一種同時富集磷酸化肽段和糖基化肽段并質(zhì)譜分析的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域，涉及富集磷酸化肽和糖基化肽的方法，具體涉及一種利用氨基修飾的磁性納米材料同時選擇性富集磷酸化肽和糖基化肽的新方法。本發(fā)明通過一鍋法合成了氨基修飾的磁性納米材料Fe3O4@NH2，利用磁性材料Fe3O4和磷酸化肽之間的螯合作用以及材料表面帶正電的氨基和帶負電的磷酸肽之間的靜電作用，實現(xiàn)磷酸化肽段的選擇性富集；利用磁性納米材料表面氨基的親水性實現(xiàn)糖肽的選擇性富集；進一步實現(xiàn)磷酸化肽段和糖基化肽段的同時富集和質(zhì)譜分析。本發(fā)明方法步驟簡單、操作方便、快速高效，可以實現(xiàn)磷酸化肽和糖基化肽的同時高靈敏質(zhì)譜分析。
【專利說明】一種同時富集磷酸化肽段和糖基化肽段并質(zhì)譜分析的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域，涉及富集磷酸化肽和糖基化肽的方法，具體涉及一種利用氨基修飾的磁性納米材料同時選擇性富集磷酸化肽和糖基化肽的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002]研究公開了磷酸化和糖基化是生物體內(nèi)組普遍存在的兩種翻譯后修飾，它們執(zhí)行著重要的生物學(xué)功能，如，蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化是原核和真核生物細胞表達調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對若干生物的細胞功能起開關(guān)調(diào)控作用，是一種普遍的重要調(diào)節(jié)機制。而糖基化修飾在各種生命現(xiàn)象中起著重要的作用，如，參與細胞黏附及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響蛋白質(zhì)的分泌和穩(wěn)定性，免疫及炎癥反應(yīng)以及影響蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)送方向等。研究報道，約有生物體內(nèi)約1/3以上的蛋白質(zhì)會發(fā)生磷酸化，而1/2以上的蛋白質(zhì)會發(fā)生糖基化，研究顯示若干蛋白質(zhì)則同時具有磷酸化修飾和糖基化修飾。高靈敏地鑒定生物體內(nèi)這些后修飾位點是實現(xiàn)進一步研究的首要前提。然而，所述的研究均面臨著類似的困難。首先，含有上述兩種翻譯后修飾的蛋白質(zhì)種類雖然很多，但其豐度卻通常較低，并且其酶解成肽段后占全部肽段的比例更低，通常只有2-5%左右的肽段帶有磷酸化或糖基化修飾；第二，帶有磷酸化和糖基化修飾的肽段在質(zhì)譜中的離子化效率往往比非修飾肽段低，因而不易被質(zhì)譜鑒定；第三，盡管已經(jīng)有較多的方法實現(xiàn)了磷酸化肽和糖基化肽的富集，但這樣的富集是對磷酸化和糖基化肽分別進行的，導(dǎo)致在傳統(tǒng)的研究中往往只能單一地研究磷酸化肽或者糖基化肽，這對于同時攜帶這兩種修飾的蛋白質(zhì)的研究是很大的缺陷。因此，發(fā)展磷酸化肽和糖基化肽同時富集的方法，將有利于研究兩種修飾同時存在的情況，實現(xiàn)它們的高靈敏質(zhì)譜鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種步驟簡單、操作方便、快速高效，同時實現(xiàn)磷酸化肽和糖基化肽選擇性富集和高靈敏度質(zhì)譜鑒定的新方法，具體涉及一種利用氨基修飾的磁性納米材料同時選擇性富集磷酸化肽和糖基化肽的方法。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0005]1.合成氨基修飾的磁性納米材料；
[0006]2.首先對其中的磷酸化肽段進行富集；
