專利名稱：一種煙草中麥草畏殘留量的測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及屬于農(nóng)藥殘留檢驗技術領域，具體涉及煙草中麥草畏殘留量的測定方法。
背景技術：
麥草畏是第一類投入商業(yè)生產(chǎn)的選擇性除草劑，廣泛施用于禾谷類作物田、針葉樹林和牧草場等。麥草畏都為低毒除草劑，通過植物葉面、莖桿和根系吸收傳導，阻礙植物激素的正常傳導，從而使其死亡。但在使用過程中，結果表明此類物質可以引起人類軟組織惡性腫瘤，對動物體表現(xiàn)出胎盤毒性。C0RESTA的農(nóng)用化學品咨詢委員會(ACAC)在2008年制定的118種農(nóng)用化學品指導性殘留限量表中將麥草畏的限量定為0.20mg/kg。對于水、土壤、蔬果以及紡織品中麥草畏殘留的檢測已有相關報道，而對于煙草中麥草畏殘留的檢測報道較少。iKlkl、me;vV.等利用在線的液相色譜-氣相色譜聯(lián)用法測定了煙草中的麥草畏，酯化后的煙草樣品進入液相色譜分離，選取合適的保留時間段切入氣相色譜再次分離，然后通過電子捕獲檢測器檢測。劉惠民等研究開發(fā)了非水相毛細管電泳法測定煙草中的麥草畏，2,4-D和2,4, 5-T殘留,其中麥草畏的檢出限為0.5 μ g/mL,煙草樣品經(jīng)乙酸乙酯超聲萃取，凝膠滲透色譜凈化后，進入毛細管電泳儀檢測分析。宋娟梅等改進報道的毛細管電泳法，采用正交法設計實驗，優(yōu)化毛細管電泳法，并將優(yōu)化好的方法應用于煙草中2，4-D、2，4，5-T、麥草畏的測定。煙草行業(yè)也于2004年制定了相應的行業(yè)標準，其中麥草畏、2，4-D、2，4，5-T選取鹽酸水溶液萃取，旋轉蒸發(fā)濃縮，三甲基氫氧化锍衍生化，GC-MS分析，其前處理復雜費時，檢測時間較長，不利于高通量樣品的快速準確檢測。非水毛細管電泳法的檢出限較高，且分離度效果不如色譜方法。超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(UPLC-MS/MS)在農(nóng)殘檢測的靈敏度以及選擇性方面都明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法，在分析速度方面優(yōu)于普通的HPLC方法，而目前未見該檢測方法應用檢測煙草中的麥草畏殘留量。

發(fā)明內容
鑒于此，本發(fā)明目的在于提供一種前處理簡單、檢測時間短，利于高通量樣品的快速準確的麥草畏殘留量的測定方法。為解決以上技術問題，本發(fā)明提供的技術方案是，提供一種測定煙草中麥草畏殘留量的方法，該方法包括以下步驟:I)提取煙草中的目標物稱取烘干磨好的煙葉樣品，加入純水浸潤，依次加入氘代內標，乙腈和甲酸，渦漩混合振蕩。放入冰箱冷凍后取出，依次加入無水硫酸鎂，氯化鈉，檸檬酸鈉和檸檬酸二氫鈉，潤旋振湯后尚心。2) N-丙基乙二胺(PSA)純化移取上清液于新的離心管中，加入無水硫酸鎂及PSA吸附劑，于漩渦振蕩混合，然后高速離心。吸取上清液經(jīng)有機相濾膜過濾，移取濾液，并用乙腈和超純水稀釋后待測。3)標準儲備液和標準工作液的配制用乙腈配置麥草畏標準儲備液，儲存于棕色玻璃瓶中，-20°C保存。取一定量的儲備液進行混合，用乙腈稀釋定容，制得混合標準儲備液(10g/mL)。用乙腈準確配置麥草畏-d3氘帶內標標準儲備液，儲存于棕色玻璃瓶中，_20°C保存。取一定量的內標儲備液進行混合，用乙腈稀釋定容，制得混合內標標準儲備液(IOg/mL)。所有的儲備液于冰箱_20°C，使用前將其恢復到室溫。用國際煙草科學研究合作中心(C0RESTA)空白煙葉的萃取基質配制不同濃度的麥草畏標準工作溶液；4)液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)測定:吸取空白煙葉溶液和配制好的不同濃度的麥草畏標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，按內標法以峰面積計算出樣品待測液中麥草
