專利名稱：激光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像方法與裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于光學(xué)顯微成像及光譜測(cè)量技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種激光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像方法與裝置，可用于各類樣品的三維形貌重構(gòu)及微區(qū)光譜探測(cè)。
背景技術(shù)：
1990年G.J.Puppels等在Nature期刊報(bào)道其發(fā)明的將拉曼光譜探測(cè)技術(shù)與激光共焦顯微技術(shù)結(jié)合的激光共焦拉曼光譜顯微技術(shù)，是拉曼技術(shù)的一次革命性突破。該技術(shù)既繼承了共焦顯微術(shù)的高分辨層析成像特征，又可以對(duì)樣品進(jìn)行光譜分析，因此可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品微區(qū)光譜的高分辨層析探測(cè)。此顯著優(yōu)點(diǎn)使激光共焦拉曼光譜顯微技術(shù)在光譜測(cè)試領(lǐng)域獨(dú)樹(shù)一幟，并且迅速發(fā)展為一種極其重要的樣品結(jié)構(gòu)與成分分析的重要手段，使之廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理學(xué)、地質(zhì)學(xué)、法庭取證、刑偵學(xué)等學(xué)科的前沿基礎(chǔ)研究中。目前，典型的激光共焦拉曼光譜探測(cè)儀的原理如圖2所示，激光沿光路依次經(jīng)過(guò)第一聚光鏡、第一針孔、第八聚光鏡、第一分光系統(tǒng)、四分之一波片、物鏡后，聚焦在被測(cè)樣品上，激發(fā)出載有樣品光譜特性的拉曼散射光；移動(dòng)被測(cè)樣品，使對(duì)應(yīng)被測(cè)樣品不同區(qū)域的拉曼散射光再次通過(guò)四分之一波片并被第一分光系統(tǒng)反射，經(jīng)過(guò)第四聚光鏡、第四針孔、第五聚光鏡后聚焦進(jìn)入第一光譜儀進(jìn)行光譜探測(cè)?，F(xiàn)代科技的快速發(fā)展對(duì)微區(qū)光譜探測(cè)能力及空間分辨探測(cè)能力提出了更高的要求，若要提高空間分辨力，必須對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行精確定焦。在光學(xué)探測(cè)系統(tǒng)中，當(dāng)測(cè)量聚焦光斑位于焦點(diǎn)時(shí)其尺寸最小，激發(fā)光強(qiáng)最強(qiáng)，因此為了獲得高空間分辨力，必須能夠捕獲到激發(fā)光強(qiáng)最強(qiáng)處的光譜，從而獲得其最佳空間分辨力和最優(yōu)的光譜探測(cè)能力。如圖1所示，現(xiàn)有的共焦顯微技術(shù)在激光激發(fā)焦點(diǎn)O附近的BB'區(qū)域內(nèi)，均能激發(fā)出樣品的拉曼光譜，并能被針孔后的光譜探測(cè)系統(tǒng)探測(cè)。因而共焦拉曼光譜顯微技術(shù)的實(shí)際探測(cè)位置往往處于共焦曲線中離焦的BA和A' B'區(qū)，從而導(dǎo)致實(shí)際探測(cè)的“微區(qū)”遠(yuǎn)大于測(cè)量光束焦點(diǎn)O處光斑尺寸，同時(shí)，應(yīng)用拉曼光譜進(jìn)行共焦定位信噪比較低，并且由于針孔的遮擋作用會(huì)進(jìn)一步降低拉曼光譜的能量，而擴(kuò)大針孔尺寸提高光譜通過(guò)率則會(huì)增加共焦軸向定位曲線的半高寬，降低其定位精度，而現(xiàn)有共焦拉曼系統(tǒng)中的共焦針孔尺寸通常在150 μ m 200 μ m之間，所用針孔尺寸相對(duì)較大，亦不能很好的起到定焦作用。上述原因限制了共焦拉曼光譜顯微系統(tǒng)探測(cè)微區(qū)光譜的能力，制約了其在更精細(xì)微區(qū)光譜測(cè)試與分析場(chǎng)合中的應(yīng)用，因而提高系統(tǒng)的定焦精度是提高其空間分辨力的關(guān)鍵。1996 年 Kimberley F 等人在《Description and Theory of a Fiber-OpticConfocal and Super-Focal Raman Microspectrometer))中提出用光纖束代替共焦拉曼光譜顯微鏡的針孔的方法，實(shí)現(xiàn)“針孔”尺寸的非機(jī)械調(diào)節(jié)，其在擴(kuò)大“針孔”時(shí)，并不降低系統(tǒng)的光譜分辨力;2007 年 E Kenwood Blvd 等在《Very efficient fluorescent backgroundsuppression in confocal Raman microscopy Department of Physics))中提出通過(guò)使用3-4ps的皮秒激光器結(jié)合相應(yīng)的瞬時(shí)曝光技術(shù)使樣品測(cè)量的熒光背景降低了約3個(gè)數(shù)量級(jí)，提高了共焦拉曼光譜顯微術(shù)的分辨力；2008年N.Everall等在《The Influenceof Out-of-Focus Sample Regions on the Surface Specificity of Confocal