基于新型質(zhì)量差異標(biāo)簽的生物體系中羧酸類信號分子的相對定量方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種基于新型質(zhì)量差異標(biāo)簽分子對定量生物樣品體系中羧酸類信號分子的相對含量的方法，還提供一種由輕/重同位素對標(biāo)記的質(zhì)量差異標(biāo)簽分子對及其合成方法。所述質(zhì)量差異標(biāo)簽分子對包含輕同位素標(biāo)簽分子和重同位素標(biāo)簽分子，其中兩種標(biāo)簽分子為式(I)所示，所述輕/重同位素對存在于所述結(jié)構(gòu)部分A和B中的任一部分或兩部分中，其中：結(jié)構(gòu)部分A中的輕/重同位素對選自由H/D，12C/13C和14N/15N組成的組中的一種或多種，或者結(jié)構(gòu)部分B中的輕/重同位素對選自由H/D，12C/13C和16O/18O組成的組中的一種或多種。
【專利說明】基于新型質(zhì)量差異標(biāo)簽的生物體系中羧酸類信號分子的相對定量方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種基于新型質(zhì)量差異標(biāo)簽分子對定量生物樣品體系中羧酸類信號分子的相對含量的方法，所述方法是一種高靈敏度、高通量的相對定量方法。本發(fā)明還提供一種由輕/重同位素對標(biāo)記的質(zhì)量差異標(biāo)簽分子對及其合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002]羧酸類信號分子是生物內(nèi)天然存在的某些含羧基的化學(xué)分子，其作用是在細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)傳遞信息，參與調(diào)控生物生長發(fā)育的很多過程，其研究成果具有重大的應(yīng)用價值。為了深入研究羧酸類信號分子的作用機理，有必要對它們的含量變化展開研究。但是，羧酸類信號分子的定量分析主要面臨以下挑戰(zhàn):含量較低；生物體中存在其它高含量次生代謝產(chǎn)物的干擾；為了研究信號分子的時間-空間分布和/或互作網(wǎng)絡(luò)，要求對多種信號分子及前體或代謝物同時進行含量分析；一些生物材料，如突變體，非常稀少珍貴；樣品通量大，樣品處理過程步驟多，耗時長。因此，羧酸類信號分子的檢測難度很大，要求十分靈敏的、準(zhǔn)確的、多種信號 分子同時測定的高通量分析方法。
[0003]目前應(yīng)用較多的定量方法是基于質(zhì)譜儀的穩(wěn)定同位素稀釋法，在負(fù)離子模式下直接對羧酸類信號分子進行絕對定量分析。但該方法主要有以下兩個缺陷:對一些信號分子無法檢測或靈敏度差；需使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的信號分子標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)標(biāo)，有的難以獲得，僅有的標(biāo)準(zhǔn)品種類稀少、價格昂貴。以上缺陷都限制了羧酸類信號分子的定量分析。
[0004]很多情況下，生物和植物學(xué)家更關(guān)注羧酸類信號分子在對比的一組樣品中的含量差異，因而可以將蛋白質(zhì)組學(xué)中的相對定量思路應(yīng)用到此類信號分子的相對定量分析中。目前有報道的唯一相關(guān)的技術(shù)是利用3-溴-2-氧代丙基吡啶及其氘標(biāo)試劑為質(zhì)量差異標(biāo)簽研究了 7個茉莉酸類信號分子的相對含量。但該方法的目標(biāo)僅是一類信號分子，無法滿足對多種類信號分子的同時相對定量分析及互作網(wǎng)絡(luò)研究；此外，該體外標(biāo)記方式的誤差較大，因為對比樣品在合并分析之前經(jīng)過了單獨的提取、衍生化標(biāo)記和固相萃取處理，這些過程的誤差無法補償，且單獨過固相萃取柱增加了分析的成本、時間和精力，樣品通量較低[Huang YQ, etal.(2011)Use ofisotopemass probes for metabolic analysis of the jasmonate biosynthetic pathway.Analystl36:1515-1522]。