[0007]3.收集經(jīng)磷酸化富集后的肽段溶液，再次進行糖基化肽富集；
[0008]4.最后將磷酸化肽和糖基化肽從磁性納米材上洗脫下來送入質(zhì)譜分析。
[0009]具體地，本發(fā)明通過一鍋法合成了氨基修飾的磁性納米材料Fe3O4ONH2，利用磁性材料Fe3O4和磷酸化肽之間的螯合作用以及材料表面帶正電的氨基和帶負電的磷酸肽之間的靜電作用，實現(xiàn)磷酸化肽段的選擇性富集；利用磁性納米材料表面氨基的親水性實現(xiàn)糖肽的選擇性富集；進一步實現(xiàn)磷酸化肽段和糖基化肽段的同時富集和質(zhì)譜分析。
[0010]更具體的，本發(fā)明的一種同時富集磷酸化肽段和糖基化肽段并質(zhì)譜分析的方法，其特征在于，采用氨基修飾的磁性納米材料為吸附劑，利用氨基修飾的磁性納米材料和磷酸化肽之間的螯合作用以及材料表面帶正電的氨基和帶負電的磷酸肽之間的靜電作用，實現(xiàn)磷酸化肽段的選擇性富集，本發(fā)明的實施例中，選用氨基修飾的磁性納米材料Fe3O4ONH2,利用磁性納米材料表面氨基的親水性實現(xiàn)糖肽的選擇性富集，進一步實現(xiàn)磷酸化肽和糖基化肽的同時富集和質(zhì)譜分析，其包括步驟:
[0011](I)在多肽樣品中，加入氨基修飾的磁性納米材料Fe3O4ONH2材料與多肽溶液混合；
[0012](2)外加磁場，使磁性材料和溶液分離，分別收集上清液和收集下層固體相；
[0013](3)收集下層固體相，清洗材料，每次清洗后外加磁場將材料和溶液分開,收集材料，用含有5%氨水的水溶液再混勻材料；外加磁場再次將材料從上清液中分離后，取上清液與有機基質(zhì)混合，進行基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜分析；
[0014](4)在步驟(2)獲得的上清液中加入一定體積的碳酸氫銨溶液，使pH呈中性；再往其中加入氨基修飾的磁性納米材料Fe3O4ONH2材料與多肽溶液混合使樣品中的糖基化肽充分吸附，外加磁場，使磁性材料和溶液分離，收集下層固體相。清洗材料，每次清洗后外加磁場將材料和溶液分開，收集材料；
[0015](5)用含有三氟乙酸的水溶液再混勻材料。外加磁場再次將材料從上清液中分離后，取上清液與有機基質(zhì)混合，進行基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜分析。
[0016]本發(fā)明中，氨基修飾的磁性納米材料按下述步驟以1，6-己二胺為穩(wěn)定劑水熱一鍋法合成:將2.0-4.0克六水合三氯化鐵、4.0-8.0克無水醋酸鈉和3.6-7.2克的1，6-己二胺溶解在30毫升乙二醇中，在室溫下機械攪拌0.5-2小時，然后置于含有聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，將反應(yīng)釜放置于180-220°C的烘箱中6-12小時，取出，用自來水使其冷卻至室溫；用磁分離分離出產(chǎn)物磁簇，并用無水乙醇洗滌除去未反應(yīng)的反應(yīng)物，最后將產(chǎn)物分散在無水乙醇中，備用。
[0017]本發(fā)明中，氨基修飾磁性納米材料的尺寸為50_200nm，本發(fā)明的實施例中，選用氨基修飾的磁性納米材料Fe3O4ONH2材料，在多肽樣品中，加入5-25毫克的Fe3O4ONH2材料與多肽的溶液在25 - 37攝氏度下混合3-5分鐘，以使樣品中的磷酸化肽充分吸附；多肽樣品濃度為0.5ng/uL?IOng/ μ L，體積為50 μ L?ImL ;所述的多肽樣品溶于含1%三氟乙酸的80%乙腈水溶液中。
[0018]本發(fā)明中，對于步驟(2)中得到的下層固體相，用50yL— ImL含1%三氟乙酸的80%乙腈水溶液清洗材料1-3次，每次清洗后外加磁場將材料和溶液分開，收集材料,用5 μ L含有5%氨水的水溶液重新混勻材料,使磷酸化肽充分從材料上解離,外加磁場再次將材料從上清液中分離后，取上清液與有機基質(zhì)含有1%磷酸的2，5-二羥基苯甲酸(2，5-DHB)混合，進行基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜分析；
