專利名稱：一種甘蔗葉的定性鑒別hplc指紋圖譜檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甘蔗葉的定性鑒別HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，屬于中藥的分析檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甘鹿葉是禾本科植物甘鹿Saccharum sinensis Roxb.的葉。甘鹿廣泛種植于熱帶、亞熱帶地區(qū)，我國(guó)甘蔗種植蔗區(qū)主要分布在廣西、廣東、臺(tái)灣、福建及云南等地。甘蔗葉含有氨基酸、多糖和黃酮類等物質(zhì)，其嫩葉和蔗梢含過(guò)氧化物酶等物質(zhì)，具有抗氧化、抗菌、降血糖、抗腫瘤等藥理作用。國(guó)內(nèi)外對(duì)甘蔗葉的研究并不多見(jiàn)，僅提取工藝、藥效學(xué)篩選等報(bào)道。中藥成分極其復(fù)雜，臨床用藥強(qiáng)調(diào)整體性，測(cè)定少數(shù)幾種有效成分或指標(biāo)成分，不足以確保藥材或制劑質(zhì)量，應(yīng)該建立全面反映所含成分的指紋圖譜，將更加有效地體現(xiàn)中藥成分的整體性和綜合作用，從而更好地評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量。中藥指紋圖譜作為一種有效的質(zhì)量控制模式，以其科學(xué)的理論依據(jù)獲得國(guó)際上的一致認(rèn)可。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的解決方案是提供一種甘蔗葉的定性鑒別HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，此方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，可作為甘蔗葉的鑒定方法。本發(fā)明一種甘蔗葉的定性鑒別HPLC指紋圖譜的測(cè)定包括以下步驟:I供試品溶液的制備:稱取樣品2g按料液比1: 25加入70%乙醇回流提取2h，減壓濃縮，將濃縮樣品上大孔樹(shù)脂柱，先用IOOml水洗脫洗至無(wú)色，然后用100ml70%乙醇洗脫，將洗脫液濃縮，并甲醇定容至5ml容量瓶，離心，備用。2色譜條件:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱為固定相，甲醇-0.1%冰乙酸水溶液為流動(dòng)相，按以下體積百分比條件進(jìn)行梯度洗脫:0 5min，20% A，5 15min，20% 28% A, 15 30min，28% 34% A, 30 40min，34% A, 40 45min，34% 42 % A，45 70min，42 % 50 % A，70 95min，50 % 65 % A ;柱溫 25°C，檢測(cè)器為紫外吸收檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)320nm,流速1.0ml.mirT1。3測(cè)定方法:精密吸取供試品溶液20 μ L，按設(shè)定的色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定，即得。在此條件下獲取的甘蔗葉對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)附圖1。下面對(duì)本分析方法的建立作進(jìn)一步的描述:I供試品溶液的制備方法考察1.1提取方法的考察根據(jù)試驗(yàn)要求比較了超聲和回流兩種提取方法，結(jié)果見(jiàn)附圖2、3。從圖中可以看出由不同提取方法提取后的甘蔗葉的色譜圖的性狀及色譜峰的數(shù)目基本一致，回流提取2h比超聲提取30min提取更加完全(色譜峰強(qiáng)度大)，因此，選用回流提取法進(jìn)行甘蔗葉中有效成分提取。
1.2樣品除雜方法的考察考慮到樣品顏色較深，色素較多，因此考察了除雜方法。實(shí)驗(yàn)中比較了石油醚萃取和大孔樹(shù)脂洗脫兩種方法，見(jiàn)附圖4、5。從圖中可以看出石油醚除雜方法處理的甘蔗葉的色譜圖基線飄動(dòng)比較大，小的雜峰比較密集，經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂洗脫的甘蔗葉的色譜圖基線較為平穩(wěn)，而且雜峰較少，因此甘蔗葉除雜方法選用樣品經(jīng)大孔樹(shù)脂洗脫。2色譜條件的選擇2.1色譜柱的選擇分別采用不同的十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，在同一臺(tái)高效液相色譜儀(美國(guó)AgilentllOOSeries:四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，紫外吸收檢測(cè)器)上，取同一甘蔗葉供試品，在相同的色譜條件下進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為20yL，檢測(cè)色譜圖，結(jié)果見(jiàn)附圖
6、7、8。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除了 AgilentC18(5 μ m, 4.6mmX 250mm)色譜柱外,其他各種品牌的色譜柱均可得到相似的色譜圖。其中以AgilentC18(5 μ m, 4.6mmX 250mm)分離效果最好,且穩(wěn)定性好，故優(yōu)選的最佳色譜柱為AgilentC18 (5 μ m, 4.6mmX 250mm)。2.2流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1 %冰乙酸水溶液、甲醇-0.2%冰乙酸水溶液系統(tǒng)對(duì)甘蔗葉的HPLC色譜圖進(jìn)行了考察。結(jié)果見(jiàn)附圖9、10、11、12。相同條件下甲醇-水與乙腈-水梯度洗脫，后者色譜圖中的色譜峰不但密集而且分離效果不好，故選定用甲醇-水洗脫后，加不同比例的冰乙酸，改善峰型，減少色譜峰的拖尾。結(jié)果表明甲醇-0.1 %冰乙酸水溶液系統(tǒng)的效果最佳，采用該系統(tǒng)各個(gè)色譜峰的峰型和分離度均較好，因此選定該系統(tǒng)作為流動(dòng)相。

