一種非生物學(xué)篩選抗病毒中藥有效成分的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種非生物學(xué)篩選抗病毒中藥有效成分的方法。該方法以流感病毒的特效藥物奧司他韋(OS)為模板分子,以丙烯酰胺和4-乙烯基吡啶為功能單體,合成非共價(jià)的奧司他韋分子印跡聚合物(OS-MIP),以此為固定相濕法裝填液相色譜柱,對(duì)中草藥及復(fù)方的有效成分群進(jìn)行親和篩選,通過(guò)質(zhì)譜鑒定有親和性的化合物成分,再通過(guò)體外的抗病毒實(shí)驗(yàn)對(duì)化合物的活性進(jìn)行驗(yàn)證,從中藥中發(fā)現(xiàn)和模板分子具有相同抗流感病毒活性的化合物。本發(fā)明可被借鑒用于篩選鑒定其他活性的化合物,從而縮短藥物實(shí)體的篩選過(guò)程,加快替代藥物的研發(fā)過(guò)程,特別是在非生物學(xué)藥物篩選方法中具有重要的實(shí)際意義和廣闊的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種非生物學(xué)篩選抗病毒中藥有效成分的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及活性化合物的篩選鑒定方法,特別是涉及一種從中藥中分離篩選鑒定與預(yù)定模板分子活性相似化合物的非生物學(xué)方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]基于化學(xué)合成的新藥研發(fā)越來(lái)越困難,經(jīng)費(fèi)投入呈幾何級(jí)數(shù)增加,研發(fā)周期也越來(lái)越長(zhǎng)。因此,越來(lái)越多的新技術(shù)用于藥物的篩選與開(kāi)發(fā),如組合化學(xué)方法:快速生產(chǎn)建立包含成千上萬(wàn)化合物的庫(kù);高通量藥物篩選技術(shù):采用各種快速高效的篩選檢測(cè)方法去發(fā)現(xiàn)藥物前體;基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、ADMETox:將藥效學(xué)、代謝機(jī)理和毒性的研究提前到藥物發(fā)現(xiàn)這第一環(huán)節(jié)來(lái)進(jìn)行;虛擬篩選和高內(nèi)涵篩選技術(shù):基于化學(xué)信息學(xué)和化學(xué)生物學(xué)進(jìn)行藥物前體篩選;分子印跡技術(shù):用于中藥成分及有關(guān)化合物的分離純化。
[0004]分子印跡技術(shù)(molecularlyimprinting technology, MIT)也稱(chēng)為分子烙印技術(shù),是源于人們對(duì)抗體-抗原或酶專(zhuān)一性的認(rèn)識(shí),合成對(duì)模板分子具有特定識(shí)別能力的聚合物的技術(shù),是近二十年來(lái)出現(xiàn)且發(fā)展迅猛的一種高選擇性分離技術(shù)。由于MIT模仿了生物界的鎖匙作用原理,使制備的具有記憶功能的分子印跡聚合物(molecular imprintingpolymers, MIPs)擁有極高的選擇性,及很好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性,能夠抵抗很強(qiáng)的機(jī)械作用力,在高溫、高壓、酸、堿、高濃度離子及有機(jī)溶劑等各種惡劣條件下也能保持其原有的特性。在許多相關(guān)領(lǐng)域,如手性拆分、固相萃取、膜分離、模擬抗體的免疫分析、人造酶體系、化學(xué)或生物傳感器、催化劑、組合化學(xué)篩分、藥物篩選等,得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。
[0005]中藥作為我國(guó)悠久的傳統(tǒng)疾病防控藥物,許多中藥及其復(fù)方對(duì)病毒性疾病有著良好的預(yù)防與治療作用。但中藥及其復(fù)方中包含的化合物結(jié)構(gòu)類(lèi)型多樣,是天然的組合化學(xué)庫(kù),而且各成分含量懸殊,許多成分未知,導(dǎo)致從中分離純化有效成分費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且容易丟失微量的有效成分。
