專利名稱：一種煙草中2,4-d殘留量的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)藥殘留檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及煙草中2，4-D殘留量的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
2，4_D是第一類投入商業(yè)生產(chǎn)的選擇性除草劑，廣泛施用于禾谷類作物田、針葉樹(shù)林和牧草場(chǎng)等。2，4-D都為低毒除草劑，通過(guò)植物葉面、莖桿和根系吸收傳導(dǎo)，阻礙植物激素的正常傳導(dǎo)，從而使其死亡。但在使用過(guò)程中，結(jié)果表明此類物質(zhì)可以引起人類軟組織惡性腫瘤，對(duì)動(dòng)物體表現(xiàn)出胎盤(pán)毒性。C0RESTA的農(nóng)用化學(xué)品咨詢委員會(huì)(ACAC)在2008年制定的118種農(nóng)用化學(xué)品指導(dǎo)性殘留限量表中將2，4-D的限量定為0.20mg/kg。對(duì)于水、土壤、蔬果以及紡織品中2，4_D殘留的檢測(cè)已有相關(guān)報(bào)道，而對(duì)于煙草中有機(jī)氯除草劑農(nóng)藥殘留的檢測(cè)報(bào)道較少。Hjikkinen.V.等利用在線的液相色譜-氣相色譜聯(lián)用法測(cè)定了煙草中的2，4-D，酯化后的煙草樣品進(jìn)入液相色譜分離，選取合適的保留時(shí)間段切入氣相色譜再次分離，然后通過(guò)電子捕獲檢測(cè)器檢測(cè)。劉惠民等研究開(kāi)發(fā)了非水相毛細(xì)管電泳法同時(shí)測(cè)定煙草中的麥草畏、2，4-D和2，4，5-T殘留，三種化合物的檢出限范圍為
0.6 μ g/mL，煙草樣品經(jīng)乙酸乙酯超聲萃取，凝膠滲透色譜凈化后，進(jìn)入毛細(xì)管電泳儀檢測(cè)分析。宋娟梅等改進(jìn)報(bào)道的毛細(xì)管電泳法，采用正交法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化毛細(xì)管電泳法，并將優(yōu)化好的方法應(yīng)用于煙草中2，4-0、2，4，5-1'和麥草畏的測(cè)定。煙草行業(yè)也于2004年制定了相應(yīng)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，其中2麥草畏、2，4-D和2，4，5-T選取鹽酸水溶液萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，三甲基氫氧化锍衍生化，GC-MS分析，其前處理復(fù)雜費(fèi)時(shí)，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，不利于高通量樣品的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。非水毛細(xì)管電泳法的前處理過(guò)程復(fù)雜，需要萃取與旋蒸濃縮，且檢出限較高，在檢測(cè)低含量的2，4-D殘留是存在較大的限制。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)在農(nóng)殘檢測(cè)的靈敏度以及選擇性方面都明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法，在分析速度方面優(yōu)于普通的HPLC方法，而目前未見(jiàn)該檢測(cè)方法應(yīng)用檢測(cè)煙草中的2，4-D殘留量。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于此，本發(fā)明目的在于提供一種前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短，利于高通量樣品的快速準(zhǔn)確的2，4-D殘留量的測(cè)定方法。為解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是，提供—種測(cè)定煙草中2，4_D殘留量的方法，該方法包括以下步驟:I)提取煙草中的目標(biāo)物稱取烘干磨好的煙葉樣品，加入純水浸潤(rùn)，依次加入氘代內(nèi)標(biāo)，乙腈和甲酸，渦漩混合振蕩。放入冰箱冷凍后取出，依次加入無(wú)水硫酸鎂，氯化鈉，檸檬酸鈉和檸檬酸二氫納，潤(rùn)旋振蕩后尚心；2) N-丙基乙二胺純化移取上清液于新的離心管中，加入無(wú)水硫酸鎂及PSA吸附劑，于漩渦振蕩混合，然后高速離心；吸取上清液經(jīng)有機(jī)相濾膜過(guò)濾，移取濾液，并用乙腈和超純水稀釋后待測(cè)；3)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制用乙腈配置2，4-D標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于棕色玻璃瓶中，-20°C保存。取一定量的各化合物儲(chǔ)備液進(jìn)行混合，用乙腈稀釋定容，制得混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(10g/mL)；用乙腈準(zhǔn)確配置2，4-D_d3氘帶內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于不透明玻璃瓶中，_20°C保存。