專(zhuān)利名稱：一種用于檢測(cè)c-kit基因突變的探針、引物及檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種C-KIT基因突變的檢測(cè)探針、引物及試劑盒。
背景技術(shù)：
C-KIT是一種原癌基因，位于染色體4qll-12基因全長(zhǎng)約80kb。C-KIT編碼的C-KIT蛋白屬于III型受體酪氨酸激酶家族成員，其分子量約為145KD的跨膜蛋白，包含了胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)，跨膜區(qū)和配體結(jié)合位點(diǎn)胞外區(qū)。當(dāng)配體與其結(jié)合后能激活自身酪氨酸蛋白激酶活性，通過(guò)一系列反應(yīng)激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。格列衛(wèi)(Gleevec)是針對(duì)C-KIT開(kāi)發(fā)的一種革巴向藥物,通過(guò)結(jié)合Kit蛋白胞衆(zhòng)內(nèi)酪氨酸激酶功能區(qū)的ATP位點(diǎn)，阻斷磷酸基團(tuán)由ATP向底物酪氨酸殘基的轉(zhuǎn)移，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和分化。胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)是消化道最常見(jiàn)的間葉源性腫瘤。絕大部分的GIST均存在CKIT基因突變，從而使Kit蛋白的活化不需要通過(guò)配體激活就能刺激腫瘤細(xì)胞的持續(xù)增殖和抗凋亡信號(hào)的失控。研究表明，在GIST患者中C-KIT基因突變率約為90%，C-KIT的突變位點(diǎn)主要位點(diǎn)位于17外顯子Asp816Val的突變，其中第9外顯子Ala502_Tyr503的突變約占5_10%。臨床研究表明GIST中C-KIT基因的突變情況與靶向藥物格列衛(wèi)的療效密切相關(guān):存在外顯子17的D816V的突變患者的療效較差，表明C-KIT的突變會(huì)導(dǎo)致腫瘤患者對(duì)D816V的靶向藥物治療產(chǎn)生耐藥性。因此，在實(shí)施化療之前，通過(guò)快速的方法對(duì)C-KIT基因突變的檢測(cè)可延長(zhǎng)患者生存期，指導(dǎo)患者的合理用藥，避免過(guò)度化療，指導(dǎo)臨床科學(xué)用藥具有重要的參考價(jià)值。目前DNA直接測(cè)序法檢測(cè)為C-KIT基因突變的檢測(cè)主要方法。然而，直接測(cè)序的靈敏度低，檢測(cè)靈敏度只有20-30%，低靈敏度的檢測(cè)會(huì)導(dǎo)致漏檢及假陰性的發(fā)生。此外，直接測(cè)序法實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，檢測(cè)效率低、樣品易污染、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，無(wú)法滿足臨床檢測(cè)的實(shí)際需求，臨床迫切需要開(kāi)發(fā)一種高靈敏度，快速的C-KIT基因突變檢測(cè)技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)采用高靈敏度檢測(cè)方法對(duì)C-KIT基因突變進(jìn)行檢測(cè)，從而為臨床腫瘤的個(gè)體化治療方案提供科學(xué)參考。本發(fā)明開(kāi)發(fā)一種快速，高靈敏、操作簡(jiǎn)便的C-KIT基因突變檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間只需90分鐘即可完成，同時(shí)具備了靈敏度高，特異性好，快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種用于C-KIT基因突變檢測(cè)的引物和探針，通過(guò)對(duì)其突變的檢測(cè)可以用于GI ST化療預(yù)后，其特異引物與探針包括如下序列:KF:CATCGCCATACTCATGCTCGSEQNOlKR:TAATTAGAATGACCTTGATGASEQN02
KP:FAM-CGGCTAGACGATATCACATATC-BHQI SEQN03本發(fā)明另一方面提供一種用于檢測(cè)C-KIT基因突變檢測(cè)試劑盒，其PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系如下:I X PCR 緩沖液
模板DNAο μ
C-KIT 引物3 μΜ
C-KIT 探針3 μΜ
Taq _1.5 U
dNTP10.0 mM
MgCL225.0 mM
