專利名稱：一種聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti⁴⁺ 納米材料的合成方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于先進納米材料與納米技術領域，具體涉及一種用于高通量MALD1-T0FMS富集磷酸化肽聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+納米材料的合成方法及其運用。
背景技術：
蛋白質(zhì)的可逆磷酸化是一種非常重要的翻譯后修飾，它調(diào)節(jié)著如細胞信號傳導、細胞分化、細胞生長、細胞凋亡等幾乎所有的生命活動，也被形象地描述為細胞生理活動的分子開關。因此，對蛋白質(zhì)磷酸化的研究有助于全面理解蛋白質(zhì)的各項功能及其機理。現(xiàn)今，蛋白質(zhì)磷酸化的研究方法是先將蛋白質(zhì)酶解，而后利用生物質(zhì)譜對磷酸化肽段的氨基酸序列和磷酸化位點進行準確地鑒定。但磷酸化蛋白質(zhì)的含量較低，磷酸化肽段的離子化效率較差，且非磷酸化肽段的存在將嚴重抑制磷酸化肽段的質(zhì)譜信號，這些原因?qū)е吕觅|(zhì)譜直接對磷酸化肽段進行準確分析面臨很大困難。因此在質(zhì)譜分析前需對磷酸化肽段進行選擇性富集，而發(fā)展新型的富集技術成為當前蛋白組學研究的熱點。為了解決這些問題，很多材料和富集技術被用來富集磷酸化肽。其中金屬離子吸附色譜得到了廣泛應用。金屬離子吸附色譜是通過亞氨基二乙酸、磷酸基或氨三乙酸的酸螯合配位將金屬離子如Ti4+、Fe3+等固定在不同的底物如聚合物、介孔材料或納米材料上。然而傳統(tǒng)的金屬離子吸附色譜技術在樣品制備時常需要高速離心，這不僅費時不便，而且會導致低豐度磷酸化肽的損失。為了發(fā)現(xiàn)具有重要生物學意義的磷酸化蛋白和磷酸化肽，迫切需要制定出高靈敏度和高選擇性的富集方法進行磷酸化蛋白質(zhì)組學的深入分析。近來，磁性納米材料基于自身磁性已應用于生物醫(yī)學中的多個領域，而功能化磁球作為一種新型的分析技術已在蛋白質(zhì)組學研究中得到廣泛的應用，這種材料操作簡便，分離時只需外加一磁場即可。多巴胺是3，4- 二羥基-L-苯丙氨酸的類似物，它可以粘附在許多無機和有機材料包括貴金屬、金屬、金屬氧化物、云母、石英、陶瓷甚至聚合物上并自組裝聚合成聚多巴胺。這種聚多巴胺具有優(yōu)良的環(huán)境穩(wěn)定性、良好的生物相容性和特別是在水中的優(yōu)良分散性。因此，發(fā)展一種以聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+的納米材料來富集磷酸化肽是一種新的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種表面由聚多巴胺修飾的磁球并在表面固定Ti4+納米材料的合成方法及其在磷酸化蛋白質(zhì)組學的應用。本發(fā)明提供了一種表面由聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+的合成方法，具體步驟如下:
(1)將磁球分散至多巴胺水溶液中，并使其分散均勻；
(2)在持續(xù)機械攪拌下，在步驟(I)所得的產(chǎn)物中快速加入三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液；
(3)將步驟(2)所得溶液在室溫下機械攪拌反應10-16小時；
(4)將步驟(3)所得的產(chǎn)物用去離子水充分洗滌，除去產(chǎn)物表面的雜質(zhì)與多巴胺單
體；
(5)將步驟(4)中所得產(chǎn)物分散到100mmol/L的Ti (SO4) 2溶液中，室溫下機械攪拌2-3小時；
(6)將步驟(5)所得的產(chǎn)物用去離子水充分洗滌，并在真空干燥器中干燥，即得所述納米材料。本發(fā)明中，步驟(I)中磁球與多巴胺水溶液的質(zhì)量比為1:4。本發(fā)明中，步驟(2)中的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液的濃度為10 mmol/L，pH為
8.0-9.0 ο本發(fā)明在質(zhì)譜檢測中的應用，具體步驟為:將納米材料分散到200 μ L含有磷酸化肽、0.1% (體積比)三氟乙酸和50% (體積比)乙腈的離心管中，37 °C富集30min，之后用含0.1% (體積比)三氟乙酸和50% (體積比)乙腈的緩沖液充分洗滌，并磁性分離；然后用5 μ L 0.4 M氨水洗脫10 min，取0.5 μ L洗脫液點靶，進行質(zhì)譜分析。本發(fā)明中，表面由聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+納米材料對磷酸化肽段選擇性富集的應用。本發(fā)明的有益效果在于:所提供的聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+納米材料的合成方法簡單，具有良好的生物相容性、熱穩(wěn)定性、高敏感度以及在水中的“溶解”性，可選擇性富集磷酸化肽。該材料Ti4+固定方式簡單，具有優(yōu)秀的環(huán)境穩(wěn)定性和生物相容性，在水中分散性好。其合成方法簡單、成本低，在磷酸化蛋白質(zhì)組學MALDI分析中具有靈敏度聞、 目噪比聞等特點。


圖1為聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+掃描電子顯微鏡照片；