RamanMicroscopy》中指出采用大數(shù)值孔徑(NA=1.4)油浸物鏡，可獲得了比傳統(tǒng)共焦拉曼光譜儀更高的軸向分辨力和信噪比，但是這種方法需要對(duì)樣品進(jìn)行制片，不能實(shí)現(xiàn)非接觸和無(wú)損測(cè)量，限制了系統(tǒng)的應(yīng)用范圍；2009年M.J.Pelletier和Neil J.Everall等在((Controlof Out-of-Focus Light Intensity in Confocal Raman microscopy using opticalpreprocessing》中提出利用校正物鏡或結(jié)構(gòu)光瞳掩模消除了離焦位置拉曼散射的光譜強(qiáng)度的干擾，提高了光譜探測(cè)效率，大大降低了共焦拉曼系統(tǒng)離焦拉曼光譜對(duì)其有效深度分辨力的影響。上述研究，主要集中在共焦拉曼光譜顯微系統(tǒng)涉及的光源系統(tǒng)、光譜探測(cè)系統(tǒng)、聚焦物鏡系統(tǒng)、光譜信息處理等方面，雖然改善了光譜系統(tǒng)的總體性能，但在共焦拉曼光譜系統(tǒng)空間分辨能力的方面卻沒(méi)顯著改善，提高拉曼光譜系統(tǒng)的空間分辨力仍是懸而未決的問(wèn)題。在物理化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、薄膜和藥物等研究領(lǐng)域，分析樣品的化學(xué)成分、空間分布、表面物理化學(xué)性質(zhì)時(shí)常以圖像的形式來(lái)獲取樣品更多的信息，因此需要將拉曼光譜探測(cè)由單點(diǎn)分析方式拓展到對(duì)一定區(qū)域范圍內(nèi)樣品進(jìn)行探測(cè)分析，即拉曼光譜成像。然而，為了獲得更精確、更豐富的測(cè)量信息，拉曼光譜成像時(shí)既需較長(zhǎng)的單點(diǎn)激發(fā)拉曼光譜探測(cè)時(shí)間，又需對(duì)樣品進(jìn)行多點(diǎn)拉曼光譜探測(cè)，其結(jié)果勢(shì)必使拉曼光譜成像需要較長(zhǎng)的探測(cè)時(shí)間，常達(dá)幾個(gè)小時(shí)才能完成成像。但是，儀器長(zhǎng)時(shí)間成像過(guò)程中受環(huán)境溫度、振動(dòng)、空氣抖動(dòng)等的影響較大，易使儀器系統(tǒng)產(chǎn)生漂移，從而導(dǎo)致樣品被探測(cè)位置離焦；由于現(xiàn)有共焦拉曼光譜探測(cè)技術(shù)不具備實(shí)時(shí)焦點(diǎn)跟蹤能力，因而在整個(gè)成像過(guò)程中，無(wú)法補(bǔ)償樣品的探測(cè)位置偏移引入的離焦誤差，制約了共焦拉曼光譜成像技術(shù)空間分辨能力的提高。共焦拉曼光譜探測(cè)技術(shù)在毒品探測(cè)、寶玉石真?zhèn)舞b別、油氣勘探、化學(xué)分析以及考古等研究領(lǐng)域?qū)ζ涮綔y(cè)聚焦光斑的尺寸要求有所差異，而現(xiàn)有的共焦拉曼探測(cè)技術(shù)無(wú)法精確控制聚焦光斑尺寸的大小，其結(jié)果亦限制了共焦拉曼光譜成像技術(shù)在各領(lǐng)域中的應(yīng)用?，F(xiàn)有共焦拉曼光譜探測(cè)儀器中，系統(tǒng)收集到的樣品散射光束中包含的拉曼散射光極其微弱，只有系統(tǒng)收集到的樣品散射光束中包含的瑞利光束的10_3 10_6倍，因此，在共焦拉曼光譜探測(cè)中如何利用現(xiàn)有光譜探測(cè)系統(tǒng)中遺棄的強(qiáng)于拉曼散射光IO3 IO6倍的瑞利光束進(jìn)行輔助探測(cè)是改善共焦拉曼光譜探測(cè)技術(shù)空間分辨力的新途徑。基于上述情況，本發(fā)明提出差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)利用現(xiàn)有共焦拉曼光譜探測(cè)系統(tǒng)收集到的樣品散射光中遺棄的強(qiáng)于樣品拉曼散射光IO3 IO6倍的瑞利光束進(jìn)行高精度探測(cè)，使其與光譜探測(cè)系統(tǒng)有機(jī)融合，進(jìn)行空間位置信息和光譜信息的同時(shí)探測(cè)，以期實(shí)現(xiàn)高空間分辨力、測(cè)量聚焦光斑尺寸可控的“圖譜合一”的差動(dòng)共焦圖譜成像與探測(cè)，而實(shí)現(xiàn)高空間分辨力的光譜探測(cè)是目前光譜顯微測(cè)試領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題，具有極其重要的理論和學(xué)術(shù)價(jià)值。本發(fā)明專利的具體思路是:將激光差動(dòng)共焦技術(shù)與光譜探測(cè)技術(shù)有機(jī)結(jié)合，差動(dòng)共焦系統(tǒng)利用系統(tǒng)收集到的樣品散射光中的瑞利光束對(duì)聚焦光斑的焦點(diǎn)進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤與空間位置探測(cè)，光譜探測(cè)系統(tǒng)利用系統(tǒng)收集到的樣品的散射光中的拉曼散射光進(jìn)行光譜探測(cè)，然后再將差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)信號(hào)與拉曼光譜探測(cè)系統(tǒng)信號(hào)有機(jī)融合，從而實(shí)現(xiàn)激光差動(dòng)共焦拉曼光譜系統(tǒng)的焦點(diǎn)跟蹤探測(cè)和光斑尺寸可控探測(cè)，即實(shí)現(xiàn)拉曼光譜的高空間分辨探測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有共焦拉曼光譜探測(cè)技術(shù)空間分辨力難以提高的不足，提出一種具有高空間分辨力的激光差動(dòng)共焦圖譜顯微層析成像方法和裝置。