甲酰胺1%本發(fā)明另一方面提供一種用于檢測(cè)C-KIT基因突變方法，其方法包括以下步驟:(I)根據(jù)COSMIC數(shù)據(jù)公布的人類(lèi)C-KIT為野生型基因序列，針對(duì)C-KIT的突變點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物和探針。(2)提取檢測(cè)樣本中基因組DNA，檢測(cè)樣本包括新鮮病理組織、全血和血漿等組織中的DNA。(3)配制實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系。(4)根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增 儀顯示的Ct值判斷檢測(cè)結(jié)果:檢測(cè)反應(yīng)體系的FAM熒光強(qiáng)度，以FAM達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，Ct值為O或31:陰性；Ct值小于31:陽(yáng)性。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明采用了特異性引物和探針技術(shù)，可以特異性檢測(cè)C-KIT基因突變。此方法:(I)建立了實(shí)時(shí)PCR體系實(shí)現(xiàn)對(duì)C-KIT基因D816V快速檢測(cè)；(2)靈敏度高，5-10拷貝的突變可以檢出；(3)特異性強(qiáng)，IOng的野生型基因組DNA不會(huì)產(chǎn)生非特異性信號(hào)；(4)檢測(cè)速度快，檢測(cè)過(guò)程只需要90分鐘即可完成。(5)穩(wěn)定率高。對(duì)于PCR來(lái)說(shuō)，通常腫瘤細(xì)胞C-KIT的突變的模板序列的絕對(duì)數(shù)并不高；而當(dāng)拷貝數(shù)低于1000，引物和探針雜交效率陡然下降，穩(wěn)定檢出并不容易。因此，需要引物有較高的單次雜交效率，以便能夠有效啟動(dòng)延伸反應(yīng)，在本發(fā)明的實(shí)施例中，多次檢測(cè)結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的引物和探針和傳統(tǒng)測(cè)序的結(jié)果符合率為100%，可以穩(wěn)定檢出。


圖1為實(shí)施例檢測(cè)陰性樣本PCR圖。圖2為實(shí)施例檢測(cè)突變陽(yáng)性樣本PCR圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以野生型細(xì)胞系基因組為DNA模板，建立C-KIT實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)反應(yīng)體系，針對(duì)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物和探針，檢測(cè)C-KIT基因突變的方法包括以下步驟:(I)針對(duì)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成特異性引物和探針根據(jù)COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)公布的C-KIT基因序列為野生型序列，針對(duì)C-KIT基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物和探針。通過(guò)特異性引物和探針優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)高靈敏和快速檢測(cè)。設(shè)計(jì)的引物和探針序列如表I所示。(2)檢測(cè)樣本處理與DNA的提取檢測(cè)樣本包括新鮮病理組織，石蠟包埋組織、全血、血漿和胸腔積液。對(duì)于鮮病理組織和石蠟組織樣品，樣品切成5-10μπι，加入ImL 二甲苯脫蠟，離心收集沉淀，加入ImL無(wú)水乙醇到沉淀中，室溫或37°C晾干，加入蛋白酶K和BufferATL，56°C消化裂解I小時(shí)，90°C孵化lh，加入200mL Buffer AL混勻再加入200 μ L無(wú)水乙醇充分混勻，將上清小心轉(zhuǎn)移至Ij 01八21^離心柱中，6000父8 (8000rpm)離心 Imin,加入 500 μ LBuffer AU, 6000Xg(8000rpm)離心 lmin,小心打開(kāi)蓋子加入 500 μ LBuffer AW2, 6000X g(8000rpm)離心 lmin,空管離心20000 Xg (14000rpm)離心3min,加入100 μ LBuffer ATE于膜中央,溫育5分鐘，20000 Xg (14000rpm)離心lmin。對(duì)于全血、血衆(zhòng)和胸腔積液,其體積不少于800 μ L,使用TIANGEN的DNA提取試劑盒提取基因組DNA。提取具體操作步驟按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作。所提DNA溶于Tris-HCl中(lOmmol/L，PH8.0),經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取質(zhì)量，確定其濃度，然后用Tris-HCl溶液調(diào)整DNA濃度到2ng/ μ L作為PCR模板，取5 μ L進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。(2 )建立PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系應(yīng)用上述設(shè)計(jì)的探針和引物，取5μ L提取的DNA作為反應(yīng)模板，采用如下PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:I X PCR 緩沖液
模板DNA5 ah
C-KIT 引物3 μΜ
C-KIT 探針3 μΜ
Taq 酶L 5 U
dNTP10.0 mM
MgCL225.0 mM