[0019]在獲得的上清液中加入碳酸氫銨溶液，使pH處于6.5-7.5，且保證加入碳酸氫銨后，溶液終濃度中乙腈的體積分數(shù)含量不低于70% ；
[0020]再往所獲得的溶液中，加入5-25毫克的Fe3O4ONH2材料與多肽溶液在25 — 37攝氏度下混合3-5分鐘，使樣品中的糖基化肽充分吸附，外加磁場，使得磁性材料和溶液分離，收集下層固體相，用70%乙腈的水溶液清洗材料1-3次，每次清洗后外加磁場將材料和溶液分開，收集材料；
[0021 ] 本發(fā)明步驟(5 )中，用5 μ L含有5%三氟乙酸的水溶液再混勻材料使糖基化肽從材料上解離，外加磁場再次將材料從上清液中分離后，，取上清液與有機基質(zhì)α -氰基-4-羥基肉桂酸(a -CHCA)混合，進行基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜分析。本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0022]本發(fā)明使用的功能化介孔納米材料，其材料尺寸在50_200nm范圍內(nèi)較為合適，采用一鍋法將氨基修飾于材料表面。本發(fā)明選用的氨基修飾的磁性納米材料，以氨基為修飾基團。首先在含乙腈的酸性溶液中對磷酸化肽段進行富集，可以利用磁性材料Fe3O4和磷酸化肽之間的螯合作用以及材料表面帶正電的氨基和帶負電的磷酸肽之間的靜電作用，實現(xiàn)磷酸化肽段在材料上的選擇性富集，富集后分別收集富集有磷酸化肽的磁性納米材料和上清溶液，對富集有磷酸化肽的磁性納米材料進行洗脫，可實現(xiàn)磷酸化肽段的高靈敏分析。另將經(jīng)過磷酸化肽富集后的上清溶液用碳酸氫銨調(diào)至中性后，再次向其中加入氨基修飾的磁性納米材料，利用磁性納米材料表面氨基的親水性可以實現(xiàn)糖肽在材料上的選擇性富集，富集后用酸性的洗脫液將糖基化肽從磁性納米材上洗脫下來，可實現(xiàn)糖基化肽的高靈敏分析。因而，在一次實驗中可以同時實現(xiàn)磷酸化肽和糖基化肽的同時高靈敏質(zhì)譜分析。本發(fā)明選用的氨基修飾的磁性納米材料，以具有磁性的Fe3O4為核心，具有高的磁響應(yīng)性?？梢岳猛饧哟艌龅姆绞綄⒉牧蠌娜芤褐蟹蛛x出來，免去傳統(tǒng)離心分離方法耗時長等缺點。本發(fā)明具有步驟簡單、操作方便、快速高效等特點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本富集方法的流程圖。
[0024]圖2為lng/μ L標準磷酸化蛋白質(zhì)beta-酪蛋白酶解肽段的MALD1-T0F-MS譜圖，MALD1-T0F-MS譜圖縱坐標為質(zhì)譜峰的相對強度(100%Intensity)，橫坐標為質(zhì)荷比(m/z)；(a)是富集前，(b)從體積為100 μ L的樣品溶液富集后得到的；*為磷酸化肽段的單電荷峰，&為磷酸化肽的雙電荷峰；對比圖(a)和圖(b)可以看出，經(jīng)過富集后，磷酸化肽可以被選擇性的富集下來。
[0025]圖3為Ing/ μ L標準糖蛋白質(zhì)辣根過氧化物酶的酶解肽段的MALD1-TOF-MS譜圖，MALD1-TOF-MS譜圖縱坐標為質(zhì)譜峰的相對強度(100%Intensity),橫坐標為質(zhì)荷比(m/z)。
(a)是富集前，(b)從體積為100μ L的樣品溶液富集后得到的;#為糖基化肽段的單電荷峰，@為糖基化肽段的雙電荷峰；對比圖(a)和圖(b)可以看出，經(jīng)過富集后，糖基化肽可以被選擇性的富集下來。
[0026]圖4為5ng/yL以質(zhì)量比為1:1的標準磷酸化蛋白質(zhì)beta-酪蛋白酶解肽段和標準糖蛋白質(zhì)辣根過氧化物酶的酶解肽段的MALD1-T0F-MS譜圖，MALD1-TOF-MS譜圖縱坐標為質(zhì)譜峰的相對強度(100%Intensity),橫坐標為質(zhì)荷比(m/z) ； (a)是未富集得到的；