畏含量。優(yōu)選地,所述煙葉的重量為2g。優(yōu)選地，步驟I)中所述冷凍時間為lOmin，冷凍溫度為-18至_15°C。優(yōu)選地，步驟I)中提取過程依次加入的超純水，氘代內標(10g/mL)，乙腈和甲酸(49-51%)的體積分別為10mL，20L，10mL和200L。渦旋振蕩(2000rpm) lmin。離心管在-10°C條件下保持lOmin。依次加入的無水硫酸鎂，氯化鈉，檸檬酸鈉和檸檬酸二氫鈉的質量分別為4g, lg, Ig和0.5g。然后鏇潤混合振蕩的速率為2000rpm,振蕩時間為2min,離心(4000rpm)時間為 IOmin。優(yōu)選地，步驟2)中，加入無水硫酸鎂及PSA吸附劑的質量為150mg和25mg。優(yōu)選地，所述步驟(2)中移取濾液體積為200L，加入乙腈和超純水的體積為IOOL和 700L。優(yōu)選地，步驟4)中選取70%甲酸水(體積分數(shù)0.05%)和30%乙腈初始流動相體系，分析時間為4min,進樣量為10 μ L。優(yōu)選地，步驟4)中梯度洗脫條件為梯度洗脫條件:(T2min，70%A^10%A ；2^3.5min,10%A 10%A ；3.5 3.51min, 10%A 70%A ；3.51 4.0Omin, 70%A 70%A ；流動相流速為 0.7mL/
mirio優(yōu)選地，步驟4)串聯(lián)質譜檢測器的條件:ES1-，噴霧電壓(IS):2.6kV，霧化氣流量:800L/Hr ;錐孔氣(cone)流量50L/Hr，離子化溫度350°C;碰撞氣流量為0.15ml/min ;碰撞氣為氬氣，其余氣體為氮氣；駐留時間為30msec，負離子MRM模式采集。本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有技術樣品處理方法的不足，針對煙草樣本優(yōu)化了前處理條件，并對LC-MS/MS的相關檢測條件進行了優(yōu)化，主要優(yōu)化了離子源條件，色譜柱以及流動相體系。與現(xiàn)有技術相比本發(fā)明方法具有如下優(yōu)良效果:選取了基質分散固相萃取方式來處理樣品，簡化了前處理過程。在乙腈萃取過程中加入乙酸，有助于提高麥草畏這類苯氧羧酸類化合物的萃取效率。在加入硫酸鎂和氯化鈉之前，放入冰箱冷凍一段時間，可以防止其加入后過熱結塊。與傳統(tǒng)的氣相色 譜比較，采用基質分散固相萃取法來檢測麥草畏。簡化了前處理過程，提高了分析靈敏度。與HPLC方法相比，由于選取了超高效液相色譜柱RP18(50mmX2.1mm，1.7um)，使得柱子的分離度明顯提高，分析時間顯著縮短。串聯(lián)質譜的使用使得方法的選擇性和靈敏度提高，更有利于低含量的除草劑殘留的測定。選取了氘代麥草畏對麥草畏進行定量，有效消除基質干擾和前處理過程中引起的誤差，使得方法的準確性更聞。選取了兩個離子對，定量離子對定量，定性離子對確認，可以提高方法的準確度。本方法具有操作簡便、快速、準確、靈敏度及重復性好的優(yōu)點。


圖1是麥草畏的子離子質譜圖。圖2是麥草畏-d3的子離子質譜圖。圖3是加標樣品的選擇離子流色譜圖(50ng/mL，定量離子對)。圖4是加標樣品的選擇離子流色譜圖(50ng/mL，定性離子對)。圖5是麥草畏-d3的選擇離子流色譜圖(IS20ng/mL)。
