專利名稱：一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體及制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組抗體，特別涉及一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體及制備方法及用途。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus, SA)是一種人畜共患病的重要致病菌，是國(guó)內(nèi)外最常見的細(xì)菌性食物中毒病原之一。該菌廣泛分布于自然界中，包括空氣、水、塵埃及人和動(dòng)物的排泄物中，尤其食品極易受污染，其引起的食物中毒臨床表現(xiàn)主要以惡心、嘔吐和腹痛為主，少數(shù)病人有腹瀉、頭痛、頭暈、發(fā)熱、脫水等癥狀。迄今，世界諸多國(guó)家都曾相繼報(bào)道金黃色葡萄球菌的暴發(fā)流行，不但嚴(yán)重危害人類健康，且直接間接經(jīng)濟(jì)損失巨大。金黃色葡萄球菌的強(qiáng)致病性主要取決于耐熱毒素和相關(guān)酶類物質(zhì)的產(chǎn)生能力，其中葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxins, SEs)作用至關(guān)重要。葡萄球菌腸毒素為一類結(jié)構(gòu)相關(guān)、毒力相似、抗原性不同的細(xì)胞外毒素，分子量低(22-24KDa)，易溶于水和鹽溶液，不受胰蛋白酶影響，可耐受100°C煮沸30min而不被破壞。自從1959年葡萄球菌腸毒素被證實(shí)以來(lái)，已獲得腸毒素類型共21種，根據(jù)血清學(xué)特征分類，包括早為人類發(fā)現(xiàn)和熟知的五種腸毒素SEA, SEB, SEC (C型又可分為C1、C2和C3三亞型)，SED, SEE和毒性休克綜合癥毒素I (Toxic shock syndrome toxin-1, TSST-1,既SEF),以及近幾年相繼發(fā)現(xiàn)的 SEG, SEH, SEI, SEJ, SEK, SEL, SEM, SEN, SE0, SEP, SEQ, SER, SET, SEU 等多種新型腸毒素。研究表明，并非所有的腸毒素都能在食物中毒中起作用，其中以SEA和SED最常見，并以SEA毒力最強(qiáng)，攝入I y g即能引起中毒。雖然已從基因水平對(duì)傳統(tǒng)及新型腸毒素加以區(qū)分，但關(guān)于其毒素蛋白及功能的研究甚少，尚無(wú)借鑒資料，因此廣泛獲得不同動(dòng)物及動(dòng)物性食品中葡萄球菌株，提純天然腸毒素蛋白，可為研究葡萄球菌腸毒素檢測(cè)方法及其功能活性奠定基礎(chǔ)，對(duì)豐富其認(rèn)識(shí)亦有重要意義。目前，葡萄球菌腸毒素導(dǎo)致食物中毒機(jī)制有待于進(jìn)一步證實(shí)，從免疫機(jī)制研究，可能與其介導(dǎo)大量細(xì)胞因子釋放而引起多器官損害有關(guān)。與此同時(shí)，作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的超抗原，其獨(dú)特高效的誘導(dǎo)機(jī)體免疫機(jī)制依舊倍受關(guān)注。新生物構(gòu)建技術(shù)與其固有生物特性 的結(jié)合，葡萄球菌腸毒素研究及應(yīng)用前景將更為廣闊?，F(xiàn)階段，對(duì)于葡萄球菌腸毒素的檢測(cè)、預(yù)防、治療的方法和手段多基于免疫原理，隨著分子生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，抗體技術(shù)也逐步由細(xì)胞工程抗體(單克隆抗體)向基因工程抗體演替。基因工程抗體，又被稱為第三代抗體，即應(yīng)用基因工程技術(shù)將抗體基因重組并克隆到表達(dá)載體上，在宿主中表達(dá)并折疊成有功能的抗體分子?；蚬こ炭贵w具有分子小、免疫原性低、可塑性強(qiáng)及成本低等優(yōu)點(diǎn)。此技術(shù)的基本原理是，首先從雜交瘤或免疫脾細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞等中提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，經(jīng)PCR分別擴(kuò)增出抗體的重鏈及輕鏈可變區(qū)基因，按特定方式連接克隆到表達(dá)載體后，表達(dá)、折疊成功能抗體分子，篩選出高表達(dá)的細(xì)胞株，再用親和層析等手段純化抗體片段。基因工程抗體技術(shù)的著眼點(diǎn)在于盡量減少鼠源成分，保留原有抗體的親和力和特異性。該技術(shù)既可以對(duì)完整抗體，又可以對(duì)抗體片段進(jìn)行改造，且不受倫理和技術(shù)等因素的制約，發(fā)展迅速。