本發(fā)明的目的是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明提供的激光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像方法，a)通過(guò)激發(fā)光束產(chǎn)生系統(tǒng)產(chǎn)生激發(fā)光，經(jīng)過(guò)第一分光系統(tǒng)、物鏡后，聚焦在被測(cè)樣品上，并激發(fā)出瑞利光和載有被測(cè)樣品光譜特性的拉曼散射光，激發(fā)出的拉曼散射光和瑞利光被系統(tǒng)收集回光路中，經(jīng)過(guò)物鏡后被第一分光系統(tǒng)反射至二向色分光系統(tǒng)，經(jīng)二向色分光系統(tǒng)分光后，拉曼散射光和瑞利光相互分離，瑞利光被反射進(jìn)入差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)，拉曼散射光透射進(jìn)入光譜探測(cè)系統(tǒng)，利用差動(dòng)共焦曲線過(guò)零點(diǎn)與焦點(diǎn)位置精確對(duì)應(yīng)這一特性，通過(guò)零點(diǎn)觸發(fā)來(lái)精確捕獲激發(fā)光斑焦點(diǎn)位置的光譜信息，實(shí)現(xiàn)高空間分辨的光譜探測(cè)；b)只對(duì)接收到的瑞利光信號(hào)進(jìn)行差動(dòng)相減處理時(shí)，系統(tǒng)可以進(jìn)行高空間分辨的三維尺度層析成像；只對(duì)接收到的拉曼散射光的光譜信號(hào)進(jìn)行處理時(shí)，系統(tǒng)可以進(jìn)行光譜探測(cè)；同時(shí)對(duì)接收到的瑞利光和拉曼散射光的信號(hào)進(jìn)行處理時(shí)，系統(tǒng)可以進(jìn)行高空間分辨的微區(qū)圖譜層析成像，即被測(cè)樣品幾何位置信息和光譜信息的高空間分辨的“圖譜合一”;c)差動(dòng)共焦曲線過(guò)零點(diǎn)處精確對(duì)應(yīng)物鏡的焦點(diǎn)0，測(cè)量過(guò)程中可以實(shí)時(shí)對(duì)被測(cè)樣品進(jìn)行精確跟蹤定焦，保證被測(cè)樣品在整個(gè)測(cè)量過(guò)程中始終處于焦點(diǎn)位置，抑制環(huán)境溫度和振動(dòng)等因素對(duì)光譜測(cè)量的影響，從而提高測(cè)量精度；d)差動(dòng)共焦曲線過(guò)零點(diǎn)處對(duì)應(yīng)測(cè)量物鏡焦點(diǎn)0，此處聚焦光斑尺寸最小，探測(cè)的區(qū)域最小，線性區(qū)域BB'其他位置對(duì)應(yīng)物鏡的離焦區(qū)域，在焦前或焦后BB'區(qū)域內(nèi)的聚焦光斑尺寸隨離焦量增大而增大，利用此特點(diǎn)，通過(guò)調(diào)整樣品的z向離焦量，并根據(jù)實(shí)際測(cè)量精度需求來(lái)控制聚焦光斑的尺寸，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品探測(cè)區(qū)域大小可控。本發(fā)明的探測(cè)方法中，激發(fā)光束可以是偏振光束:線偏光、圓偏光、徑向偏振光等；還可以是由光瞳濾波技術(shù)生成的結(jié)構(gòu)光束，其與光瞳濾波技術(shù)聯(lián)用可以壓縮測(cè)量聚焦光斑尺寸，提高系統(tǒng)橫向分辨力。本發(fā)明的探測(cè)方法中，該系統(tǒng)還可以探測(cè)熒光、布里淵散射光、康普頓散射光等散射光譜本發(fā)明提供了一種激光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像裝置，包括激發(fā)光束產(chǎn)生系統(tǒng)、第一分光系統(tǒng)、物鏡、三維掃描工作臺(tái)、二向色分光系統(tǒng)、光譜探測(cè)系統(tǒng)、差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理模塊；其中，第一分光系統(tǒng)、物鏡、三維掃描工作臺(tái)沿光路依次放置在激發(fā)光束產(chǎn)生系統(tǒng)出射方向，二向色分光系統(tǒng)位于第一分光系統(tǒng)的反射方向，光譜探測(cè)系統(tǒng)位于二向色分光系統(tǒng)的透射方向，差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)位于二向色分光系統(tǒng)的反射方向，數(shù)據(jù)處理模塊與光譜探測(cè)系統(tǒng)和差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)連接，用于融合并處理光譜探測(cè)系統(tǒng)與差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)采集到的數(shù)據(jù)。