(b)是經(jīng)磷酸化肽富集后得到的；(C)是收集磷酸化肽富集后的上清再次富集糖基化肽得到的；*為磷酸化肽段的單電荷峰，&為磷酸化肽的雙電荷峰。#為糖基化肽段的單電荷峰，@為糖基化肽段的雙電荷峰；對比圖(a)和圖(b) (C)可以看出，經(jīng)過富集后，磷酸化肽和糖基化肽均可以被選擇性的富集下來，實現(xiàn)；同時富集和質(zhì)譜鑒定。
【具體實施方式】
[0027]下面的實例是對本發(fā)明提出的一種同時富集磷酸化肽段和糖基化肽段并質(zhì)譜分析方法的進一步說明。[0028]實施例1
[0029]氨基修飾磁性納米材料對磷酸化肽選擇性富集能力的試驗
[0030]配制100 μ Llng/μ L級別的磷酸化蛋白質(zhì)beta-酪蛋白酶解肽段混合物(溶于含有三氟乙酸的乙腈水溶液中)，將氨基修飾的磁性納米材料在上述溶液中孵育3-5分鐘后在外加磁場作用下將磁性納米材料從溶液中分離出來。棄除上清液，然后取5 μ L5%氨水的水溶液重新混勻固體相，搖晃5分鐘后在外加磁場作用下將磁性納米材料從溶液中分離出來，取上清液(最終的含有磷酸化肽段的溶液)I μ L點樣于MALDI靶板上，待干燥后再點樣等體積的2，5- 二羥基苯甲酸基質(zhì)溶液(1%磷酸50%乙腈水溶液)，干燥結(jié)晶后進行MALD1-T0F/MS分析，結(jié)果如圖2所示。
[0031]實施例2
[0032]氨基修飾磁性納米材料對糖基化肽選擇性富集能力的試驗
[0033]配制100 μ Llng/μ L級別標準糖蛋白質(zhì)辣根過氧化物酶酶解肽段(溶于含有碳酸氫銨的乙腈水溶液中)，將氨基修飾的磁性納米材料在上述溶液中孵育3-5分鐘后在外加磁場作用下將磁性納米材料從溶液中分離出來。棄除上清液，然后取5 μ L5%三氟乙酸的水溶液重新混勻固體相，搖晃5分鐘后在外加磁場作用下將磁性納米材料從溶液中分離出來，取上清液(最終的含有糖基化肽段的溶液)I μ L點樣于MALDI靶板上，待干燥后再點樣等體積的α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)溶液(0.1%三氟乙酸50%乙腈水溶液)，干燥結(jié)晶后進行MALD1-T0F/MS分析，結(jié)果如圖3所示。
[0034]實施例3
[0035]氨基修飾磁性納米材料同時選擇性富集磷酸化和糖基化肽能力的試驗
[0036]配制100μ L5ng/y L級別的磷酸化蛋白質(zhì)beta-酪蛋白酶解肽段，標準糖蛋白質(zhì)辣根過氧化物酶酶解肽段的混合物(溶于含有三氟乙酸的乙腈水溶液中)，將氨基修飾的磁性納米材料在上述溶液中孵育3-5分鐘后在外加磁場作用下將磁性納米材料從溶液中分離出來，同時收集上清液。然后，一方面取5 μ L5%氨水的水溶液重新混勻固體相，搖晃5分鐘后在外加磁場作用下將磁性納米材料從溶液中分離出來，取上清液(最終的含有磷酸化肽段的溶液)I μ L點樣于MALDI靶板上，待干燥后再點樣等體積的2，5- 二羥基苯甲酸基質(zhì)溶液(1%磷酸50%乙腈水溶液)，干燥結(jié)晶后進行MALD1-T0F/MS分析；另一方面將收集到的完成磷酸化肽富集后的上清溶液，向其中加入碳酸氫銨溶液，使溶液PH呈中性。然后將氨基修飾的磁性納米材料在上述溶液中孵育3-5分鐘后，在外加磁場作用下將磁性納米材料從溶液中分離出來。取5μ L5%三氟乙酸的水溶液重新混勻固體相,搖晃5分鐘后在外加磁場作用下將磁性納米材料從溶液中分離出來，取上清液(最終的含有糖基化肽段的溶液)I μ L點樣于MALDI靶板上，待干燥后再點樣等體積的α -氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)溶液(0.1%三氟乙酸50%乙腈水溶液)，干燥結(jié)晶后進行MALD1-T0F/MS分析，結(jié)果如圖4所示。
【權(quán)利要求】