甲酰胺1%實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件是95°C預(yù)變性5分鐘，I個(gè)循環(huán)；95°C變性25秒，64°C退火20秒，72°C延伸20秒，15個(gè)循環(huán)；93°C變性25秒，60°C退火35秒，72°C延伸20秒，31個(gè)循環(huán)。后31個(gè)循環(huán)在退火時(shí)檢測(cè)FAM和HEX熒光信號(hào)。(4)根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增儀顯示的Ct值判斷檢測(cè)結(jié)果:檢測(cè)反應(yīng)體系的FAM熒光強(qiáng)度，以FAM達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，Ct值為O或31:陰性；Ct值小于31:陽(yáng)性。以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另有定義或說(shuō)明，本專(zhuān)利所述的科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解具有相同的含義。實(shí)施例1本實(shí)施例以基因工程構(gòu)建的質(zhì)粒為陽(yáng)性質(zhì)粒，利用本發(fā)明實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)C-KIT基因D842V突變的方法包括如下步驟:(I)檢測(cè)樣本DNA提取
將樣本加入ImL 二甲苯脫蠟，離心收集沉淀，加入ImL無(wú)水乙醇到沉淀中，室溫或37°C晾干，加入蛋白酶K和Buffer ATL，56°C消化裂解I小時(shí)，90°C孵化lh，加入200mLBuffer AL混勻再加入200 μ L無(wú)水乙醇充分混勻，將上清小心轉(zhuǎn)移到QIA2mL離心柱中，6000Xg (8000rpm)離心 lmin,加入 500 μ LBufferAWl, 6000Xg (8000rpm)離心 lmin,小心打開(kāi)蓋子加入 500 μ LBuffer AW2, 6000Xg (8000rpm)離心 lmin,空管離心 20000Xg(14000rpm)離心 3min,加入 100 μ LBuffer ATE 于膜中央，溫育 5 分鐘，20000 X g( 14000rpm)離心lmin。所提DNA溶于Tris-HCl中(lOmmol/L，PH8.0),經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取質(zhì)量，確定其濃度，然后用Tris-HCl溶液調(diào)整DNA濃度到2ng/ μ L作為PCR模板，取5 μ L進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。 (2)建立PCR反應(yīng)體系應(yīng)用上述設(shè)計(jì)的探針和特異引物，取5 μ L提取的DNA作為反應(yīng)模板，采用如下PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:1 X PCR 緩沖液
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)C-KIT基因突變的引物和探針，其特征在于，包括以下序列:SEQIDNOl-SEQ ID N03。
2.用于檢測(cè)C-KIT基因突變的試劑盒，其特征在于，包括以下序列:SEQID NO 1-SEQID N03。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)C-KIT基因突變的檢測(cè)試劑盒，其特征在于:包括如下熒光PCR的反應(yīng)體系: I X PCR緩沖液模板DNA5 pL C-KIT 引物3 μΜ C-KIT 探針3 μΜTaq 藤L 5 U dNTP10.0 mM MgCL225.0 mM甲酰胺1%
4.如權(quán)利要求2所述的C-KIT基因突變檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟: (1)提供權(quán)利要求1所述的引物和探針序列； (2)待測(cè)樣品的處理和模板DNA的提取； (3)配制熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系； (4)用步驟(I)的引物和探針擴(kuò)增待測(cè)基因突變靶序列； 檢測(cè)反應(yīng)體系的FAM和HEX熒光強(qiáng)度，以FAM達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，Ct值大于或等于31為陰性；Ct值小于31為陽(yáng)性。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)C-KIT的引物、探針及試劑盒。本發(fā)明主要包括以下序列SEQ ID NO1-SEQ ID NO3。本發(fā)明采用特異引物和探針技術(shù)，建立了用于檢測(cè)C-KIT基因突變的實(shí)時(shí)熒光PCR體系。該方法(1)靈敏度高，可檢出5-10拷貝的突變DNA；(2)特異性強(qiáng)，10ng的野生型基因組DNA不會(huì)產(chǎn)生非特異性信號(hào)；(3)檢測(cè)速度快，檢測(cè)過(guò)程只需要90分鐘即可完成。
文檔編號(hào)G01N21/64GK103114133SQ20131002265
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月22日
發(fā)明者阮力, 林清華, 羅捷敏, 鄭立謀 申請(qǐng)人:廈門(mén)艾德生物醫(yī)藥科技有限公司