具體實施例方式下面結合附圖與具體實施例進行說明。參見圖1至圖5。1.儀器與試劑Waters Xevo TQ超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀(美國Waters公司)，配備電噴霧電離源(ESI);VtexMixer230VeU振蕩器(美國Labnet公司);Sigma3K15離心機(德國Sigma公司)。甲酸為HPLC級(濃度為49-51%，德國Sigma公司)；乙腈，甲醇均為色譜純(美國Thermo-Fisher 公司);麥草畏標準品來自于 Labor Dr.Ehrenstorfer-Schafers(化學純度:98.5%, Augsburg,德國)，內標麥草畏-d3 來自于 Labor Dr.Ehrenstorfer-Schafers (化學純度:99%，同位素純度:98.5%，Augsburg，德國)。N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑、末尾封端碳18 (C18E)吸附劑，水為超純水。2.提取煙草中的分析物準確稱取2g樣品(精確至0.0lg)于50mL具蓋離心管中，加入IOmL水，振蕩直至樣品被水充分浸潤。冷凍IOmin后移取IOmL乙腈至離心管中，加入200L甲酸，然后將離心管置于渦漩混合振蕩儀上，以2000rpm速率振蕩lmin。將離心管置于0°C條件下保持lOmin，然后向離心管中加入4g無水硫酸鎂和Ig氯化鈉，Ig檸檬酸鈉和0.5g檸檬酸二氫鈉，立即于鏇潤混合振蕩儀上，以2000rpm速率振蕩2min,然后以4000rpm速率離心lOmin。3.PSA 純化移取上清液1.0mL于1.5mL離心管中，加入150mg無水硫酸鎂及25mgPSA吸附劑，于鏇潤混合振蕩儀上以2000rpm速率振蕩2min,以6000rpm速率離心2min。吸取上清液經(jīng)
0.22m有機相濾膜過濾，移取200L，用超純水稀釋至1.0mL，待測。4液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS )測定(I) LC-MS/MS 條件:
色譜條件:AtiantisUPLC BEH Shield RP18 (50mmX 2.lmm, 1.7um,美國 Waters公司)；流動相A:0.05%甲酸水溶液(體積分數(shù))，流動相B:乙腈；流速0.7mL/min ;柱溫 45 ° C ;進樣量 10 μ L。梯度洗脫條件:0 2min，70%A 10%A ；2^3.5min, 10%A 10%A ；3.5^3.51min, 10%A 70%A ；3.5Γ4.0Omin，70%A 70%A。質譜條件:電噴霧離子源，噴霧電壓(IS):2.6kV，霧化氣流量:800L/Hr ;錐孔氣(cone)流量50L/Hr，離子化溫度350°C ;碰撞氣流量為0.15ml/min ;碰撞氣為氬氣，其余氣體為氮氣；駐留時間為30msec，負離子MRM模式采集，監(jiān)測離子對及其相應的碰撞能量(CE)見表I。表I多反應監(jiān)測模式下麥草畏及其氘代內標的部分質譜參數(shù)
權利要求
1.一種測定煙草中麥草畏含量的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 1)提取煙草中的目標物 稱取烘干磨好的煙葉樣品，加入純水浸潤，依次加入氘代內標，乙腈和甲酸，渦漩混合振蕩；放入冰箱冷凍后取出，依次加入無水硫酸鎂，氯化鈉，檸檬酸鈉和檸檬酸二氫鈉，渦旋振湯后尚心； 2)N-丙基乙二胺純化 移取上清液于新的離心管中，加入無水硫酸鎂及PSA吸附劑，于漩渦振蕩混合，然后高速離心；吸取上清液經(jīng)有機相濾膜過濾，移取濾液，并用乙腈和超純水稀釋后待測； 3)標準儲備液和標準工作液的配制 用乙腈配置麥草畏標準儲備液，儲存于棕色玻璃瓶中，-20°C保存；取一定量的儲備液進行混合，用乙腈稀釋定容，制得混合標準儲備液； 用乙腈準確配置麥草畏-d3氘帶內標標準儲備液，儲存于棕色玻璃瓶中，_20°C保存；取一定量的內標儲備液進行混合，用乙腈稀釋定容，制得混合內標標準儲備液；所有的儲備液于冰箱_20°C，使用前將其恢復到室溫； 用國際煙草科學研究合作中心空白煙葉的萃取基質配制不同濃度的麥草畏標準工作溶液； 4)液相色譜-串聯(lián)質 譜(LC-MS/MS)測定:吸取空白煙葉溶液和配制好的不同濃度的麥草畏標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，按內標法以峰面積計算出樣品待測液中麥草畏含量。