單鏈抗體(Single chain Fv segment, scFv)是基因工程抗體技術(shù)重要應(yīng)用產(chǎn)物，即將重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因用寡聚核甘酸連接，經(jīng)表達(dá)、折疊后形成只由重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的新型的小分子抗體，大小僅為完整IgG的1/6，同時(shí)抗原結(jié)合位點(diǎn)沒(méi)有發(fā)生變化，即保持完整的特異性。該抗體缺失Fe片段，減少了與FcR陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性，最大限度地降低鼠源性蛋白的同時(shí)，降低了免疫變態(tài)反應(yīng)的可能性。另外，其分子量小，有利于穿透腫瘤組織，并避免了傳統(tǒng)制備方法中細(xì)胞雜交的過(guò)程，減少工作量，提高制備成功率。近年來(lái)已構(gòu)建了多種類的表達(dá)載體，使單鏈抗體在真核細(xì)胞、原核細(xì)胞、噬菌體等表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，其表達(dá)量、蛋白折疊及糖基化各具特點(diǎn)。通過(guò)抗體庫(kù)展示技術(shù)，體外表達(dá)重組抗體已顯示出廣泛的臨床應(yīng)用前景，特別是寄生蟲抗原表位、自身免疫疾病、基因治療、腫瘤印象分析與治療等方面?；蚬こ讨貥?gòu)抗體技術(shù)日趨成熟，但將其應(yīng)用于葡萄球菌腸毒素抗體的研究，國(guó)內(nèi)外罕有報(bào)道，且研究對(duì)象僅局限于SEB、SEC等少數(shù)傳統(tǒng)腸毒素。綜述其基本路線為:查找相關(guān)IgG抗體的基因序列，分析抗體基因的結(jié)構(gòu)及完整性，利用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增其重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因序列，再通過(guò)LinkeH多采用(Gly4Ser)3)將二者連接，克隆到表達(dá)載體后轉(zhuǎn)入表達(dá)系統(tǒng)。2009年，Kalinina等建立抗SECl基因重構(gòu)抗體原核表達(dá)體系，但受到表達(dá)系統(tǒng)蛋白修飾功能缺乏的制約，其蛋白活性表現(xiàn)受阻，該抗體與SEA、SEB、SED、SEE、SEG和SEI均有不同程度交叉反應(yīng)，特異結(jié)合能力有待提高；2010年，Pawan等通過(guò)PCANTAB5E載體系統(tǒng)制備出特異性強(qiáng)和親和力高的抗SEB單鏈抗體，但研究發(fā)現(xiàn)該表達(dá)系統(tǒng)隨時(shí)間推移分泌能力逐漸消失，穩(wěn)定性缺陷突顯。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中葡萄球菌腸毒素檢測(cè)手段上存在的缺陷，提供一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體的制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體的用途。本發(fā)明的技術(shù) 方案概述如下:一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體，是序列表中SEQ ID N0.1所示氨基酸序列。一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體的制備方法，包括如下步驟:(I)制備葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2 ；(2)采用Trizol法提取葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2總mRNA，以oligo(dT) 18為引物,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；(3)在相對(duì)保守的framel區(qū)和frame4區(qū)，設(shè)計(jì)由所述葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2表達(dá)的單抗的輕鏈可變區(qū)基因的用SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.9所示的上、下游簡(jiǎn)并引物，以及重鏈可變區(qū)基因的用SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示的上、下游簡(jiǎn)并引物；以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因，分別克隆至pUC-Tsimple載體，經(jīng)測(cè)序及MGT/V-QUEST、BLAST分析，確認(rèn)所獲序列符合鼠源抗體可變區(qū)經(jīng)典結(jié)構(gòu)，均為功能性V (D) J重排模式，其中，輕鏈可變區(qū)基因?yàn)镾EQ ID N0.2所示，其編碼的多肽為SEQ ID N0.3所示；重鏈可變區(qū)基因?yàn)镾EQ ID