專利名稱：利用[Co(NH₃)₆]³⁺-DNA共振光散射探針定量檢測蛋白質的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種共振光散射技術檢測分析蛋白質含量的方法，屬于蛋白質檢測技術領域。
背景技術：
蛋白質是生物體內最重要的物質之一，是生命的物質基礎。蛋白質種類及其含量的測定對于生化分析和疾病診斷具有十分重要的意義。目前，傳統的蛋白質測定方法有吸光光度法(包括凱氏定氮法、雙縮脲法和考馬斯亮藍法)和熒光光度法。其中吸光光度法主要缺點是靈敏度較低，不能用于分析蛋白質濃度較低的生物樣品；熒光光度法僅限于具有熒光的體系，使其適用范圍受到限制。還有出現的一些發(fā)明方法，如歐洲專利G01N33/68A12、美國專利US2010047913等，將液相層析和質譜聯用，雖然提高了檢測的靈敏度及準確性，但是由于設備昂貴、耗時較長、操作較復雜，限制了其使用。因此尋找新的蛋白質檢測方法具有重要的意義。共振光散射(Resonance Light Scattering, RLS)分析方法是一種能在普通突光分光光度計上進行測量的光散射分析技術，在研究生物大分子識別、組裝和聚集時出現靈敏而豐富的信號，可取得與常用的熒光法同樣高的靈敏度。1993年，Pasternack等首次用共振光散射技術研究實現了卟啉類化合物在核酸上的聚集。目前這種技術被廣泛應用于核酸、蛋白質、多糖等生物大分子的定量檢測，以及用于生物大分子間、生物大分子與其他物質之間相互作用機理的研究。現有文獻的報道中，大多采用有機染料探針或金屬離子指示劑對生物大分子蛋白質和核酸展開共振光散射光譜分析，還有利用量子點共振光散射來定量檢測蛋白質等生物大分子等。但對于簡單金屬絡合物[Co (NH3)6P+-DNA-蛋白質體系的共振光散射研究及其在蛋白質分析中的應用尚未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測蛋白質的方法，能夠快速、靈敏、準確地檢測出實際樣品中的痕量蛋白質含量。根據共振光散射理論，粒子體積的增大和強靜電結合及大結合數所導致的高度的電子離域共軛，都會產生強烈的共振光散射現象。本發(fā)明中，六氨合鈷離子與DNA分子發(fā)生靜電結合，同時由于DNA與蛋白質分子相互交聯在一起，形成生物復合體。最終形成[Co(NH3)6]3+-DNA-蛋白質體系，導致蛋白質體積急劇增大，相應的共振光散射信號較之蛋白質、[Co(NH3)6]3+-蛋白質、DNA-蛋白質體系都得以強烈的增強。本發(fā)明利用上述特性和原理，在一定的蛋白質濃度范圍內，共振光散射的信號增強與蛋白質的濃度具有線性關系，從而能夠檢測出含很低濃度的蛋白質的復雜樣品。技術方案包括如下步驟:
1.依次力卩 A 0.7mL10 u g/mL 的小牛胸腺 DNA(ctDNA)溶液，1.5mL 的Britton-Robinson (BR)緩沖溶液(pH3.78) ,0.1mL 的 lmmol/L[Co (NH3)6] Cl3 溶液，每加一種試劑都將體系用旋渦混合器混合。最后在上述混合溶液中，分別加入I組蛋白質含量為0 2.0ii g/mL已知濃度且濃度不同的標準組蛋白質溶液，以及待測的未知濃度的實驗組蛋白質溶液。最后分別將各個混合溶液搖勻，再用二次蒸餾水稀釋至10mL。
2.將上述步驟I所得的各種混合溶液，于混合搖勻后放置I小時，在熒光分光光度計上進行同步掃描(Xex= X em),獲得200.0nm 700.0nm之間的RLS光譜，并在346.0nm處測定RLS強度。設定掃描的激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm，負高壓為400V。3.結合標準組蛋白質溶液的已知蛋白質濃度(C)與其增強的共振光散射強度(Al)繪制標準曲線，得到測量蛋白質的線性范圍、線性回歸方程Al = aC+b，以及線性相關系數。4.根據標準曲線的回歸方程和實驗組蛋白質溶液增強的共振光散射強度，計算實驗組蛋白質溶液濃度。本發(fā)明的有益效果是:利用[Co(NH3)6]3+-DNA-蛋白質體系產生共振光散射信號的強烈增強現象，用于定量檢測不同樣品中痕量蛋白質的含量，具有靈敏度高、準確可靠、經濟實用等特點，能夠廣泛應用于蛋白質痕量定量檢測領域，在農業(yè)質量檢測、食品營養(yǎng)標準檢測、臨床醫(yī)學、疾病診斷等領域具有應用價值。


圖1為不同蛋白質體系的共振光散射光譜2為檢測牛血清白蛋白(BSA)的標準曲線
具體實施例方式實施例1:繪制標準曲線1.DNA貯備液:準確稱量小牛胸腺DNA (ctDNA，Sigma D-1501)，直接溶于二次蒸餾水中配制成IOii g/mL的溶液，于0 4°C冰箱中保存；BSA貯備液:準確稱取牛血清白蛋白(BSA)，直接溶于二次蒸餾水中配成100 u g/mL的溶液，于0 4°C冰箱中保存；配制pHl.8 11.9的一系列Britton-Robinson(BR)緩沖溶液；以CoCl2 6H20為原料，制得[Co (NH3)6] Cl3晶體，直接溶解于二次蒸餾水中，配制成Krtiol/L的儲備液。2.分別在IOmL比色管中，依次加入0.7mL10 u g/mL的ctDNA貯備液，1.5mL的BR緩沖溶液(PH3.78),0.lmLlmmol/L 的[Co (NH3) 6] Cl3 溶液，以及分別加入 0.005mL、0.008mL、