1.一種同時富集磷酸化肽段和糖基化肽段并質(zhì)譜分析的方法，其特征在于，采用氨基修飾的磁性納米材料為吸附劑，實現(xiàn)磷酸化肽段的選擇性富集和糖基化肽的選擇性富集后，進行基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜分析；其包括步驟: (1)在多肽樣品中，加入氨基修飾的磁性納米材料與多肽溶液混合； (2)外加磁場，使磁性材料和溶液分離，分別收集上清液和收集下層固體相； (3)收集下層固體相，清洗材料，清洗后外加磁場將材料和溶液分開，收集材料，用含有5%氨水的水溶液再混勻材料；外加磁場再次將材料從上清液中分離后，取上清液與有機基質(zhì)混合，進行基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜分析； (4 )在步驟(2 )獲得的上清液中加入碳酸氫銨溶液，使pH呈中性；再加入氨基修飾的磁性納米材料與多肽溶液混合使樣品中的糖基化肽充分吸附，外加磁場，使磁性材料和溶液分離，收集下層固體相。清洗材料，每次清洗后外加磁場將材料和溶液分開，收集材料； (5)用含有三氟乙酸的水溶液再混勻材料。外加磁場再次將材料從上清液中分離后，取上清液與有機基質(zhì)混合，進行基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜分析。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述步驟(1)的多肽樣品濃度為0.5ng/uL^lOng/ μ L,體積為 50 μ L~ImL。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述步驟(1)的多肽樣品溶于含1%三氟乙酸的80%乙腈水溶液中。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述步驟(1)中的氨基修飾磁性納米材料的尺寸為 50_200nm。
5.按權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征是，所述步驟(1)或(4)中的氨基修飾的磁性納米材料為Fe3O4ONH2材料；其加入量為5-25毫克。
6.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述步驟(1)中的氨基修飾磁性納米材料以I,6-己二胺為穩(wěn)定劑水熱一鍋法合成。
7.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟(1)中氨基修飾磁性納米材料進行樣品富集的溫度是25 - 37攝氏度，樣品富集的時間是3 - 5分鐘。
8.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟(3)中用50μL — ImL含1%三氟乙酸的80%乙腈水溶液清洗材料1-3次。
9.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟(3)中用5μL含有5%氨水的水溶液再混勻材料使磷酸化肽充分從材料上解離；
10.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟(4)中補加的碳酸氫銨溶液使溶液pH呈6.5-7.5，加入碳酸氫銨水溶液后，溶液終濃度中乙腈的體積分數(shù)含量不低于70%。
11.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟(5)中用50μL — lmL70%乙腈水溶液清洗材料1-3次。
12.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟(6)中用5μ L含有5%三氟乙酸的水溶液再混勻材料使糖基化肽從材料上解離。
【文檔編號】G01N27/62GK103940894SQ201310025887
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月23日
【發(fā)明者】陸豪杰, 張瑩, 楊芃原 申請人:復(fù)旦大學(xué)