2.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇對(duì)于指紋圖譜，為了能獲取更多的化學(xué)信息總體概括甘蔗葉的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)考察7 210nm、230nm、254nm、320nm、360nm 吸收波長(zhǎng)下的色譜圖，結(jié)果見(jiàn)附圖 13、14、15、16、17。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，檢測(cè)波長(zhǎng)為2IOnm和230nm時(shí)基線飄動(dòng)較大，254nm和360nm色譜峰相對(duì)較少，檢測(cè)波長(zhǎng)為320nm所得色譜圖不但色譜峰較多，而且各峰的峰型較好，基線較為平穩(wěn)。因此選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為320nm。2.4柱溫的選擇本實(shí)驗(yàn)在其他色譜條件相同(流動(dòng)相、梯度洗脫條件、流速、進(jìn)樣量、檢測(cè)器參數(shù))的情況下，用同一甘蔗葉供試品溶液，分別考察了不同色譜柱溫度(20°C，25°C，30°C，35°C )對(duì)供試品的分離度的影響，見(jiàn)附圖18、19、20、21。從圖譜中可知，當(dāng)色譜柱溫度為25°C時(shí)，各色譜峰分離度較好，基線平穩(wěn)，所以本實(shí)驗(yàn)選擇色譜柱溫度為25°C。2.5流速的選擇本實(shí)驗(yàn)考察了0.81111/1^11，1.01111/1^11，1.21111/1^11不同流速下的色譜圖。結(jié)果見(jiàn)附圖22、23、24。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,0.8ml/min和1.2ml/min分離效果不佳，1.0ml/min分離效果好，且基線平穩(wěn)，因此流速選擇1.0ml/min。3指紋圖譜的方法學(xué)考察3.1精密度試驗(yàn)取同一甘蔗葉供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測(cè)色譜圖，測(cè)定主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果主要色譜峰I 14號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%,表明儀器的精密度良好。3.2重復(fù)性試驗(yàn)取同一批的甘蔗葉樣品6份，按供試品制備方法來(lái)制備并進(jìn)行檢測(cè)，考察試驗(yàn)方法的重復(fù)性，結(jié)果表明所有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于I %和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，符合色譜指紋圖譜研究的要求。3.3穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24h不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，所有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于I %和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，樣品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。經(jīng)過(guò)上述研究，本發(fā)明采用如下的色譜條件:色譜柱為AgilentC18(5 μ m,
4.6mmX250mm);流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1%冰乙酸水溶液(B)系統(tǒng)，按以下體積百分比條件進(jìn)行梯度洗脫:0 5min，20 % A，5 15min，20 % 28 % A，15 30min，28 % 34 % A，30 40min，34 % A，40 45min，34 % 42 % A，45 70min，42 % 50 % A，70 95min，50% 65% A ;柱溫25°C ;檢測(cè)器為紫外吸收檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)320nm ;進(jìn)樣量20 μ L ;流速
1.0ml.mirT1。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明的甘蔗葉的定性鑒別HPLC指紋圖譜用于甘蔗葉的質(zhì)量控制，是把指紋圖譜中的14個(gè)特征峰看成一個(gè)整體，可以更加有效地體現(xiàn)中藥成分的整體性和綜合作用，從而更好地評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量。本發(fā)明的檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好、易于掌握和操作的特點(diǎn)。


圖1是甘蔗葉對(duì)照指紋圖譜 圖2是回流提取色譜圖 圖3是超聲提取色譜圖 圖4是石油醚萃取除雜色譜圖 圖5是大孔樹(shù)脂洗脫除雜色譜圖 圖 6 是月旭 Ultimate C18 (5um, 4.6mmX 250mm)色譜圖 圖 7 是依利特 HypersilBDSC18 (5um, 4.6mmX 250mm)色譜圖 圖 8 是安捷倫 AgilentC18 (5um, 4.6mm X 250mm)色譜圖 圖9是甲醇-水梯度洗脫色譜圖 圖10是乙腈-水梯度洗脫色譜圖 圖11是甲醇-0.1 %冰乙酸水溶液梯度洗脫色譜圖 圖12是甲醇-0.2%冰乙酸水溶液梯度洗脫色譜圖 圖13是檢測(cè)波長(zhǎng)210nm色譜圖 圖14是檢測(cè)波長(zhǎng)230nm色譜圖 圖15是檢測(cè)波長(zhǎng)254nm色譜圖 圖16是檢測(cè)波長(zhǎng)320nm色譜圖 圖17是檢測(cè)波長(zhǎng)360nm色譜圖 圖18是柱溫20°C色譜圖 圖19是柱溫25°C色譜圖 圖20是柱溫30°C色譜圖 圖21是柱溫35°C色譜圖 圖22是流速0.8ml.mirT1色譜圖 圖23是流速1.0ml.mirT1色譜圖 圖24是流速1.2ml.mirT1色譜圖