本發(fā)明的裝置中，光譜探測(cè)系統(tǒng)可以是普通光譜探測(cè)系統(tǒng)，包括沿光路依次放置的第七聚光鏡、位于第七聚光鏡焦點(diǎn)位置的第二光譜儀及位于第二光譜儀后的第五探測(cè)器，用于被測(cè)樣品的表層光譜探測(cè)；還可以是共焦光譜探測(cè)系統(tǒng)，包括沿光路依次放置的第四聚光鏡、位于第四聚光鏡焦點(diǎn)位置的第四針孔、位于第四針孔后的第五聚光鏡、位于第五聚光鏡焦點(diǎn)位置的第一光譜儀及位于第一光譜儀后的第三探測(cè)器，提高系統(tǒng)信噪比和空間分辨力，以及對(duì)被測(cè)樣品的層析光譜探測(cè)。本發(fā)明的裝置中，激發(fā)光束產(chǎn)生系統(tǒng)還可以包括偏振調(diào)制器及光瞳濾波器，用于產(chǎn)生偏振光及結(jié)構(gòu)光束。本發(fā)明的裝置中，用于壓縮激發(fā)光斑的光瞳濾波器可以位于偏振調(diào)制器與第一分光系統(tǒng)之間，還可以位于第一分光系統(tǒng)與物鏡之間。本發(fā)明的裝置中，激發(fā)光束產(chǎn)生系統(tǒng)還可以放在第一分光系統(tǒng)的反射方向，二向色分光系統(tǒng)沿光路依次放在第一分光系統(tǒng)的透射方向，光譜探測(cè)系統(tǒng)位于二向色分光系統(tǒng)的透射方向，差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)位于二向色分光系統(tǒng)的反射方向，數(shù)據(jù)處理模塊連接差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)與光譜探測(cè)系統(tǒng)。本發(fā)明的裝置中，還可以包括第四分光系統(tǒng)及位于第四分光系統(tǒng)反射方向的顯微觀察系統(tǒng)，用于被測(cè)樣品粗貓；其中，第四分光系統(tǒng)可以位于激發(fā)光束產(chǎn)生系統(tǒng)與第一分光系統(tǒng)之間，還可以位于第一分光系統(tǒng)與物鏡之間。本發(fā)明的裝置中，數(shù)據(jù)處理模塊包括用于處理位置信息的差動(dòng)相減模塊和用于融合位置信息和光譜信息的數(shù)據(jù)融合模塊。有益效果本發(fā)明對(duì)比已有技術(shù)具有以下創(chuàng)新點(diǎn):I)利用差動(dòng)共焦系統(tǒng)軸向響應(yīng)曲線的過(guò)零點(diǎn)與焦點(diǎn)位置精確對(duì)應(yīng)這一特性，通過(guò)零點(diǎn)觸發(fā)來(lái)精確捕獲激發(fā)光斑焦點(diǎn)位置的光譜信息，實(shí)現(xiàn)高空間分辨的光譜探測(cè)；2)利用二向色分光裝置對(duì)系統(tǒng)收集到的瑞利光和載有被測(cè)樣品信息的拉曼散射光進(jìn)行分光，瑞利光進(jìn)入差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)，拉曼散射光進(jìn)入拉曼光譜探測(cè)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)光能的完全利用，使微弱的拉曼散射光能夠無(wú)損的進(jìn)入拉曼光譜探測(cè)系統(tǒng)，提高系統(tǒng)光譜探測(cè)靈敏度，實(shí)現(xiàn)樣品幾何位置信息和光譜信息的高空間分辨“圖譜合一”;3)利用差動(dòng)共焦技術(shù)對(duì)測(cè)量聚焦光斑進(jìn)行高精度定位，并對(duì)焦點(diǎn)位置進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤，消除溫度和振動(dòng)等環(huán)境影響，實(shí)現(xiàn)調(diào)控并使拉曼光譜系統(tǒng)探測(cè)可以始終精確對(duì)應(yīng)最小激發(fā)聚焦光斑區(qū)域的樣品光譜，大幅提高現(xiàn)有共焦拉曼光譜顯微鏡的微區(qū)光譜探測(cè)能力和幾何位置探測(cè)能力，即實(shí)現(xiàn)高空間分辨；4)利用差動(dòng)共焦響應(yīng)曲線線性區(qū)域?qū)?yīng)不同聚焦光斑尺寸的特性，對(duì)聚焦光斑位置進(jìn)行精確調(diào)控，進(jìn)而控制測(cè)量聚焦光斑的尺寸，便于對(duì)不同測(cè)試需求的樣品進(jìn)行測(cè)試與分析，即實(shí)現(xiàn)測(cè)量聚焦光斑尺寸可調(diào)；5)將差動(dòng)共焦顯微系統(tǒng)與拉曼光譜成像系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)和功能上相融合，既可實(shí)現(xiàn)樣品微區(qū)幾何參數(shù)的層析成像，又可實(shí)現(xiàn)樣品微區(qū)的光譜探測(cè)，即同時(shí)實(shí)現(xiàn)微尺度層析成像、圖譜層析成像和光譜測(cè)試三種成像模式,并顯著改善成像測(cè)試系統(tǒng)的抗干擾能力、線性和離焦特性。本發(fā)明對(duì)比已有技術(shù)具有以下顯著優(yōu)點(diǎn):I)融合差動(dòng)共焦技術(shù)和光譜探測(cè)技術(shù)，利用差動(dòng)共焦系統(tǒng)對(duì)焦點(diǎn)的精確定位，大幅提高光譜探測(cè)的空間分辨力；
2)利用差動(dòng)共焦響應(yīng)曲線的離焦區(qū)域，調(diào)控聚焦光斑尺寸，可滿足不同測(cè)試需求，使系統(tǒng)具有通用性；3)差動(dòng)共焦焦點(diǎn)觸發(fā)探測(cè)技術(shù)，可顯著抑制系統(tǒng)的非線性、樣品反射率和表面傾斜等對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響，以利于實(shí)現(xiàn)微細(xì)結(jié)構(gòu)高分辨力、高抗干擾能力、高精度和高層析能力的測(cè)量等。