N0.4所示，其編碼的多肽為SEQ IDN0.5所示；(4)結(jié)合二硫鍵穩(wěn)定的重構(gòu)抗體突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)輕鏈可變區(qū)基因的上、下游表達(dá)引物，分別用SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示，以SEQ ID N0.2所示序列為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增，使輕鏈可變區(qū)基因序列C端修飾半胱氨酸及Sma I和Aba I酶切位點(diǎn)；設(shè)計(jì)重鏈可變區(qū)基因的上、下游表達(dá)引物，分別用SEQ ID N0.14和SEQ ID N0.15所示，以SEQ ID N0.4所示序列為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增，使重鏈可變區(qū)基因序列C端修飾半胱氨酸及Nhe I和Hind III酶切位點(diǎn)，同時(shí)在輕鏈可變區(qū)基因序列和重鏈可變區(qū)基因序列的N端引A Kozak 序列；(5)經(jīng)酶切、連接，將步驟(4)獲得的修飾的重鏈可變區(qū)基因序列插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1 (+)，獲得pcDNA3.1-Vh過(guò)渡載體；另以pIRESneo質(zhì)粒為模板，以SEQ ID N0.16和SEQ ID N0.17所示核苷酸為上、下游引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得ivs-1RES序列；同時(shí)以步驟(4)獲得的修飾的輕鏈可變區(qū)基因序列和ivs-1RES序列為模板，以SEQ ID N0.12所示核苷酸為上游引物，以SEQ ID N0.17所示核苷酸為下游引物，采用兩步法重疊PCR方法，擴(kuò)增獲得帶有后續(xù)重組操作BamH I和Xba I酶切位點(diǎn)的ivs-1RES-'融合基因片斷，經(jīng)酶切、連接，插入所述pcDNA3.1-VhS渡載體，構(gòu)建真核單啟動(dòng)子共表達(dá)重組質(zhì)粒p2C2HIL0，其中，5'-VH-1vs-1RES-VL-3' 融合序列如 SEQ ID N0.6 所示，p2C2HIL0 如 SEQ ID N0.7 所示；(6)通過(guò)Lipo2000脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞BHK-21細(xì)胞系，經(jīng)PCR鑒定和G418抗性篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)分泌細(xì)胞系。一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體在葡萄球菌腸毒素檢測(cè)中的應(yīng)用。一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體在細(xì)胞間接免疫熒光檢測(cè)中的應(yīng)用。一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建葡萄球菌腸`毒素單抗輕、重鏈基因真核共表達(dá)載體，獲得高效表達(dá)穩(wěn)定分泌哺乳動(dòng)物細(xì)胞系及特異性高、親和力強(qiáng)的基因重構(gòu)抗體。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體可以對(duì)葡萄球菌腸毒素進(jìn)行檢測(cè)。特別是可以在細(xì)胞間接免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明中所涉及的葡萄球菌腸毒素為天然的葡萄球菌腸毒素或者通過(guò)重組表達(dá)獲得的腸毒素，該腸毒素優(yōu)選為葡萄球菌腸毒素A、葡萄球菌腸毒素G、葡萄球菌腸毒素K、葡萄球菌腸毒素O、葡萄球菌腸毒素Q、葡萄球菌腸毒素U型中的一種或多種。


圖1:葡萄球菌腸毒素單抗可變區(qū)基因克隆的電泳圖片；圖中A為輕鏈可變區(qū)基因擴(kuò)增電泳圖譜，M為DNAMarker，1_6為同時(shí)制備的雜交瘤細(xì)胞267、202、765、5(:12、442、1卩10輕鏈可變區(qū)基因，7為陰性對(duì)照，8為空白對(duì)照。B為重鏈可變區(qū)基因擴(kuò)增電泳圖譜，M為DNAMarker, 1-6為同時(shí)制備的雜交瘤細(xì)胞2G7、2C2、7G5、5C12、4A2、IFlO重鏈可變區(qū)基因片段，
7.陰性對(duì)照，8.空白對(duì)照。圖2:細(xì)胞間接免疫熒光(IFA)結(jié)果圖；圖中a-g為SEA、SEA-his、SEG-his、SEK-his、SEO-his、SEQ-his、SEU-his 處理組，h 為陰性對(duì)照細(xì)胞系。圖3:流式細(xì)胞術(shù)(FCM)結(jié)果圖；圖中A為穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系識(shí)別天然及重組抗原流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果為穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系識(shí)別不同抗原能力比較。