圖2為聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+透射電子顯微鏡照片；
圖3為聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+納米材料元素分析 圖4為磁球(a)和聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+納米材料(b)在水中分散性的照片說明；` 圖5為聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+納米材料XRD 圖6為聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+納米材料富集β -casein中的磷酸化肽的質(zhì)譜 圖7為聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+納米材料富集混合蛋白(非磷酸化蛋白BSA:磷酸化蛋白β-casein = 500:1)中的磷酸化肽的質(zhì)譜 圖8為聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+納米材料富集磷酸化肽段檢測限(2fmol)的質(zhì)譜 圖9為聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+納米材料富集人血清中磷酸化肽段(*代表磷酸化肽)。其中，*代表磷酸化肽。
具體實施例方式下面的實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是限制本發(fā)明的范圍。實施例1
聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+的納米材料的合成:
(1)將10mg磁球分散至濃度為lmg/mL的40 mL多巴胺水溶液中，并使其分散均勻；
(2)在持續(xù)機械攪拌的條件下，在步驟(I)所得的產(chǎn)物中快速加入10mL濃度為10mmol/L (pH為8.5)的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液；
(3)將步驟(2)所得溶液在室溫下機械攪拌反應10-16小時；
(4)將步驟(3)所得的產(chǎn)物用去離子水洗滌三次，除去產(chǎn)物表面的雜質(zhì)與多巴胺單
體；
(5)將步驟(4)中所得產(chǎn)物分散到100mmol/L的Ti (SO4) 2溶液中，室溫下機械攪拌
2-3小時；
(6)將步驟(5)所得的產(chǎn)物用去離子水洗滌三次，并在真空干燥器中干燥，即得所
需廣品。所得的聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+的納米材料的掃描電子顯微鏡照片(20 KV，飛利浦XL30電子顯微鏡，荷蘭)如圖1所示，透射電子顯微鏡照片(200KV，日本株式會社2011顯微鏡，日本)如圖2所示，元素分析圖如圖3所示，XRD圖(200KV，日本株式會社2011顯微鏡，日本)如圖5所示。磁球(左)和聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+的納米材料(右)在水中分散性的照片說明如圖4所示(左為磁球，右為聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+的納米材料)。從圖4可以看出，本發(fā)明合成的聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+納米材料在水中的“溶解性”和分散性好。實施例2
聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+的納米材料在富集β-casein中的磷酸化肽的應用:
(I)試樣的準備:β -casein 在 25mmol/L NH4HCO3 溶液中 37 °C酶解 16 h。(2)富集:10 uL, 2 mg/mL納米材料分散到200 μ L含有步驟(I)的磷酸化肽的0.1% (體積比)三氟乙酸和50% (體積比)乙腈離心管中，37°C富集30 min ;用0.1%(體積比)三氟乙酸和50% (體積比)乙腈的緩沖液洗滌并磁性分離3次；5 μ L 0.4 M氨水洗脫10 min。(3)質(zhì)譜分析:取0.5 UL步驟(2)所得的洗脫液點靶，進行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜圖如圖6所示，圖8是聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+納米材料富集β -casein中的磷酸化肽段檢測限(2 fmol)。實施例3
聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+的納米材料在富集混合蛋白中的磷酸化肽的應
用
(I)試樣的準備:牛血清白蛋白(BSA)先用二硫蘇糖醇和碘乙酰胺還原烷基化，然后在37 °C酶解16 h。β -casein在25mM NH4HCO3溶液中37°C酶解16 h。將牛血清白蛋白(BSA)和β-casein以摩爾比500:1加到含有0.1% (體積比)三氟乙酸和50% (體積比)
乙腈離心管中。