圖1為差動(dòng)共焦與共焦顯微軸向響應(yīng)示意圖；圖2為共焦拉曼光譜成像方法示意圖；圖3為激光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像方法示意圖；圖4為激光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像裝置示意圖；圖5為具有非共焦光譜探測(cè)系統(tǒng)的激光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像裝置示意圖；圖6為具有顯微功能的激光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像裝置示意圖；圖7為具有顯微功能的反射式激光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像裝置示意圖；圖8為激光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像方法與裝置實(shí)施例圖；其中，1-激發(fā)光束產(chǎn)生系統(tǒng)，2-激光器，3-第一聚光鏡、4-第一針孔、5-第八聚光鏡、6-偏振調(diào)制器，7-光瞳濾波器,8-第一分光系統(tǒng)、9-1/4波片，10-物鏡，11-被測(cè)樣品，12-三維掃描工作臺(tái)，13- 二向色分光系統(tǒng)，14-差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)，15-第二分光系統(tǒng)、16-第二聚光鏡、17-第二針孔、18-第一探測(cè)器、19-第三聚光鏡、20-第三針孔、21-第二探測(cè)器、22-光譜探測(cè)系統(tǒng)、23-第四聚光鏡、4-第四針孔,25-第五聚光鏡、26-第一光譜儀、27-入射狹縫，28-平面反射鏡，29-第一凹面反射聚光鏡、30-光譜光柵、31-第二凹面反射聚光鏡，32-出射狹縫、33-第三探測(cè)器、34-數(shù)據(jù)處理模塊、35-差動(dòng)相減模塊、36-數(shù)據(jù)融合模塊、37-顯微觀察系統(tǒng)、38-柯勒照明系統(tǒng),39-第三分光系統(tǒng)、40-第四分光系統(tǒng)、41-第六聚光鏡、42-第四探測(cè)器、43-差動(dòng)共焦曲線、44-共焦拉曼曲線、45-共焦曲線、46-第七聚光鏡、47-第二光譜儀、48-第五探測(cè)器。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。本發(fā)明的基本思想是利用差動(dòng)共焦探測(cè)和光譜探測(cè)相結(jié)合實(shí)現(xiàn)“圖譜合一”的光譜探測(cè)。如圖3所示，激發(fā)光束產(chǎn)生系統(tǒng)I產(chǎn)生激發(fā)光，經(jīng)過(guò)第一分光系統(tǒng)8、物鏡10后，聚焦在被測(cè)樣品11上，并激發(fā)出瑞利光和載有被測(cè)樣品光譜特性的拉曼散射光，激發(fā)出的拉曼散射光和瑞利光被系統(tǒng)收集回光路中，經(jīng)過(guò)物鏡10后被第一分光系統(tǒng)8反射至二向色分光系統(tǒng)13,經(jīng)二向色分光系統(tǒng)13分光后,拉曼散射光和瑞利光相互分離,瑞利光被反射進(jìn)入差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)14進(jìn)行位置探測(cè)，拉曼散射光透射進(jìn)入光譜探測(cè)系統(tǒng)22進(jìn)行光譜探測(cè)。如圖4所示，本裝置包括沿光路依次放置的激發(fā)光束產(chǎn)生系統(tǒng)1、第一分光系統(tǒng)8、物鏡10、被測(cè)樣品11、三維掃描工作臺(tái)12，位于第一分光系統(tǒng)8反射方向的二向色分光系統(tǒng)13，位于二向色分光系統(tǒng)13透射方向的光譜探測(cè)系統(tǒng)22及反射方向的差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)14，還包括連接光譜探測(cè)系統(tǒng)22和差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)14的數(shù)據(jù)處理模塊34。把圖4中光譜探測(cè)系統(tǒng)22替換為包括第七聚光鏡46、第二光譜儀47及第五探測(cè)器48的普通光譜系統(tǒng)，即構(gòu)成圖5。在圖4中第一分光系統(tǒng)8與物鏡10之間添加第四分光系統(tǒng)40，第四分光系統(tǒng)40反射方向添加顯微觀察系統(tǒng)37，即構(gòu)成圖6。把圖6中的激發(fā)光束產(chǎn)生系統(tǒng)I放置于第一分光系統(tǒng)8的反射方向，二向色分光系統(tǒng)13放置于第一分光系統(tǒng)8的透射方向，即構(gòu)成圖7。實(shí)施例本實(shí)施例中，偏振調(diào)制器6為徑向偏振光產(chǎn)生器,第一分光系統(tǒng)8為保偏分光棱鏡，第二分光系統(tǒng)15為保偏分光棱鏡，第三分光系統(tǒng)39為寬帶分光棱鏡,第四分光系統(tǒng)40為保偏分光棱鏡，二向色分光系統(tǒng)13為Notch filter，光譜探測(cè)系統(tǒng)22為拉曼光譜探測(cè)系統(tǒng)。