0.01mL、0.03mL、0.05mL、0.08mL、0.10mL、0.12mL、0.15mL、0.2OmL 的 100 u g/mL BSA 忙備液作為標準組溶液。每加一種試劑都將體系用旋渦混合器混合，最后將試液用二次蒸餾水稀釋至刻度。3.將上述步驟2所得的BSA標準組溶液，于混合搖勻后放置I小時，在熒光分光光度計上進行同步掃描(入ex = X em),獲得200.0nm 700.0nm之間的RLS光譜，并在346.0nm處測定RLS強度。設定掃描的激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm，負高壓為400V。4.結合標準組蛋白質溶液的已知蛋白質濃度(C)與其增強的共振光散射強度(Al)繪制標準曲線，如圖2所示。BSA的濃度在0.05 ii g/mL 1.20 y g/mL的范圍內，與增強的RLS信號之間有良好的線性關系。線性回歸方程為At = 88.80C-1.30，線性相關系數為0.991，表明該方法具有很高的靈敏度。實施例2:多種蛋白質的響應差別1.分別在IOmL比色管中，依次加入0.7mL10 μ g/mL的ctDNA溶液，L 5mL的BR緩沖溶液(ρΗ3.78)，0.lmLlmmol/L 的[Co (NH3) 6] Cl3 溶液，以及分別加入 0.1mL 的 100 μ g/mL的牛血清白蛋白溶液、人血清白蛋白溶液、胰島素溶液、明膠溶液、雞蛋白溶液、Y -球蛋白溶液。每加一種試劑都將體系用旋渦混合器混合，最后將試液用二次蒸餾水稀釋至刻度。2.將上述步驟I所得濃度為1.0 μ g/mL的不同種類的蛋白質溶液，混合搖勻后各放置I小時，并在熒光分光光度計上分別進行同步掃描(Aex= λ em)，獲得200.0nm 700.0nm之間的RLS光譜，并 在346.0nm處測定RLS強度，如表I所示。設定掃描的激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5.0nm,負高壓為400V。3.由表I可知，各蛋白質響應信號的大小基本符合它們分子量大小的順序，也就是說該分析方法的響應信號主要取決于蛋白質體積的大小，這與共振光散射理論是相符合的。表I不同蛋白質的共振光散射響應值
權利要求
1.一種利用[Co(NH3)6]3+-DNA共振光散射探針定量檢測蛋白質的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)依次加入小牛胸腺CtDNA溶液、Britton-Robinson(BR)緩沖溶液、[Co (NH3) 6] Cl3溶液，最后分別加入I組已知濃度的標準組蛋白質溶液，和待測的未知濃度的實驗組蛋白質溶液，各個混合溶液搖勻稀釋； (2)步驟(I)所得的各混合溶液分別放置I小時后，在200.0nm 700.0nm下進行同步熒光掃描，獲得其共振光散射光譜，并在346.0nm處測定共振光散射強度； (3)結合標準組蛋白質溶液的濃度(C)與其增強的共振光散射強度(Al)繪制標準曲線，得到Al與C之間的線性回歸方程，以及該方法測量蛋白質的線性范圍； (4)根據測量蛋白質標準曲線的回歸方程和實驗組蛋白質溶液增強的共振光散射強度，計算實驗組蛋白質溶液的濃度。
2.權利要求1所述利用[Co(NH3)6]3+-DNA共振光散射探針檢測蛋白質的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，混合試劑的用量比為DNA: BR緩沖液:[Co (NH3)6] Cl3 =(7 u g ； 1.5mL: 10 4mmo 1) /1 OmT,。
3.權利要求1所述利用[Co(NH3)6]3+-DNA共振光散射探針檢測蛋白質的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，采用pH為3.78的Britton-Robinson緩沖溶液控制待測溶液的酸度。
4.權利要求1所述利用[Co(NH3)6]3+-DNA共振光散射探針檢測蛋白質的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，所加入幾種試劑的次序，以及每加入一種試劑都將體系旋渦混合均勻。
5.權利要求1所述利用[Co(NH3)6]3+-DNA共振光散射探針檢測蛋白質的方法，其特征在于，驗證了該發(fā)明方法可以應用于牛血清白蛋白、人血清白蛋白、胰島素、明膠、雞蛋白、Y-球蛋白，以及人血清樣本中總蛋白含量的檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用[Co(NH3)6]3+-DNA(脫氧核糖核酸)共振光散射(RLS)探針定量檢測蛋白質的方法。本發(fā)明利用[Co(NH3)6]3+-DNA復合物與蛋白質之間強的靜電作用，引起蛋白質的共振光散射信號的強烈增強，來檢測標準牛血清白蛋白(BSA)。在波長346.0nm處增強的共振光散射強度與BSA的濃度在0.05～1.2μg/mL范圍內有良好的線性關系。本發(fā)明應用于人血清白蛋白等多種蛋白質的共振光散射響應值差別的比較，以及實際人血清樣品中總蛋白含量的測定，均取得好的效果。方法靈敏度較高，準確可靠，檢測體系簡單，為定量檢測痕量蛋白質建立了一種實用的新方法。
文檔編號G01N21/51GK103149179SQ201310031130
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月15日 優(yōu)先權日2013年1月15日
發(fā)明者李艷坤 申請人:華北電力大學(保定)