2.根據(jù)權利要求1所述的測定煙草中麥草畏含量的方法，其特征在于，所述煙葉的重量為2g。
3.根據(jù)權利要求2所述的測定煙草中麥草畏含量的方法，其特征在于，步驟I)中所述冷凍時間為lOmin，冷凍溫度為-18至-15°C。
4.根據(jù)權利要求3所述的測定煙草中麥草畏含量的方法，其特征在于，步驟I)中提取過程依次加入的超純水，氘代內標，乙腈和甲酸的體積分別為10mL，20L，IOmL和200L ;潤旋振蕩Imin ;離心管在-10°C條件下保持IOmin ;依次加入的無水硫酸鎂，氯化鈉，檸檬酸鈉和朽1fefe~■氣納的質量分別為4g, lg, Ig和0.5g ;然后游潤混合振湯的速率為2000rpm,振湯時間為2min,離心時間為lOmin。
5.根據(jù)權利要求3所述的測定煙草中麥草畏含量的方法，其特征在于，步驟2)中，加入無水硫酸鎂及PSA吸附劑的質量為150mg和25mg。
6.根據(jù)權利要求1所述的測定煙草中麥草畏含量的方法，其特征在于，步驟2)中移取濾液體積為200L，加入乙腈和超純水的體積為IOOL和700L。
7.根據(jù)權利要求3所述的測定煙草中麥草畏含量的方法，其特征在于，步驟4)中選取70%甲酸水和30%乙腈初始流動相體系，分析時間為4min，進樣量為IOy L。
8.根據(jù)權利要求7所述的測定煙草中麥草畏含量的方法，其特征在于，步驟4)中梯度洗脫條件為梯度洗脫條件:0 2min，70%A 10%A ;2 3.5min, 10%A 10%A ；3.5 3.51min，10%Α 70%Α ；3.5Γ4.0Omin，70%Α 70%Α ;流動相流速為 0.7mL/min。
9.根據(jù)權利要求8所述的測定煙草中麥草畏含量的方法，其特征在于，步驟4)串聯(lián)質譜檢測器的條件:ES1-，噴霧電壓:2.6kV，霧化氣流量:800L/Hr ;錐孔氣(cone)流量50L/Hr，離子化溫度35(TC ;碰撞氣流量為0.15ml/min ;碰撞氣為氬1氣，其余氣體為氮氣；駐留時間為30msec，負離子MRM模 式米集。
全文摘要
本發(fā)明公開一種測定煙草中麥草畏殘留量的方法，該方法包括以下步驟提取煙草中的目標物、N-丙基乙二胺純化、標準儲備液和標準工作液的配制和液相色譜-串聯(lián)質譜測定。本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有技術樣品處理方法的不足，針對煙草樣本優(yōu)化了前處理條件，并對LC-MS/MS的相關檢測條件進行了優(yōu)化，主要優(yōu)化了離子源條件，色譜柱以及流動相體系。與傳統(tǒng)的氣相色譜比較，采用基質分散固相萃取法來檢測麥草畏。簡化了前處理過程，提高了分析靈敏度。與HPLC方法相比，由于選取了超高效液相色譜柱RP18，使得柱子的分離度明顯提高，分析時間顯著縮短。串聯(lián)質譜的使用使得方法的選擇性和靈敏度提高，更有利于低含量的除草劑殘留的測定。
文檔編號G01N30/88GK103149313SQ20131004686
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月6日 優(yōu)先權日2013年2月6日
發(fā)明者熊巍, 陶曉秋, 韶濟民, 楊雪, 龐夙, 張海燕, 黃玫 申請人:中國煙草總公司四川省公司