如圖8所示，激光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像方法，其測(cè)試步驟如下:首先，柯勒照明系統(tǒng)38產(chǎn)生均勻白光，白光透過(guò)寬帶分光棱鏡39后,被保偏分光棱鏡40反射，經(jīng)過(guò)物鏡10聚焦在被測(cè)樣品11上，白光被反射回原光路，經(jīng)物鏡10后被保偏分光棱鏡40、寬帶分光棱鏡39分別反射后，經(jīng)過(guò)第六聚光鏡41后進(jìn)入第四探測(cè)器42，通過(guò)觀察第四探測(cè)器42中的圖像對(duì)測(cè)樣品11進(jìn)行粗瞄，以確定被測(cè)樣品11需要觀測(cè)的區(qū)域?qū)Ρ粶y(cè)樣品11進(jìn)行粗定位。然后，激光器2發(fā)出的光束經(jīng)第一聚光鏡3、第一針孔4、第八聚光鏡后5準(zhǔn)直擴(kuò)束為平行光，光束經(jīng)過(guò)徑向偏振光產(chǎn)生器6后成為徑向偏振光,徑向偏振光經(jīng)光瞳濾波器7后光束被調(diào)制，透過(guò)保偏分光棱鏡8后，通過(guò)物鏡10形成壓縮光斑聚焦在被測(cè)樣品11上，并激發(fā)出瑞利光和載有被測(cè)樣品11光譜特性的拉曼散射光，被測(cè)樣品11可通過(guò)增強(qiáng)拉曼光譜納米粒子等拉曼增強(qiáng)技術(shù)進(jìn)行處理，以提高拉曼散射光的強(qiáng)度。移動(dòng)被測(cè)樣品11，使瑞利光及對(duì)應(yīng)被測(cè)樣品11不同區(qū)域的拉曼散射光被系統(tǒng)收集回原光路，經(jīng)過(guò)物鏡10并透射過(guò)保偏分光棱鏡40后，被保偏分光棱鏡8反射進(jìn)入探測(cè)部分，其中，拉曼散射光透射過(guò)Notch filterl3進(jìn)入拉曼光譜探測(cè)系統(tǒng)22，拉曼光譜探測(cè)系統(tǒng)22為共焦拉曼光譜探測(cè)系統(tǒng)，拉曼散射光被第四聚光鏡23會(huì)聚到第四針孔24，經(jīng)過(guò)第五聚光鏡25會(huì)聚進(jìn)入第一光譜儀26，拉曼散射光經(jīng)入射狹縫27，平面反射鏡28和第一凹面反射聚光鏡29反射后到達(dá)光譜光柵30，光束經(jīng)過(guò)光譜光柵30衍射后，被第二凹面反射聚光鏡31反射聚焦到出射狹縫32上，最后入射到第三探測(cè)器33。由于光柵的衍射作用，拉曼光譜中不同波長(zhǎng)的光相互分離，從出射狹縫32出來(lái)的光線為單色光，當(dāng)光譜光柵30轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，從出射狹縫32出射的光波長(zhǎng)不同，通過(guò)監(jiān)測(cè)第三探測(cè)器33的響應(yīng)值和光柵旋轉(zhuǎn)的角度即可得到被測(cè)樣品11的拉曼光譜；瑞利光被Notch filterl3反射進(jìn)入差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)14,經(jīng)保偏分光棱鏡15透射的瑞利光被分為兩束,經(jīng)保偏分光棱鏡15反射的瑞利光被第二聚光鏡16聚焦，進(jìn)入距第二聚光鏡16焦點(diǎn)前距離為M位置的第二針孔17后被第一探測(cè)器18接收；經(jīng)保偏分光棱鏡15透射的瑞利光被第三聚光鏡19聚焦，進(jìn)入距第三聚光鏡19焦點(diǎn)后距離為M的第三針孔20，繼而被第三針孔20后的第二探測(cè)器21接收。測(cè)量過(guò)程中，對(duì)被測(cè)樣品11進(jìn)行軸向和橫向掃描時(shí)，差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)14中兩個(gè)第二探測(cè)器21和第一探測(cè)器18，分別測(cè)得反應(yīng)被測(cè)樣品11凹凸變化的強(qiáng)度響應(yīng)為V，U，+Um)和I2 ( V , U, -Um),將所得強(qiáng)度響應(yīng)I1 ( V , U, +Um)和I2 ( V , U, -Um)傳送到差動(dòng)相減模塊35進(jìn)行差動(dòng)相減處理，獲得差動(dòng)共焦強(qiáng)度響應(yīng)I ( V，u，uM):I ( V , u, uM) = I1 ( V , u, +uM) -12 ( V，u, _uM)(I)從而實(shí)現(xiàn)被測(cè)樣品11幾何位置的顯微層析成像，式(I)中，V為橫向歸一化光學(xué)坐標(biāo)，U為軸向歸一化光學(xué)坐標(biāo)，Um為針孔的離焦量；拉曼光譜探測(cè)系統(tǒng)22中第三探測(cè)器33探測(cè)到的載有被測(cè)樣品11光譜信息的拉曼散射光光譜信號(hào)為I ( λ ) ( λ為波長(zhǎng))。將I ( λ )、I ( V，u，uM)傳送到數(shù)據(jù)融合模塊36進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，從而獲得包含被測(cè)樣品11位置信息I ( V，u，uM)和光譜信息I(A)的四維測(cè)量信息I ( V，U，λ )。對(duì)被測(cè)樣品11沿X、y向掃描，物鏡10沿z向掃描，重復(fù)上述步驟，測(cè)得對(duì)應(yīng)物鏡焦點(diǎn)位置附近的一組i個(gè)包含位置信息I ( V，U，uM)和光譜信息I ( λ )的序列測(cè)量信息(Ii(A), Ii(Vju)I ；利用可分辨區(qū)域δ i對(duì)應(yīng)的位置信息Ii ( V，u，uM)，找出對(duì)應(yīng)δ i區(qū)域的光譜信息Ii(X)值，再依據(jù)V與橫向位置坐標(biāo)(x，y)的關(guān)系以及u與軸向位置坐標(biāo)z的關(guān)系，重構(gòu)反映被測(cè)物微區(qū)S i三維尺度和光譜特性的信息Ii (xi； yi； Zi, Ai)；對(duì)應(yīng)最小可分辨區(qū)域δ min的三維尺度和光譜特性可由式(2)確定:
權(quán)利要求
1.光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像方法，其特征在于: a)通過(guò)激發(fā)光束產(chǎn)生系統(tǒng)(I)產(chǎn)生激發(fā)光，經(jīng)過(guò)第一分光系統(tǒng)(8)、物鏡(10)后，聚焦在被測(cè)樣品(11)上，并激發(fā)出瑞利光和載有被測(cè)樣品(11)光譜特性的拉曼散射光，激發(fā)出的拉曼散射光和瑞利光被系統(tǒng)收集回光路中，經(jīng)過(guò)物鏡(10)后被第一分光系統(tǒng)(8)反射至二向色分光系統(tǒng)(13),經(jīng)二向色分光系統(tǒng)(13)分光后,拉曼散射光和瑞利光相互分離,瑞利光被反射進(jìn)入差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)(14)，拉曼散射光透射進(jìn)入光譜探測(cè)系統(tǒng)(22)，利用差動(dòng)共焦曲線(43)過(guò)零點(diǎn)與焦點(diǎn)位置精確對(duì)應(yīng)這一特性，通過(guò)零點(diǎn)觸發(fā)來(lái)精確捕獲激發(fā)光斑焦點(diǎn)位置的光譜信息，實(shí)現(xiàn)高空間分辨的光譜探測(cè)； b)只對(duì)接收到的瑞利光信號(hào)進(jìn)行差動(dòng)相減處理時(shí)，系統(tǒng)可以進(jìn)行高空間分辨的三維尺度層析成像；只對(duì)接收到的拉曼散射光的光譜信號(hào)進(jìn)行處理時(shí)，系統(tǒng)可以進(jìn)行光譜探測(cè)；同時(shí)對(duì)接收到的瑞利光和拉曼散射光的信號(hào)進(jìn)行處理時(shí)，系統(tǒng)可以進(jìn)行高空間分辨的微區(qū)圖譜層析成像，即被測(cè)樣品幾何位置信息和光譜信息的高空間分辨的“圖譜合一”； c)差動(dòng)共焦曲線(43)過(guò)零點(diǎn)處精確對(duì)應(yīng)物鏡(10)的焦點(diǎn)O，測(cè)量過(guò)程中可以實(shí)時(shí)對(duì)被測(cè)樣品(11)進(jìn)行精確跟蹤定焦，保證被測(cè)樣品(11)在整個(gè)測(cè)量過(guò)程中始終處于焦點(diǎn)位置，抑制環(huán)境溫度和振動(dòng)等因素對(duì)光譜測(cè)量的影響，從而提高測(cè)量精度； d)差動(dòng)共焦曲線(43)過(guò)零點(diǎn)處對(duì)應(yīng)測(cè)量物鏡(10)焦點(diǎn)O，此處聚焦光斑尺寸最小，探測(cè)的區(qū)域最小，線性區(qū)域BB’其他位置對(duì)應(yīng)物鏡(10)的離焦區(qū)域，在焦前或焦后BB’區(qū)域內(nèi)的聚焦光斑尺寸隨離焦量增大而增大，利用此特點(diǎn)，通過(guò)調(diào)整樣品的z向離焦量，并根據(jù)實(shí)際測(cè)量精度需求來(lái)控制聚焦光斑的尺寸，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品探測(cè)區(qū)域大小可控。
2.據(jù)權(quán)利I所述的激光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像方法，其特征在于:激發(fā)光束是偏振光束:線偏光、圓偏光、徑向偏振光；或是由光瞳濾波技術(shù)生成的結(jié)構(gòu)光束，其與光瞳濾波技術(shù)聯(lián)用可以壓縮測(cè)量聚焦光斑尺寸，提高系統(tǒng)橫向分辨力。
3.據(jù)權(quán)利I所述的激光 差動(dòng)共焦圖譜顯微成像方法，其特征在于:該系統(tǒng)還可以探測(cè)熒光、布里淵散射光、康普頓散射光等散射光譜。
4.光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像裝置，其特征在于:包括激發(fā)光束產(chǎn)生系統(tǒng)(I)、第一分光系統(tǒng)(8)、物鏡(10)、三維掃描工作臺(tái)(12)、二向色分光系統(tǒng)(13)、光譜探測(cè)系統(tǒng)(22)、差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)(14)及數(shù)據(jù)處理模塊(34);其中，第一分光系統(tǒng)(8)、物鏡(10)、三維掃描工作臺(tái)(12)沿光路依次放置在激發(fā)光束產(chǎn)生系統(tǒng)(I)出射方向，二向色分光系統(tǒng)(13)位于第一分光系統(tǒng)(8)的反射方向，光譜探測(cè)系統(tǒng)(22)位于二向色分光系統(tǒng)(13)的透射方向，差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)(14)位于二向色分光系統(tǒng)(13)的反射方向，數(shù)據(jù)處理模塊(34)與光譜探測(cè)系統(tǒng)(22)和差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)(14)連接，用于融合并處理光譜探測(cè)系統(tǒng)(22)與差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)(14)采集到的數(shù)據(jù)。