[0006]基于分子識(shí)別原理,利用MIPs制成親和色譜柱,利用色譜分離技術(shù)的高速高效性和質(zhì)譜測(cè)定技術(shù)的高靈敏度和獨(dú)有的混合解析能力,在線連接HPLC-MS,理論上可以直接從中藥復(fù)雜體系中分離、篩選出有效成分并進(jìn)行直接鑒定。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種非生物學(xué)篩選抗病毒中藥有效成分的方法。該方法是一種基于分子印跡、液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分離篩選鑒定與模板分子活性類(lèi)似的化合物的非生物學(xué)方法,可以從中草藥及其復(fù)方制劑的有效成分群中,篩選鑒定得到與模板分子活性相似的化合物。
[0008]本發(fā)明可以用于從其他成分復(fù)雜的體系中,篩選鑒定與已知藥物活性類(lèi)似的化合物。
[0009]一種非生物學(xué)篩選抗病毒中藥有效成分的方法,其步驟包括: a.奧司他韋分子印跡聚合物及其液相色譜柱的制備
以?shī)W司他韋(模板分子)0.1 mmol、功能單體0.69 mmol、乙二醇二甲基丙烯酸酯(交聯(lián)劑)5 mmol、30%丙烯酰胺和70% 4-乙烯基吡啶作為功能單體、甲苯作為致孔劑、15 mg偶氮二異丁腈作為引發(fā)劑,60 °C油浴熱引發(fā)聚合反應(yīng),所得質(zhì)地堅(jiān)硬的白色塊狀聚合物,對(duì)其進(jìn)行研磨篩分,收集粒徑在25?45 Mffl之間的顆粒,在索氏提取器中,采用甲醇:乙酸體積比為90: 10對(duì)其進(jìn)行洗脫,以除去模板分子奧司他韋;50°C減壓干燥,在2000 psi的壓力下,濕法裝填150 mmX4.6 mm的液相色譜柱,將該色譜柱接入色譜儀,以合適的流動(dòng)相對(duì)其進(jìn)行洗脫、平衡,直至出現(xiàn)較為平穩(wěn)的基線。
[0010]b.奧司他韋分子印跡液相色譜柱(OSMIP-LC)對(duì)OS和其他化合物的親和分離 色譜條件:Agilent 1200 LC,0S-MIP 自制液相色譜柱(150 mm X 4.6 mm, 25-45
Mffl),柱溫30°C;流動(dòng)相為甲醇-乙腈-甲酸(體積比為75: 25: 0.01),流速為0.075 ml/min,數(shù)據(jù)采集軟件為MassHunter,壓力約170 bar。
[0011]質(zhì)譜條件:Agilent 6410A QQQ電噴霧(ESI)串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀,噴霧器壓力30psi,毛細(xì)管電壓+4000 V,N2流速10 L/min,溫度350 °C,采集周期為200 ms,模式Scan。
[0012]c.基于奧司他韋分子印跡聚合物與液相色譜、質(zhì)譜聯(lián)用,分離篩選鑒定與模板分子活性相似的抗病毒中藥有效成分。
[0013]上述篩選鑒定所得的抗病毒中藥與模板分子的母體結(jié)構(gòu)相同,或完全不同
實(shí)驗(yàn)表明,制備的奧司他韋非共價(jià)分子印跡聚合物,理化性質(zhì)穩(wěn)定,重現(xiàn)性好,可以從中草藥及其復(fù)方制劑的有效成分群中,利用質(zhì)譜和色譜技術(shù)對(duì)化合物的成分進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)篩選到親和性與模板分子相似的化合物苦參堿,以及親和性更強(qiáng)的化合物為槐定堿。體外抗H9N2亞型禽流感病毒的活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,親和性與模板分子相似的化合物苦參堿,其具有與模板分子奧司他韋相似的抗H9N2亞型禽流感病毒的活性;而未和性較模板分子更強(qiáng)的化合物槐定堿及其他化合物,在體外則沒(méi)有抗H9N2亞型禽流感病毒的活性。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和產(chǎn)生的有益效果是:
我國(guó)中草藥資源豐富,是天然的化合物庫(kù)??梢砸源嘶钚灶?lèi)似化合物的篩選鑒定方法為依托,合成某些活性化合物的分子印跡聚合物,結(jié)合液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),從中草藥及其復(fù)方、甚至微生物的發(fā)酵液的化學(xué)成分群中,篩選鑒定得到與模板分子活性類(lèi)似的化合物。特別是對(duì)于醫(yī)學(xué)臨床中沒(méi)有備選藥物,或者毒副作用較大的藥物,以及采用常規(guī)生物學(xué)篩選方法而危險(xiǎn)較大的化合物,可以采用此技術(shù);對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的活性類(lèi)似的藥物實(shí)體,可以加快藥物篩選的過(guò)程。綜上所述,本發(fā)明所涉及的技術(shù)將在藥物研發(fā)領(lǐng)域,具有較大的實(shí)際意義和廣闊的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1 OSMIP-LC對(duì)混合物的分離效果;其中a為總離子流圖,b為37.7 min時(shí)的提取質(zhì)譜圖,c為147.8 min時(shí)的提取質(zhì)譜圖。