取一定量的各內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液進(jìn)行混合，用乙腈稀釋定容，制得混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(IOg/mL)。所有的儲(chǔ)備液于冰箱_20°C，使用前將其恢復(fù)到室溫；用國(guó)際煙草科學(xué)研究合作中心(C0RESTA)空白煙葉的萃取基質(zhì)配制不同濃度的2，4-D、2，4-D和2，4，5-T標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；4)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定:吸取空白煙葉溶液和配制好的不同濃度的2，4-D標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算出樣品待測(cè)液中2，
4-D殘留量。優(yōu)選地,所述煙葉的重量為2g。優(yōu)選地，步驟I)中所述冷凍時(shí)間為lOmin，冷凍溫度為-18至_15°C。優(yōu)選地，步驟I)中提取過(guò)程依次加入的超純水，氘代內(nèi)標(biāo)(10g/mL)，乙腈和甲酸(49-51%)的體積分別為10mL，20L，10mL和200L。速率渦旋振蕩(2000rpm) lmin。離心管在-10°C條件下保持lOmin。依次加入的無(wú)水硫酸鎂，氯化鈉，檸檬酸鈉和檸檬酸二氫鈉的質(zhì)量分別為4g, lg, Ig和0.5g。然后鏇潤(rùn)混合振蕩的速率為2000rpm,振蕩時(shí)間為2min,離心(4000rpm)時(shí)間為 IOmin。優(yōu)選地，步驟2)中，加入無(wú)水硫酸鎂及PSA吸附劑的質(zhì)量為150mg和25mg。優(yōu)選地，步驟2)中移取濾液體積為200L,加入乙腈和超純水的體積為IOOL和700L。優(yōu)選地，步驟4)中選取70%甲酸水(體積分?jǐn)?shù)0.05%)和30%乙腈初始流動(dòng)相體系，分析時(shí)間為4min,進(jìn)樣量為10 μ L。優(yōu)選地，步驟4)中梯度洗脫條件為梯度洗脫條件:0 2min，70%A 10%A ；2
3.5min, 10%A 10%A ；3.5 3.51min, 10%A 70%A ；3.51 4.0Omin, 70%A 70%A ;流動(dòng)相流速為0.7mL/min。優(yōu)選地，步驟4)串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器的條件:ESI_，噴霧電壓(IS):2.6kV，霧化氣流量:800L/Hr ;錐孔氣(cone)流量50L/Hr，離子化溫度350°C ;碰撞氣流量為0.15ml/min ；碰撞氣為氬氣，其余氣體為氮?dú)?；駐留時(shí)間為30msec，負(fù)離子MRM模式采集。本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有技術(shù)樣品處理方法的不足，針對(duì)煙草樣本優(yōu)化了前處理?xiàng)l件，并對(duì)LC-MS/MS的相關(guān)檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，主要優(yōu)化了離子源條件，色譜柱以及流動(dòng)相體系。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明方法具有如下優(yōu)良效果:選取了基質(zhì)分散固相萃取方式來(lái)處理樣品，簡(jiǎn)化了前處理過(guò)程。在乙腈萃取過(guò)程中加入乙酸，有助于提高2，4_D這類苯氧羧酸類化合物的萃取效率。在加入硫酸鎂和氯化鈉之前，放入冰箱冷凍一段時(shí)間，可以防止其加入后過(guò)熱結(jié)塊。與傳統(tǒng)的氣相色譜比較，采用基質(zhì)分散固相萃取法來(lái)檢測(cè)2，4-D。簡(jiǎn)化了前處理過(guò)程，提高了分析靈敏度。與HPLC方法相比，由于選取了超高效液相色譜柱RP18(50mmX2.lmm, 1.7um)，使得柱子的分離度明顯提高，分析時(shí)間顯著縮短。串聯(lián)質(zhì)譜的使用使得方法的選擇性和靈敏度提高，更有利于低含量的除草劑殘留的測(cè)定。選取了氘代2，4_D對(duì)2，4_D進(jìn)行定量，有效消除基質(zhì)干擾和前處理過(guò)程中引起的誤差，使得方法的準(zhǔn)確性更聞。選取了兩個(gè)離子對(duì)，定量離子對(duì)定量，定性離子對(duì)確認(rèn)，可以提高方法的準(zhǔn)確度。本方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度及重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。