[0005]為彌補上述方法的不足，我們開發(fā)了基于新型質(zhì)量差異標(biāo)簽的色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS)對羧酸類信號分子進行相對定量分析。通過化學(xué)衍生化方法，使對比的兩種樣品(如對照組和處理組)在一步溶劑提取之后即分別與一對結(jié)構(gòu)相同、但元素組成不同的質(zhì)量差異標(biāo)簽，(2-溴乙基)三甲基溴化銨[Bromocholine Bromide (BETA),分子式C5H13NBr2,輕同位素標(biāo)簽分子]和其9氣代同位素標(biāo)記的標(biāo)簽分子D9-BETA[分子式C5H4D9NBr2,重同位素標(biāo)簽分子]反應(yīng)，反應(yīng)后，將對比的兩種樣品的反應(yīng)產(chǎn)物合并進行后續(xù)的樣品預(yù)處理及LC-MS/MS分析。得到的峰面積比即該羧酸類信號分子在一組對比樣品中的相對含量。本方法首次實現(xiàn)了多種類羧酸類信號分子的同時、高靈敏、高通量、準(zhǔn)確的相對定量分析，有助于推動羧酸類信號分子時間-空間分布及互作網(wǎng)絡(luò)、代謝組學(xué)等相關(guān)研究的發(fā)展。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]在第一方面中，本發(fā)明提供一種由輕/重同位素對標(biāo)記的質(zhì)量差異標(biāo)簽分子對，所述質(zhì)量差異標(biāo)簽分子對包含結(jié)構(gòu)相同、但元素組成不同的兩種標(biāo)簽分子，即輕同位素標(biāo)簽分子和重同位素標(biāo)簽分子，這兩種標(biāo)簽分子為式(I)所示:
[0007]
【權(quán)利要求】
1.一種由輕/重同位素對標(biāo)記的質(zhì)量差異標(biāo)簽分子對，所述質(zhì)量差異標(biāo)簽分子對包含輕同位素標(biāo)簽分子和重同位素標(biāo)簽分子，其中這兩種標(biāo)簽分子為式(1)所示:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)量差異標(biāo)簽分子對，其中所述結(jié)構(gòu)部分A中，RpR2和R3是CH3,所述結(jié)構(gòu)部分B是C2H4,所述結(jié)構(gòu)部分C中的X是Br ;其中的輕/重同位素對是H/D，存在于所述結(jié)構(gòu)部分A中。
3.一種合成(2-溴乙基)三甲基溴化銨(BETA)的9氘代同位素標(biāo)記的標(biāo)簽分子D9-BETA的方法，所述方法包括將D9-三甲基胺在干燥甲醇作用下，于干冰-丙酮浴中與1，2- 二溴乙烷反應(yīng)，待反應(yīng)混合物恢復(fù)至室溫后，在室溫攪拌2天，形成白色固體，純化得到(2-溴乙基)三甲基溴化銨的9氘代同位素標(biāo)記的標(biāo)簽分子D9-BETA。
4.一種基于權(quán)利要求1或2的質(zhì)量差異標(biāo)簽分子對定量生物樣品體系中羧酸類信號分子的相對含量的方法，所述方法包括下述步驟: (1)分別稱取等質(zhì)量的待對比其中羧酸類信號分子含量的生物材料，分為對照組樣品和處理組樣品； (2)將步驟(1)的對照組樣品和處理組樣品分別用適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑提取，離心后取上清液，室溫下氮氣吹干； (3)將步驟(2)的產(chǎn)物分別復(fù)溶于乙腈，依次加入三乙胺作為縛酸劑，對照組樣品與權(quán)利要求I或2所述的輕同位素標(biāo)簽分子進行衍生化反應(yīng)，處理組樣品與權(quán)利要求1或2所述的重同位素標(biāo)簽分子進行衍生化反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物分別用氮氣吹干； (4)將步驟(3)的產(chǎn)物分別復(fù)溶于水，合并復(fù)溶后的溶液，上樣至預(yù)先活化和平衡好的陽離子交換柱，經(jīng)淋洗、洗脫，將洗脫液用氮氣吹干； (5)將步驟(4)的洗脫產(chǎn)物用含甲酸的乙腈溶液復(fù)溶，過濾，在正離子模式下進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜LC-MS/MS分析； (6)按式(II)計算對照組樣品和處理組樣品中羧酸類信號分子的相對含量:
A1/A2 = C1/C2(II) 其中: Al表示由輕同位素標(biāo)簽分子標(biāo)記的對照組樣品中羧酸類信號分子標(biāo)記產(chǎn)物的峰面積； A2表示由重同位素標(biāo)簽分子標(biāo)記的處理組樣品中羧酸類信號分子標(biāo)記產(chǎn)物的峰面積； Cl表示對照組樣品中羧酸類信號分子的含量； C2表示處理組樣品 中羧酸類信號分子的含量。
【文檔編號】G01N30/02GK103936598SQ201310024247
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月23日
【發(fā)明者】閆存玉, 孫曉紅, 歐陽玥, 褚金芳, 楊軍 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所