[0016]圖2連翹苷石油醚提取部分的親和篩選圖譜;其中a為總離子流圖,b為31.2 min時(shí)的提取質(zhì)譜圖。
[0017]圖3鴨跖草乙酸乙酯提取部分的親和篩選圖譜;其中a為總離子流圖,b為34.2min時(shí)的提取質(zhì)譜圖。[0018]圖4炎毒熱清氯仿提取部分的親和篩選圖譜;其中a為總離子流圖,b為134.5min時(shí)的提取質(zhì)譜圖,c為41.3 min時(shí)的提取質(zhì)譜圖。
[0019]圖5不同化合物標(biāo)準(zhǔn)品在OSMIP-LC柱上的色譜特性;其中a為苦參堿,b為氧化苦參堿,c為槐定堿,d為氧化槐定堿。
[0020]圖6化合物活性預(yù)期保留時(shí)間差異的趨勢(shì)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0022]下述實(shí)施例中所用方法未特殊說(shuō)明處,均為常規(guī)方法。
[0023]1.奧司他韋分子印跡聚合物及其液相色譜柱的制備
采用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化聚合物制備過(guò)程中的參數(shù),奧司他韋(模板分子)0.1 mmol、功能單體0.69 mmol、乙二醇二甲基丙烯酸酯(交聯(lián)劑)5 mmol、30%丙烯酰胺和70% 4-乙烯基批啶作為功能單體、甲苯作為致孔劑、15 mg偶氮二異丁腈作為引發(fā)劑,60 1:油浴熱引發(fā)聚合反應(yīng),所得質(zhì)地堅(jiān)硬的白色塊狀聚合物,對(duì)其進(jìn)行研磨篩分,收集粒徑在25?45 Mm之間的顆粒,在索氏提取器中,采用甲醇-乙酸(90: 10,V/V)對(duì)其進(jìn)行洗脫,以除去模板分子奧司他韋;50°C減壓干燥,在2000 psi的壓力下,濕法裝填150 mmX4.6 mm的液相色譜柱,將該色譜柱接入色譜儀,以合適的流動(dòng)相對(duì)其進(jìn)行洗脫、平衡,直至出現(xiàn)較為平穩(wěn)的基線。
[0024]2.奧司他韋分子印跡液相色譜柱(OSMIP-LC)對(duì)OS和其他化合物的親和分離 色譜條件:Agilent 1200 LC,0S-MIP 自制液相色譜柱(150 mm X 4.6 mm, 25-45
Mffl),柱溫30°C;流動(dòng)相為甲醇-乙腈-甲酸(體積比為75: 25: 0.01),流速為0.075 ml/min,數(shù)據(jù)采集軟件為MassHunter,壓力約170 bar。
[0025]質(zhì)譜條件:Agilent 6410A QQQ電噴霧(ESI)串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀,噴霧器壓力30psi,毛細(xì)管電壓+4000 V,N2流速10 L/min,溫度350 °C,采集周期為200 ms,模式Scan。
[0026]混合物樣品中含有阿司匹林、連翹苷、綠原酸,以及模板分子OS,在上述的色譜和質(zhì)譜條件下,自制的OSMIP-LC柱,可以實(shí)現(xiàn)其他成分與模板分子的有效分離(見(jiàn)圖1)。而對(duì)于模板分子之外的成分,則不能實(shí)現(xiàn)其相互之間的有效分離。從圖1的總離子流圖(TIC)和質(zhì)譜圖中可以看出,阿司匹林、連翹苷和綠原酸在OSMIP-LC柱上的保留時(shí)間是一致的,均為37 min左右;而模板分子OS保留時(shí)間為150 min左右。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,自制的OS-MIP液相色譜柱,對(duì)模板分子有良好的選擇性與親和性,而對(duì)模板分子以外的其他化合物沒(méi)有選擇性,可以用于混合物中模板分子及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的分離篩選。
[0027]3.0SMIP-LC對(duì)中草藥及其復(fù)方制劑化學(xué)成分群的親和篩選