5.據(jù)權(quán)利4所述的激光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像裝置，其特征在于:光譜探測(cè)系統(tǒng)(22)是普通光譜探測(cè)系統(tǒng)，包括沿光路依次放置的第七聚光鏡(46)、位于第七聚光鏡(46)焦點(diǎn)位置的第二光譜儀(47)及位于第二光譜儀(47)后的第五探測(cè)器(48)，用于被測(cè)樣品的表層光譜探測(cè)；或是共焦光譜探測(cè)系統(tǒng)，包括沿光路依次放置的第四聚光鏡(23)、位于第四聚光鏡(23)焦點(diǎn)位置的第四針孔(24)、位于第四針孔(24)后的第五聚光鏡(25)、位于第五聚光鏡(25)焦點(diǎn)位置的第一光譜儀(26)及位于第一光譜儀(26)后的第三探測(cè)器(33)，提高系統(tǒng)信噪比和空間分辨力，以及對(duì)被測(cè)樣品的層析光譜探測(cè)。
6.據(jù)權(quán)利4所述的激光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像裝置，其特征在于:激發(fā)光束產(chǎn)生系統(tǒng)(I)還可以包括偏振調(diào)制器(6)及光瞳濾波器(7)，用于產(chǎn)生偏振光及結(jié)構(gòu)光束。
7.據(jù)權(quán)利6所述的激光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像裝置，其特征在于:用于壓縮激發(fā)光斑的光瞳濾波器(X)可以位于偏振調(diào)制器(6)與第一分光系統(tǒng)(8)之間，還可以位于第一分光系統(tǒng)⑶與物鏡(10)之間。
8.據(jù)權(quán)利4所述的激光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像裝置，其特征在于:激發(fā)光束產(chǎn)生系統(tǒng)(I)還可以放在第一分光系統(tǒng)(8)的反射方向，二向色分光系統(tǒng)(13)沿光路依次放在第一分光系統(tǒng)(8)的透射方向，光譜探測(cè)系統(tǒng)(22)位于二向色分光系統(tǒng)(13)的透射方向，差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)(14)位于二向色分光系統(tǒng)(13)的反射方向，數(shù)據(jù)處理模塊(34)連接差動(dòng)共焦探測(cè)系統(tǒng)(14)與光譜探測(cè)系統(tǒng)(22)。
9.據(jù)權(quán)利4所述的激光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像裝置，其特征在于:還可以包括第四分光系統(tǒng)(40)及位于第四分光系統(tǒng)(40)反射方向的顯微觀察系統(tǒng)(37)，用于被測(cè)樣品粗貓；其中，第四分光系統(tǒng)(40)可以位于激發(fā)光束產(chǎn)生系統(tǒng)(I)與第一分光系統(tǒng)(8)之間,還可以位于第一分光系統(tǒng)(8)與物鏡(10)之間。
10.據(jù)權(quán)利4所述的激光差動(dòng)共焦圖譜顯微成像裝置，其特征在于:數(shù)據(jù)處理模塊(34)包括用于處理位置信息的差 動(dòng)相減模塊(35)和用于融合位置信息和光譜信息的數(shù)據(jù)融合模塊(36)。
全文摘要
本發(fā)明屬于光學(xué)顯微成像及光譜測(cè)量技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高空間分辨激光差動(dòng)共焦圖譜成像方法與裝置。本發(fā)明的核心思想是融合差動(dòng)共焦探測(cè)和光譜探測(cè)技術(shù)，并利用二向色分光系統(tǒng)(13)對(duì)瑞利光和拉曼散射光進(jìn)行無(wú)損分離，其中，拉曼散射光進(jìn)行光譜探測(cè)，瑞利光進(jìn)行幾何位置探測(cè)，利用差動(dòng)共焦曲線(43)過(guò)零點(diǎn)與焦點(diǎn)位置精確對(duì)應(yīng)這一特性，通過(guò)過(guò)零點(diǎn)觸發(fā)來(lái)精確捕獲激發(fā)光斑焦點(diǎn)位置的光譜信息，實(shí)現(xiàn)高空間分辨的光譜探測(cè)，構(gòu)成一種可實(shí)現(xiàn)樣品微區(qū)高空間分辨光譜探測(cè)的方法和裝置。本發(fā)明具有定位準(zhǔn)確，高空間分辨，光譜探測(cè)靈敏度高和測(cè)量聚焦光斑尺寸可控等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)、法庭取證等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01B11/24GK103091299SQ20131002695
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月21日
發(fā)明者趙維謙, 崔晗, 邱麗榮, 王允 申請(qǐng)人:北京理工大學(xué)