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施例僅作為示例，旨在說(shuō)明本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1甘蔗葉供試品溶液的制備及其指紋圖譜的測(cè)定I甘蔗葉供試品溶液的制備稱取樣品2g按料液比1: 25加入70%乙醇回流提取2h，減壓濃縮，將濃縮樣品上大孔樹(shù)脂柱，先用IOOml水洗脫洗至無(wú)色，然后用100ml70%乙醇洗脫，將洗脫液濃縮，并甲醇定容至5ml容量瓶，離心，備用。2甘蔗葉的指紋圖譜的測(cè)定2.1儀器與試劑2.1.1儀器:安捷倫1100高效液相色譜儀，包括在線真空脫氣機(jī)(G-1322A)，高壓四元梯度泵(G-1311A)，標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器(G-1313A)，智能化柱溫箱(G-1316A)，紫外檢測(cè)器(G-1314A) ,AgilentllOOseries色譜工作站(美國(guó)安捷倫科技公司);LG16_WA高速離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)；KQ5200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BP211D電子天平(德國(guó)賽多利斯)。2.1.2試劑及藥材:甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，甲醇、乙醇(分析純，國(guó)藥試劑有限公司)，石油醚(國(guó)藥試劑有限公司)，冰醋酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；甘蔗葉樣品采集于廣西甘蔗研究所，經(jīng)廣西甘蔗研究所高級(jí)農(nóng)藝師許樹(shù)寧鑒定為禾本科甘鹿屬植物甘鹿(Saccharum officinarum)的葉。2.2分析軟件AgilentllOO色譜工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(藥典2004A版)2.3HPLC分析條件:色譜柱為AgilentC18(5 μ m,4.6mmX250mm);流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1 %冰乙酸水溶液(B)系統(tǒng)，按以下體積百分比條件進(jìn)行梯度洗脫:0 5min，20%A，5 15min，20% 28% A, 15 30min，28% 34% A, 30 40min，34% A, 40 45min，34% 42% A, 45 70min，42% 50% A, 70 95min，50% 65% A ;柱溫 25°C ;分析時(shí)間95min ;檢測(cè)器為紫外吸收檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)320nm ;進(jìn)樣量20 μ L ;流速1.0ml.mirT1。2.4測(cè)定:精密供試品溶液20 μ L，注入高效液相色譜儀測(cè)定，即得。
權(quán)利要求
1.一種甘蔗葉的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，其特征在于它是甘蔗葉的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甘蔗葉的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，所述的一種甘蔗葉的HPLC指紋圖譜測(cè)定的色譜條件是:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱為固定相，甲醇-0.1 %冰乙酸水溶液為流動(dòng)相，采用梯度洗脫，柱溫25°C，檢測(cè)器為紫外吸收檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)320nm,流速1.0ml.mirT1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測(cè)定條件，其中所述的十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱的規(guī)格是5 μ m, 4.6mmX 250mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測(cè)定條件，其中所述的流動(dòng)相是甲醇(A)-0.1 %冰乙酸水溶液⑶體系，其梯度洗脫的體積百分比條件是O 5min，20% A ;5 15min，20% 28% A ;15 30min，28% 34% A ；30 40min，34% A ；40 45min，34% 42% A ；45 70min，42% 50% A ；70 95min，50% 65% A。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甘蔗葉的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，其供試品溶液的制備及測(cè)定方法包括: ①供試品溶液的制備:稱取樣品2g按料液比1: 25加入70%乙醇回流提取2h，減壓濃縮，將濃縮樣品上大孔樹(shù)脂柱，先用IOOml水洗脫洗至無(wú)色，然后用100ml70%乙醇洗脫，將洗脫液濃縮，并甲醇定容至5ml容量瓶，離心，備用。
②測(cè)定方法:精密吸取供試品溶液20μ L，按權(quán)力要求2-4項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定，即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甘蔗葉的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，所述的HPLC指紋圖譜時(shí)間總長(zhǎng)度為95min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甘蔗葉的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，所述的甘蔗葉HPLC指紋圖譜具有14個(gè)特征峰。
全文摘要
本發(fā)明涉及甘蔗葉的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法。本發(fā)明的指紋圖譜檢測(cè)方法包括按一定方法制備供試品溶液，然后在一定的色譜條件下測(cè)得指紋圖譜。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，此方法測(cè)定的指紋圖譜專屬性和重復(fù)性高，可作為鑒定甘蔗葉的.質(zhì)量控制方法。
文檔編號(hào)G01N30/02GK103149282SQ201310014800
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月16日
發(fā)明者侯小濤, 鄧家剛, 馬麗娜 申請(qǐng)人:廣西中醫(yī)藥大學(xué)