(I)OSMIP-LC對(duì)單味中草藥分部位提取物的親和篩選
圖2和圖3分別顯示了 0SMIIP-LC對(duì)單味中草藥分部位提取物的親和篩選結(jié)果。
[0028]從圖2和圖3中的總離子流圖上可以看出,連翹苷、鴨跖草的分部位提取物的保留時(shí)間均在30?40 min之間;質(zhì)譜圖中顯示,成分較為復(fù)雜。以上結(jié)果說(shuō)明,上述分部位提取物中的成分,與自制的OS-MIP之間沒(méi)有親和性;自制的OSMIP-LC柱對(duì)這些成分亦不能實(shí)現(xiàn)有效地分離。
[0029](2)對(duì)中藥復(fù)方制劑分部位提取物的親和篩選
選取臨床上對(duì)畜禽病毒性疾病療效確切的中藥復(fù)方制劑炎毒熱清等,采用不同極性的溶劑進(jìn)行分部位提取化學(xué)成分群,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑,以甲醇溶解殘?jiān)?,采?.22 μπι有機(jī)系濾膜過(guò)濾,濾液密封低溫保存,備用。
[0030]對(duì)復(fù)方制劑的分部位提取物,采用0SMIP-LC-MS聯(lián)用技術(shù),對(duì)其進(jìn)行親和篩選、分離。在中藥復(fù)方炎毒熱清的氯仿提取物中,得到了如下的圖譜(圖4)。
[0031]在TIC圖上,出現(xiàn)了兩個(gè)明顯的色譜峰,其中沒(méi)有親和性的成分,保留時(shí)間在30?40 min之間,化合物成分較為復(fù)雜,其中含有連翹苷[M + Na]+557.20。有親和性的成分,保留時(shí)間在130?150 min之間,而模板分子OS的保留時(shí)間為150 min,說(shuō)明自制的分子印跡聚合物對(duì)該成分有親和性。質(zhì)譜圖上該化合物的分子量為248.30,圖上顯示的離子分別為[M + Η]+249.30、[Μ + Na]+271.20、[2M + Na]+519.40。
[0032]4.被篩選出化合物的成分鑒定
根據(jù)中藥及復(fù)方制劑中組方的中藥成分,查詢相關(guān)文獻(xiàn),認(rèn)為分子量為248.20的化合物為苦參堿或槐定堿。對(duì)鑒定出的化合物進(jìn)行0SMIP-LC-MS驗(yàn)證。
[0033]稱(chēng)取苦參堿和槐定堿,以及他們的氧化物氧化苦參堿和氧化槐定堿標(biāo)準(zhǔn)品適量,色譜甲醇溶解,0.22 μ m微孔濾膜濾過(guò),在前述的色譜、質(zhì)譜條件下進(jìn)樣。結(jié)果如下。
[0034]圖5分別顯示了苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿和氧化槐定堿4種化合物,在自制OSMIP-LC柱上的色譜特性。上述的4幅TIC圖中,各化合物在自制色譜柱上的保留時(shí)間為超過(guò)150 min,均較模板分子OS的保留時(shí)150 min長(zhǎng)。說(shuō)明自制的色譜柱對(duì)此4種化合物有一定的親和性。在自制OSMIP-LC柱上,苦參堿的保留時(shí)間為170 min,氧化苦參堿為240min,槐定堿為310 min,氧化槐定堿為210 min ;而中草藥復(fù)方制劑炎毒熱清,有親和性的成分,其保留時(shí)間約為140 min (見(jiàn)圖4),結(jié)合分子量,因而判定該成分為苦參堿;然而由于復(fù)方制劑中其他成分的相互干擾,而引起目標(biāo)成分(圖4,140 min)與其標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間之間有差異(圖5a,170 min)。
[0035]分子印跡聚合物,是根據(jù)模板分子的結(jié)構(gòu)定制的吸附材料,對(duì)模板分子及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的親和性較強(qiáng)。因而推測(cè),在分子印跡色譜柱上,親和性與模板分子相似的化合物,其在結(jié)構(gòu)上與模板分子相似,應(yīng)該具有和模板分子相似的活性。
[0036]OS是目前治療流感的特效藥物,以O(shè)S為模板分子合成分子印跡聚合物,并以此制備液相色譜柱,用以從中藥及其復(fù)方制劑中親和篩選分離與其結(jié)構(gòu)相似的,具有抗病毒活性的化合物,結(jié)合質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)篩選出的化合物進(jìn)行成分鑒定。為了驗(yàn)證這一篩選、分離、鑒定一體化技術(shù)的適用性和有效性,對(duì)篩選出的化合物苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、氧化槐定堿、連翹苷、綠原酸等進(jìn)行體外抗禽流感病毒實(shí)驗(yàn)。