圖4:ELISA應(yīng)用結(jié)果圖。
圖5:重疊PCR反應(yīng)程序。

具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例11.葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2的制備以SEK-GST融合蛋白為免疫抗原，免疫6周齡Balb/c小鼠4次，2周/次:初次免疫采用加入等量弗氏完全佐劑方法頸背部多點(diǎn)皮下注射，免疫抗原劑量為IOOiig/只；二次免疫采用加入等量弗氏不完全佐劑方法頸背部多點(diǎn)皮下注射，免疫抗原劑量為IOOil g/只；第三次及終次免疫不加佐劑，采用尾靜脈注射，免疫抗原劑量為50 yg/只。處死已結(jié)束免疫的Balb/c小鼠，無(wú)菌取脾，制備免疫脾臟細(xì)胞懸浮液備用。通過(guò)PEG法體外融合免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0細(xì)胞，步驟如下:分別吸取并混勻IX IO8個(gè)免疫脾細(xì)胞和5 X IO7個(gè)SP2/0細(xì)胞，1000r/min離心lOmin，棄上清；緩緩加入lmL37°C預(yù)溫的PEG4000融合劑，作用90s后使用DMEM液終止反應(yīng)，800r/min離心lOmin，棄上清；加入適量HAT選擇培養(yǎng)基，以1000個(gè)cell/孔鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每3天更換培養(yǎng)液，持續(xù)篩選7d ;陽(yáng)性細(xì)胞通過(guò)有限稀釋法單克隆后，逐步擴(kuò)大培養(yǎng)，制備得到葡萄球菌暢毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2。2.單抗雜交瘤輕鏈重鏈可變區(qū)基因克隆、測(cè)序分析及表達(dá)載體的構(gòu)建(I)選取穩(wěn)定分泌抗葡萄球菌腸毒素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞2C2株，采用Trizol法提取葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2的總mRNA，以oligo (dT) 18為引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 (2)分別在抗體輕、重鏈可變區(qū)相對(duì)保守的framel區(qū)和frame4區(qū)，設(shè)計(jì)由所述葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2表達(dá)的單抗的輕鏈可變區(qū)基因的上游簡(jiǎn)并引物，用SEQID N0.8所示，下游簡(jiǎn)并引物，用SEQ ID N0.9所示，以及重鏈可變區(qū)基因的上游簡(jiǎn)并引物，用SEQ ID N0.10所示，下游簡(jiǎn)并引物，用SEQ ID N0.11所示；以cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得單抗輕鏈可變區(qū)基因\和單抗重鏈可變區(qū)基因VH。表I輕鏈、重鏈可變區(qū)基因PCR簡(jiǎn)并引物
權(quán)利要求
1.一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體,是序列表中SEQ ID N0.1所示氨基酸序列。
2.一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體的制備方法，包括如下步驟: (1)制備葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2； (2)采用Trizol法提取葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2總mRNA，以oligo(dT)18為引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ； (3)在相對(duì)保守的framel區(qū)和frame4區(qū),設(shè)計(jì)由所述葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2表達(dá)的單抗的輕鏈可變區(qū)基因的用SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.9所示的上、下游簡(jiǎn)并引物，以及重鏈可變區(qū)基因的用SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示的上、下游簡(jiǎn)并引物；以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因，分別克隆至pUC-T