圖1是2，4_D的子離子質(zhì)譜圖。圖2是2，4-D_d3的子離子質(zhì)譜圖。圖3是加標(biāo)樣品的選擇離子流色譜圖(50ng/mL，定量離子對(duì))。圖4是加標(biāo)樣品的選擇離子流色譜圖(50ng/mL，定性離子對(duì))。圖5是2，4-D_d3的選擇離子流色譜圖(20ng/mL)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。參見(jiàn)圖1至圖5。1.儀器與試劑Waters XevoTQ超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)，配備電噴霧電離源(ESI) ;VtexMixer230VeU 振蕩器(美國(guó) Labnet 公司);Sigma3K15 離心機(jī)(德國(guó) Sigma公司)。甲酸為HPLC級(jí)(濃度為49-51%，德國(guó)Sigma公司)；乙腈，甲醇均為色譜純(美國(guó)Thermo-Fisher 公司)；2,4_D 標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)自于 LaborDr.Ehrenstorfer-Schafers (化學(xué)純度:98.5%, Augsburg,德國(guó))，內(nèi)標(biāo) 2,4-D_d3 來(lái)自于 LaborDr.Ehrenstorfer-Schafers (化學(xué)純度:99%，同位素純度:98.5%，Augsburg，德國(guó))。N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑、末尾封端碳18(C18E)吸附劑，水為超純水。2.提取煙草中的分析物準(zhǔn)確稱取2g樣品(精確至0.0lg)于50mL具蓋離心管中，加入IOmL水，振蕩直至樣品被水充分浸潤(rùn)。冷凍IOmin后移取IOmL乙腈至離心管中，加入200L甲酸，然后將離心管置于渦漩混合振蕩儀上，以2000rpm速率振蕩lmin。將離心管置于0°C條件下保持lOmin，然后向離心管中加入4g無(wú)水硫酸鎂和Ig氯化鈉，Ig檸檬酸鈉和0.5g檸檬酸二氫鈉，立即于鏇潤(rùn)混合振蕩儀上，以2000rpm速率振蕩2min,然后以4000rpm速率離心lOmin。3.PSA 純化移取上清液1.0mL于1.5mL離心管中，加入150mg無(wú)水硫酸鎂及25mgPSA吸附劑，于鏇潤(rùn)混合振蕩儀上以2000rpm速率振蕩2min,以6000rpm速率離心2min。吸取上清液經(jīng)
0.22m有機(jī)相濾膜過(guò)濾，移取200L，用超純水稀釋至1.0mL，待測(cè)。4.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS )測(cè)定(I) LC-MS/MS 條件:
色譜條件:AtiantisUPLCBE；HShieldRP18(50mmX 2.lmm, 1.7um,美國(guó) Waters 公司)；流動(dòng)相A:0.05%甲酸水溶液(體積分?jǐn)?shù))，流動(dòng)相B:乙腈；流速0.7mL/min ;柱溫45。C ;進(jìn)樣量 10 μ L。梯度洗脫條件:0 2min，70%A 10%A ；2 3.5min, 10%A 10%A ；3.5 3.51min, 10%A 70%A ;3.51 4.0Omin, 70%A 70%A。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源，噴霧電壓(IS):2.6kV，霧化氣流量:800L/Hr ;錐孔氣(cone)流量50L/Hr，離子化溫度350°C ;碰撞氣流量為0.15ml/min ;碰撞氣為氬氣，其余氣體為氮?dú)?；駐留時(shí)間為30msec，負(fù)離子MRM模式采集，監(jiān)測(cè)離子對(duì)及其相應(yīng)的碰撞能量(CE)見(jiàn)表I。表I多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下2，4_D及其氘代內(nèi)標(biāo)的部分質(zhì)譜參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定煙草中2，4-D殘留量的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 1)提取煙草中的目標(biāo)物 稱取烘干磨好的煙葉樣品，加入純水浸潤(rùn)，依次加入氘代內(nèi)標(biāo)，乙腈和甲酸，渦漩混合振蕩。放入冰箱冷凍后取出，依次加入無(wú)水硫酸鎂，氯化鈉，檸檬酸鈉和檸檬酸二氫鈉，渦旋振湯后尚心； 2)N-丙基乙二胺純化 移取上清液于新的離心管中，加入無(wú)水硫酸鎂及PSA吸附劑，于漩渦振蕩混合，然后高速離心；吸取上清液經(jīng)有機(jī)相濾膜過(guò)濾，移取濾液，并用乙腈和超純水稀釋后待測(cè)； 3)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 用乙腈配置2，4-D標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于棕色玻璃瓶中，-20°C保存。取一定量的各化合物儲(chǔ)備液進(jìn)行混合，用乙腈稀釋定容，制得混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液； 用乙腈準(zhǔn)確配置2，4-D-d3氘帶內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于不透明玻璃瓶中，-20°C保存。