[0037]5.對(duì)篩選鑒定出的化合物進(jìn)行體外抗禽流感病毒的活性檢測(cè)
選取苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、氧化槐定堿、連翹苷、綠原酸,同時(shí)以阿司匹林、奧司他韋、雙黃連注射液、炎毒熱清注射液(中藥復(fù)方)等作為對(duì)照藥物。
[0038]實(shí)驗(yàn)所用的毒株為雞H9N2亞型禽流感病毒,實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞為犬腎細(xì)胞(MDCK)。先行測(cè)定所選取藥物對(duì)細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度,然后在37 °C條件下將一定濃度的H9N2病毒培養(yǎng)液與細(xì)胞吸附I h后,棄去病毒液,加入含有不同濃度藥物的細(xì)胞維持液(不含血清),37V 5% CO2培養(yǎng),分別在24、48、72 h觀察細(xì)胞的病變情況并檢測(cè)各個(gè)濃度下細(xì)胞培養(yǎng)上清液是否有血凝現(xiàn)象。結(jié)果見(jiàn)表I。
[0039]表I各藥物體外抗雞H9N2禽流感病毒活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種非生物學(xué)篩選抗病毒中藥有效成分的方法,其步驟包括: a.奧司他韋分子印跡聚合物及其液相色譜柱的制備 以0.1 mmol奧司他韋為模板分子、0.69 mmol功能單體、5 mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑、30%丙烯酰胺和70% 4-乙烯基吡啶作為功能單體、甲苯作為致孔劑、15 mg偶氮二異丁腈作為引發(fā)劑,60 °C油浴熱引發(fā)聚合反應(yīng),所得質(zhì)地堅(jiān)硬的白色塊狀聚合物,對(duì)其進(jìn)行研磨篩分,收集粒徑在25?45 Mffl之間的顆粒,在索氏提取器中,采用甲醇-乙酸,甲醇-乙酸體積比為90: 10,對(duì)其進(jìn)行洗脫,以除去模板分子奧司他韋;50 °C減壓干燥,在2000 psi的壓力下,濕法裝填150 mm X 4.6 mm的液相色譜柱,將該色譜柱接入色譜儀,以合適的流動(dòng)相對(duì)其進(jìn)行洗脫、平衡,直至出現(xiàn)較為平穩(wěn)的基線; b.奧司他韋分子印跡液相色譜柱(OSMIP-LC)對(duì)OS和其他化合物的親和分離 液相色譜條件:Agilent 1200 LC, 0S-MIP 自制 150 mm X 4.6 mm, 25-45 Mm液相色譜柱,柱溫30°C;流動(dòng)相為甲醇-乙腈-甲酸,甲醇:乙腈:甲酸體積比為75: 25: 0.01,流速為0.075 ml/min,數(shù)據(jù)采集軟件為MassHunter,壓力約170 bar ; 質(zhì)譜條件:Agilent 6410A QQQ電噴霧串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀,噴霧器壓力30 psi,毛細(xì)管電壓+4000 V,N2流速10 L/min,溫度350 °C,采集周期為200 ms,模式Scan; c.基于奧司他韋分子印跡聚合物與液相色譜、質(zhì)譜聯(lián)用,分離篩選鑒定與模板分子活性相似的抗病毒中藥有效成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種非生物學(xué)篩選抗病毒中藥有效成分的方法,其特征在于:篩選鑒定所得的抗病毒中藥與模板分子的母體結(jié)構(gòu)相同,或完全不同。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK103940932SQ201310016583
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2013年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月17日
【發(fā)明者】李劍勇, 楊亞軍, 劉希望, 張繼瑜, 李冰, 周緒正, 劉玉榮, 魏小娟, 牛建榮 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所