旋轉(zhuǎn)蒸餾的方法除去，剩余一層很薄的磷脂膜在圓底燒瓶的內(nèi)壁。加入2毫升的含有HRP酶的磷酸緩沖溶液后，磷脂膜置于50°C的水浴中溶漲I小時，通過混勻器劇烈混勻得到多層脂質(zhì)體。這些多層脂質(zhì)體溶液用探頭超聲儀超聲后得到均勻體積的單層脂質(zhì)體。制備的脂質(zhì)體溶液在644g離心力下離心15分鐘，除去可能殘留的多層脂質(zhì)體或團聚的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體溶液儲存在4 °C下備用。
6.包埋HRP脂質(zhì)體表面的抗體修飾脂質(zhì)體表面通過戊二醛共價交聯(lián)法標記兔抗黃曲霉毒素抗體。向O. 5 mL 2. 5%的戊二醛溶液中逐滴加入包埋了 HRP酶的脂質(zhì)體，250C .攪拌反應(yīng)I小時。過量的戊二醛在4 °C環(huán)境下磷酸鹽緩沖液中透析過夜除去。然后，再逐滴加入到45 μ L 2.1 mg mL—1兔抗黃曲霉毒素抗體溶液中，25 1攪拌反應(yīng)I小時。脂質(zhì)體表面未反應(yīng)的醛基通過加入60 UL 3 M的甘氨酸-氫氧化鈉溶液封閉，4 °C反應(yīng)過夜。未標記的抗體通過葡聚糖凝膠色譜柱分離除去，所得產(chǎn)物4 °C儲存待用。脂質(zhì)體成分中的PE分子含有氨基官能團能與抗體共價交聯(lián)，因此脂質(zhì)體表面抗體的覆蓋率可以通過調(diào)解脂質(zhì)體成分中PE的含量來控制。圖4為脂質(zhì)體成分中PE的含量對吸光度結(jié)果的影響。由圖3可知，當脂質(zhì)體溶液中腦磷脂的摩爾成分為1/4時，吸光度響應(yīng)達到最大值。當PE含量超過1/4時，盡管引入了更多的氨基基團，但對抗體的共價結(jié)合形成了空間位阻，也影響了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。所以，脂質(zhì)體成分中PE含量的摩爾比例為1/4。7.酶聯(lián)免疫法測定方法
7.1抗原包被酶標板中加入由包被液稀釋的一定濃度的偶聯(lián)抗原(AFT-BSA)，每孔10(^L，4°C過夜。對包被抗原濃度進行優(yōu)化，用碳酸鹽緩沖液將偶聯(lián)物逐級稀釋，濃度分別為 O. 05Pg/mL, O. 5Pg/mL, 5Pg/mL, 25Pg/mL, 75Pg/mL, 100Pg/mL。結(jié)果如圖 4 所不，隨著偶聯(lián)物濃度的增大，吸光度隨之增大，當偶聯(lián)物濃度達到25Pg/mL時，吸光度趨于穩(wěn)定，因此微孔板上偶聯(lián)物抗原的包被濃度為25Pg/mL。7. 2洗板用PBS緩沖液洗板3次，每次5min。7. 3封閉每孔加入IOOPL 封閉液，37°C封閉lh，重復(fù)洗板過程。7. 4加AFT標準品和抗體標記的脂質(zhì)體加入50μ 不同濃度的AFT標準品(2. Ong/mL, 7. 5ng/mL, 25ng/mL, 100ng/mL)或樣品。隨后加入50μ 表面標記抗體內(nèi)部包埋HRP酶的脂質(zhì)體溶液，室溫下孵育30min，進行間接競爭ELISA反應(yīng)，重復(fù)洗板過程。最后一次清洗完成后，倒掉孔中溶液，然后翻轉(zhuǎn)微孔板在吸水紙上拍干。7. 5加入底物每孔加入IOOPL含有1%SDS的TMB底物，室溫下避光反應(yīng)30min。7. 6終止反應(yīng)每孔加入IOOPL終止液,終止反應(yīng)；
7.7檢測用紫外可見分光光度計測定450nm處的吸光度。本發(fā)明以下結(jié)合實例做進一步描述，但并不是限制本發(fā)明。實例1:1.試劑與儀器
酶標儀(MD，美國)；96孔酶標板(corning，美國)、黃曲霉毒素，卵磷脂(PC)，腦磷脂(PE)辣根過氧化物酶(HRP)，牛血清白蛋白(BSA)，碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，四甲基聯(lián)苯胺(TMB)均購于SIGMA公司。兔抗黃曲霉毒素抗體購于格朗瑞生物科技公司(Glory Science,美國德州)。其余試劑均為分析純，所用水為二次蒸餾水。2.樣品前處理以及黃曲霉毒素的提取稱取煙葉樣品約5片，用剪刀將煙葉樣品剪成不大于3cmX3cm的碎片，將剪裁后的樣品置于天平上稱量，精確至0. lg。記錄稱量值后將煙葉樣品置于稱量瓶中在40°C下烘干，然后粉碎并過40目篩，并在取樣前充分混合。稱取5. 02g煙末樣品和0. 51g氯化鈉置于IOOmL具塞錐形燒瓶中。加入20mL的80%的甲醇水溶液。蓋好蓋子置于振蕩器上高速渦旋5分鐘。靜止3分鐘使樣品沉淀。用玻璃纖維濾紙過濾IOmL萃取液。收集濾液到干凈容器中。取5mL萃取液，加入20mL水稀釋，混勻后待測。3.不同標準溶液的制備用16%的甲醇水溶液配制不同濃度的標準工作溶液，黃曲霉毒素的濃度分別為 I ng/mL, 2 ng/mL, 7. 5 ng/mL, 25 ng/mL, 100 ng/mL。4.根據(jù)酶聯(lián)免疫法測定步驟，檢測測得煙葉樣品A的黃曲霉毒素含量為OPg/mL。實例2