取一定量的各內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液進(jìn)行混合，用乙腈稀釋定容，制得混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；所有的儲(chǔ)備液于冰箱-20°C，使用前將其恢復(fù)到室溫； 用國(guó)際煙草科學(xué)研究合作中心空白煙葉的萃取基質(zhì)配制不同濃度的2，4-D、2，4-D和2，4，5-T標(biāo)準(zhǔn)工作溶液； 4)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定:吸取空白煙葉溶液和配制好的不同濃度的2，4-D標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算出樣品待測(cè)液中2，4-D殘留量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定煙草中2，4-D殘留量的方法，其特征在于，所述煙葉的重量為2g。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測(cè)定煙草中2，4-D殘留量的方法，其特征在于，步驟I)中所述冷凍時(shí)間為lOmin，冷凍溫度為-18至-15°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測(cè)定煙草中2，4-D殘留量的方法，其特征在于，步驟I)中提取過(guò)程依次加入的超純水，氣代內(nèi)標(biāo)，乙腈和甲酸的體積分別為IOmL, 20L, IOmL和200L。速率渦旋振蕩lmin。離心管在-10°C條件下保持lOmin。依次加入的無(wú)水硫酸鎂，氯化鈉，朽1檬酸鈉和朽1檬酸二氫鈉的質(zhì)量分別為4g, lg, Ig和0.5g。然后鏇潤(rùn)混合振蕩的速率為2000rpm,振蕩時(shí)間為2min,離心時(shí)間為lOmin。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測(cè)定煙草中2，4-D殘留量的方法，其特征在于，步驟2)中，力口入無(wú)水硫酸鎂及PSA吸附劑的質(zhì)量為150mg和25mg。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測(cè)定煙草中2，4-D殘留量的方法，其特征在于，步驟2)中移取濾液體積為200L，加入乙腈和超純水的體積為IOOL和700L。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測(cè)定煙草中2，4-D殘留量的方法，其特征在于，步驟4)中選取70%甲酸水和30%乙腈初始流動(dòng)相體系，分析時(shí)間為4min，進(jìn)樣量為10 μ L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定煙草中2，4-D殘留量的方法，其特征在于，步驟4)中梯度洗脫條件為梯度洗脫條件:0 2min，70%A 10%A ;2 3.5min, 10%A 10%A ;3.5 3.51min, 10%A 70%A ;3.51 4.0Omin, 70%A 70%A ;流動(dòng)相流速為 0.7mL/min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定煙草中2，4-D殘留量的方法，其特征在于，步驟4)串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器的條件:ES1-，噴霧電壓:2.6kV，霧化氣流量:800L/Hr ;錐孔氣流量50L/Hr，離子化溫度350°C ;碰撞氣流量為0.15ml/min ;碰撞氣為氬氣，其余氣體為氮?dú)?；駐留時(shí)間為30msec ，負(fù)離子MRM模式米集。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種測(cè)定煙草中2，4-D殘留量的方法，包括提取煙草中的目標(biāo)物、N-丙基乙二胺純化、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定四個(gè)步驟。本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有技術(shù)樣品處理方法的不足，針對(duì)煙草樣本優(yōu)化了前處理?xiàng)l件，并對(duì)LC-MS/MS的相關(guān)檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，主要優(yōu)化了離子源條件，色譜柱以及流動(dòng)相體系。與傳統(tǒng)的氣相色譜比較，采用基質(zhì)分散固相萃取法來(lái)檢測(cè)2，4-D。簡(jiǎn)化了前處理過(guò)程，提高了分析靈敏度。
文檔編號(hào)G01N30/02GK103149289SQ20131004682
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者熊巍, 陶曉秋, 楊雪, 黃玫, 龐夙, 張海燕, 韶濟(jì)民, 李晨曦 申請(qǐng)人:中國(guó)煙草總公司四川省公司