(2)富集:10 yL, 2 mg/mL實施例1所得的納米材料分散到200 μ L含有步驟(I)的磷酸化肽的0.1% (體積比)三氟乙酸和50% (體積比)乙腈離心管中，37°C富集30min ;用0.1% (體積比)三氟乙酸和50% (體積比)乙腈的緩沖液洗滌并磁性分離3次；5 μ L 0.4 M 氨水洗脫 10 min。(3)質(zhì)譜分析:取0.5 UL步驟(2)所得的洗脫液點靶，進行質(zhì)譜分析，圖7是聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+納米材料富集混合蛋白(非磷酸蛋白BSA:磷酸化蛋白β-casein = 500:1)中的磷酸化肽的質(zhì)譜圖。實施例4
聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+的納米材料在富集人血清中的磷酸化肽的應用
(I)試樣的準備:人血清用去離子水稀釋10倍。(2)富集:10 uL, 2 mg/mL納米材料分散到200 μ L含有步驟(I)的磷酸化肽的0.1% (體積比)三氟乙酸和50% (體積比)乙腈離心管中，37°C富集30min ;用0.1%(體積比)三氟乙酸和50% (體積比)乙腈的緩沖液洗滌并磁性分離3次；5 μ L 0.4 M氨水洗脫10 min。(3)質(zhì)譜分析:取0.5 UL步驟(2)所得的洗脫液點靶，進行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜圖如圖9所示。
權利要求
1.一種表面由聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+的合成方法，其特征在于具體步驟如下: (1)將磁球分散至多巴胺水溶液中，并使其分散均勻； (2)在持續(xù)機械攪拌下，在步驟(I)所得的產(chǎn)物中快速加入三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液； (3)將步驟(2)所得溶液在室溫下機械攪拌反應10-16小時； (4)將步驟(3)所得的產(chǎn)物用去離子水充分洗滌，除去產(chǎn)物表面的雜質(zhì)與多巴胺單體； (5)將步驟(4)中所得產(chǎn)物分散到100mmol/L的Ti (SO4) 2溶液中，室溫下機械攪拌2-3小時； (6)將步驟(5)所得的產(chǎn)物用去離子水充分洗滌，并在真空干燥器中干燥，即得所述納米材料。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種表面由聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+納米材料的合成方法，其特征在于步驟(I)中所述磁球與多巴胺水溶液的質(zhì)量比為1:4。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種表面由聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+納米材料的合成方法，其特征在于步驟(2)中所述的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液的濃度為10 mmol/L, pH 為 8.0-9.0。
4.一種如權利要求1所述合成方法得到的表面由聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+納米材料在質(zhì)譜檢測中的應用，其特征在于具體步驟為:將納米材料分散到200 μ L含有磷酸化肽、0.1%體積比三氟乙酸和50%體積比乙腈的離心管中，37 ° C富集30 min，之后用含0.1%體積比三氟乙酸和50%體積比乙腈的緩沖液充分洗滌，并磁性分離；然后用5μ L 0.4 M氨水洗脫10 min，取0.5 μ L洗脫液點靶，進行質(zhì)譜分析。
5.根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于所述表面由聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+納米材料對磷酸化肽段選擇性富集的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+的磁性納米材料的合成和應用。將磁球分散到含多巴胺的水溶液中，在機械攪拌的條件下將三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液快速加入磁球分散均勻的多巴胺水溶液中，在室溫下機械攪拌10-16小時，水洗并磁性分離得到在水中分散性好的表面由聚多巴胺修飾的磁球納米材料。然后將該材料分散到100mmol/L的Ti(SO4)2溶液中，室溫下機械攪拌2-3小時，水洗并磁性分離得到聚多巴胺修飾磁球并在表面固定Ti4+的磁性納米材料。本發(fā)明固定Ti4+方法非常簡單；表面修飾一層聚多巴胺，使該材料具有優(yōu)秀的環(huán)境穩(wěn)定性和生物相容性，并且在水中分散性好；該材料可以固定大量的Ti4+；以磁球為核心，使得該材料應用起來操作簡單，可進行磁性分離；合成方法簡單、成本低，可在高通量MALDI-TOFMS富集磷酸化肽。
文檔編號G01N27/62GK103151135SQ20131004435
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月5日 優(yōu)先權日2013年2月5日
發(fā)明者鄧春暉, 閆迎華, 卜靜, 王先穎, 王夢依, 孫念榮, 熊婭 申請人:復旦大學