按實例I所述方法，測得煙葉樣品B和煙絲樣品C的黃曲霉毒素含量分別為OPg/mL和O Kg/mL。在不含黃曲霉毒素的煙葉樣品中加入黃曲霉毒素標準溶液，然后進行樣品前處理，黃曲霉毒素的提取，酶聯(lián)免疫法的測定，并按照加標量和測定值計算其回收率，結(jié)果見表I。從高、中、低不同濃度水平的標準物溶液加標回收率情況來看，回收率在99. 6%-102. 0%之間，相對偏差在小于6%，說明本方法的回收率較高，重復(fù)性較好。
權(quán)利要求
1.一種煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的酶聯(lián)免疫測定方法，其特征在于包括以下工藝步驟(1)樣品前處理煙葉樣品或煙絲在40°C下烘干，在粉碎機上粉碎，過40目篩；(2)樣品中黃曲霉毒素的提取稱取5g經(jīng)前處理的煙末樣品和O. 5 g氯化鈉置于100mL具塞錐形燒瓶中，加入20 mL的80%的甲醇水溶液，蓋好蓋子置于振蕩器上高速振蕩5分鐘，靜置3分鐘使樣品沉淀，用玻璃纖維濾紙過濾10 mL萃取液，收集濾液到干凈容器中，取5 mL卒取液，加入20 mL水稀釋，混勾后待測；(3)標準工作液的配制用16%的甲醇水溶液配制不同濃度的黃曲霉毒素標準工作溶液；(4)酶聯(lián)免疫法測定在96孔板表面固定黃曲霉毒素-牛血清白蛋白(AFT-BSA)偶聯(lián)物，加入標準工作溶液或檢測樣品，隨后立即加入表面抗體修飾、辣根酶包埋的脂質(zhì)體溶液，反應(yīng)20分鐘后清除微孔板內(nèi)溶液并洗滌，加入含有1%十二烷基磺酸鈉(SDS)的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物，避光反應(yīng)20分鐘，加入終止液，在450nm處檢測紫外吸收。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的酶聯(lián)免疫測定方法，其特征在于黃曲霉毒素的濃度分別為 I ng/mL，2 ng/mL, 7. 5 ng/mL, 25 ng/mL, 100 ng/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的酶聯(lián)免疫測定方法，其特征在于偶聯(lián)物濃度為25Pg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的酶聯(lián)免疫測定方法，其特征在于酶聯(lián)免疫法測定的具體步驟如下(1)抗原包被酶標板中加入由包被液稀釋的25Pg/mL的黃曲霉毒素-牛血清白蛋白(AFT-BSA)偶聯(lián)抗原，每孔10(^L，4°C過夜；(2)洗板用PBS緩沖液洗板3次，每次5min；(3)封閉每孔加入IOOPL封閉液，37°C封閉lh，重復(fù)洗板過程；(4)加AFT標準品和抗體標記的脂質(zhì)體加入50μ 不同濃度的AFT標準品或待測樣品；隨后加入50μ 表面標記抗體內(nèi)部包埋HRP酶的脂質(zhì)體溶液，室溫下孵育30min，進行間接競爭ELISA反應(yīng)，重復(fù)洗板過程，最后一次清洗完成后，倒掉孔中溶液，然后翻轉(zhuǎn)微孔板在吸水紙上拍干；(5)加入底物每孔加入IOOPL含有1%十二烷基磺酸鈉(SDS)的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物，室溫下避光反應(yīng)30min ；(6)終止反應(yīng)每孔加入ιοομ 終止液,終止反應(yīng)；(7)檢測用紫外可見分光光度計測定450nm處的吸光度。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的酶聯(lián)免疫測定方法，其特征在于所述包被液碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，PH9. 6 ;洗滌液磷酸鹽緩沖液，pH7. 3 ;封閉液含1%BSA的磷酸鹽緩沖液；抗體稀釋液磷酸鹽緩沖液，pH7. 3 ;終止液1M鹽酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的酶聯(lián)免疫測定方法，適用于煙葉樣品和煙絲樣品中黃曲霉毒素的準確測定。本發(fā)明方法包括樣品的前處理，樣品中黃曲霉毒素的提取，標準工作溶液的配制，檢測方法的優(yōu)化，酶聯(lián)免疫測定方法的建立等步驟，該方法能快速、準確檢測煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的含量，實驗操作簡單，非特異性吸附少，儀器設(shè)備投資少，測定成本低廉測定結(jié)果準確可靠。
文檔編號G01N33/543GK103063831SQ20131001331
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月15日
發(fā)明者陳歡, 劉彤, 侯宏衛(wèi), 韓書磊, 龐永強, 姜興益, 李中皓, 張洪非, 李雪, 劉楠, 胡清源 申請人:國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心