simple載體，經(jīng)測(cè)序及MGT/V-QUEST、BLAST分析，確認(rèn)所獲序列符合鼠源抗體可變區(qū)經(jīng)典結(jié)構(gòu)，均為功能性V (D)J重排模式，其中，輕鏈可變區(qū)基因?yàn)镾EQ ID N0.2所示，其編碼的多肽為SEQ ID N0.3所示；重鏈可變區(qū)基因?yàn)镾EQ ID N0.4所示，其編碼的多肽為SEQ ID N0.5所示； (4)結(jié)合二硫鍵穩(wěn)定的重構(gòu)抗體突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)輕鏈可變區(qū)基因的上、下游表達(dá)引物，分別用SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示，以SEQ ID N0.2所示序列為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增，使輕鏈可變區(qū)基因序列C端修飾半胱氨酸及Sma I和Xba I酶切位點(diǎn)；設(shè)計(jì)重鏈可變區(qū)基因的上、下游表達(dá)引物，分別用SEQ ID N0.14和SEQ ID N0.15所示，以SEQ IDN0.4所示序列為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增，使重鏈可變區(qū)基因序列C端修飾半胱氨酸及Nhe I和Hind III酶切位點(diǎn)，同時(shí)在輕鏈可變區(qū)基因序列和重鏈可變區(qū)基因序列的N端引入Kozak序列； (5)經(jīng)酶切、連接，將步驟(4)獲得的修飾的重鏈可變區(qū)基因序列插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1 (+)，獲得pcDNA3.1-Vh過(guò)渡載體；另以pIRESneo質(zhì)粒為模板，以SEQ ID N0.16和SEQ ID N0.17所示核苷酸為上、下游引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得ivs-1RES序列；同時(shí)以步驟(4)獲得的修飾的輕鏈可變區(qū)基因序列和ivs-1RES序列為模板，以SEQ ID N0.12所示核苷酸為上游引物，以SEQ ID N0.17所示核苷酸為下游引物，采用兩步法重疊PCR方法，擴(kuò)增獲得帶有后續(xù)重組操作BamHI和Xba I酶切位點(diǎn)的ivs_IRES-\融合基因片斷，經(jīng)酶切、連接，插入所述pcDNA3.1-Vh過(guò)渡載體，構(gòu)建真核單啟動(dòng)子共表達(dá)重組質(zhì)粒P2C2HIL0，其中，5'-VH-1vs-1RES-VL-3' 融合序列如 SEQ ID N0.6 所示，p2C2HIL0 如 SEQ ID N0.7 所示； (6)通過(guò)Lipo2000脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞BHK-21細(xì)胞系，經(jīng)PCR鑒定和G418抗性篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)分泌細(xì)胞系。
3.權(quán)利要求1的抗體在葡萄球菌腸毒素檢測(cè)中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1的抗體在細(xì)胞間接免疫熒光檢測(cè)中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1的抗體在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體及制備方法及用途，一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體是序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列。本發(fā)明的方法通過(guò)構(gòu)建葡萄球菌腸毒素單抗輕、重鏈基因真核共表達(dá)載體，獲得高效表達(dá)穩(wěn)定分泌哺乳動(dòng)物細(xì)胞系及特異性高、親和力強(qiáng)的基因重構(gòu)抗體。本發(fā)明的葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體可以在葡萄球菌腸毒素檢測(cè)中的應(yīng)用，細(xì)胞間接免疫熒光檢測(cè)中的應(yīng)用和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/577GK103224560SQ201310015929
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月16日
發(fā)明者黃金海, 劉鵬翀 申請(qǐng)人:天津大學(xué)