專利名稱：一種檢測甲胎蛋白的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于電化學(xué)免疫傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測甲胎蛋白的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，尤其是基于ZnSe量子點(diǎn)及PEDOT導(dǎo)電化合物薄膜修飾電極用于甲胎蛋白免疫生物傳感器的構(gòu)建。
背景技術(shù)：
甲胎蛋白(a -fet0pix)tein，AFP)是胚胎發(fā)育早期的一種主要血清蛋白，在健康的成人體內(nèi)，其值通常低于25 ng/ml，血清中甲胎蛋白的升高對原發(fā)性肝癌診斷具有重要的意義。目前甲胎蛋白的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫分析法、放射免疫測定法、間接血酶法和瓊脂雙擴(kuò)散法等。雖然這些方法靈敏、可靠，但存在酶不穩(wěn)定，放射物質(zhì)設(shè)備要求高，危害較大等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種檢測AFP的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，該方法基于PEDOT及ZnSe量子點(diǎn)作為生物蛋白分子的固定載體，具有較寬的線性范圍及較高的靈敏度。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種檢測AFP的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其包括下述步驟:
1)制備水溶性ZnSe量子點(diǎn)；
2)制備PEDOT/Azure I /ZnSe 修飾電極;
3)構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器。所述步驟I)具體可參照文獻(xiàn)[Enustun.B.V, Turkevich.J.J.Am.Chem.Soc.1963，85，3317-3328]進(jìn)行 ZnSe 量子點(diǎn)的制備，并參照[Alexey Shavel, NikolaiGaponik, Alexander Eychmller.J.Phys.Chem.B.2004, 108, 5905-5908]對 ZnSe量子點(diǎn)進(jìn)行純化。所述步驟2)具體為:將處理清潔的直徑為3mm的鉬盤電極浸入含有0.5 mol/L3，4-乙烯二氧噻吩(EDOT)單體的1- 丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體中，在45°C溫度條件下，以鉬盤電極為工作電極，鉬片電極為對電極，銀絲作參比的+1.25 V的工作電位恒電位電聚合得到藍(lán)色的PEDOT薄膜修飾電極，聚合電量為1.0 mC ;然后將PEDOT薄膜修飾電極用去離子水洗凈，晾干，取5μ I質(zhì)量百分比為5%的天青I (Azure I )溶液滴涂于PEDOT薄膜修飾電極表面，晾干成膜，用去離子水反復(fù)沖洗用以去除非共價鍵合的天青I，晾干，然后浸入ZnSe量子點(diǎn)溶液中浸泡12h，取出后用去離子水清洗干凈，晾干備用，SP為 PEDOT/Azure I /ZnSe 修飾電極。所述步驟3)具體為:將步驟2)所得修飾電極浸入到30 μ I含1.0 mg/mL甲胎蛋白抗體(ant1- AFP)的磷酸緩沖溶液中4°C孵育12h，然后用PBST溶液清洗電極用以去除與修飾電極結(jié)合不夠穩(wěn)定的抗體；再將修飾電極浸入到含1.0mg/L辣根過氧化物酶(HRP)的磷酸緩沖溶液中放置4小時，取出，用PBST溶液清洗干凈，由此即得到電化學(xué)免疫傳感器；所述PBST溶液是由0.1 mol/L的磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀配置的磷酸緩沖溶液和濃度0.05%的Tween-20組成的混合溶液。量子點(diǎn)(quantum Dots,簡稱QDs)是一種半導(dǎo)體晶體材料的納米顆粒,直徑在10nm以內(nèi)，較普通細(xì)胞的體積小數(shù)千倍。這種納米尺寸的化合物具有水溶性、生物相容性等特點(diǎn)，在免疫生物學(xué)和臨床檢驗(yàn)學(xué)等研究中有廣闊的應(yīng)用前景。眾所周知，納米材料的催化性能取決于粒子的大小。小的粒徑不僅有助于提高生物蛋白分子的固定能力，而且可以提供較多的活性比表面積，增加蛋白分子固定的個數(shù)。本申請合成了水溶性的ZnSe量子點(diǎn)，電鏡結(jié)果顯示其平均粒徑為4.4 nm，相對于金膠納米顆粒(16 nm)的粒徑要小的多。因此，其可以代替金膠納米顆粒作為生物蛋白分子的固定載體，從而改善生物蛋白分子的吸附能力，增加固定量。同時，在離子液體中電聚合得到的PEDOT聚合物薄膜具有疏松多孔的三維結(jié)構(gòu)，便于吸附更多的量子點(diǎn)。因此，基于ZnSe量子點(diǎn)和導(dǎo)電聚合物PEDOT的雙納米粒子的協(xié)同作用，可以有效的增加電子傳遞。本申請采用PEDOT納米導(dǎo)電材料來作為生物傳感器的基體，通過共價鍵合的方法在復(fù)合材料的表面組裝導(dǎo)電功能材料-天青I來共同作為電子傳輸體，這樣既保證了抗原-抗體反應(yīng)中電子的快速傳遞，又使得生物分子保持了有效的生物活性。更重要的是，硒化鋅量子點(diǎn)的組裝，使得標(biāo)記的生物分子數(shù)目得到了增加，從而使得利用水溶性的硒化鋅量子點(diǎn)作為信號擴(kuò)增的甲胎蛋白免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)了對AFP的高靈敏度測定。此外，天青I作為一種生物染料，是一種比較活潑的電子轉(zhuǎn)移媒介體，在導(dǎo)電基質(zhì)上具有良好的電化學(xué)行為。本發(fā)明方法利用染料分子天青I作為電子媒介體，與聚(3，4_乙烯二氧噻吩)共同構(gòu)建了抗體分子的固定載體，用ZnSe量子點(diǎn)來吸附在復(fù)合物薄膜表面，用于結(jié)合抗體分子與辣根過氧化物酶，將ZnSe量子點(diǎn)的化學(xué)放大作用與免疫傳感器的特異性相結(jié)合，融合兩者的優(yōu)點(diǎn)，增強(qiáng)了電化學(xué)檢測AFP的靈敏度和檢測限。


圖1是實(shí)施例1制備的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建示意 圖2是實(shí)施例1制備的PEDOT及PEDOT /Azure I/ ZnSe薄膜的FESEM圖；由PEDOT的電鏡圖片(a)可以看出制備的PEDOT為疏松多孔的三維結(jié)構(gòu)，每層的厚度約10 nm，如此多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)便于吸附更多的量子點(diǎn)，從而使得標(biāo)記的生物分子數(shù)目增加，增強(qiáng)了免疫傳感器的靈敏度；而由PEDOT /Azure I/ ZnSe的電鏡圖(b)可觀察到網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)表面覆蓋大量的小顆粒，標(biāo)識著在PEDOT的表面成功地修飾了大量的ZnSe量子點(diǎn)；
圖3為按照實(shí)施例1制備的電化學(xué)免疫傳感器的線形曲線。
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)施例來說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。實(shí)施例1
一種檢測AFP的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其包括下述步驟: I)制備水溶性ZnSe量子點(diǎn):
制備:參照文獻(xiàn)[Enustun.B.V, Turkevich.J.J.Am.Chem.Soc.1963, 85,3317-3328]進(jìn)行，具體為:量取125ml的二次蒸餾水充氮除氧lh，然后在攪拌條件下向水中加入 0.875g(2.35 mmol) ZnClO4.6H20 與 5.7 mmol 的 3-巰基丙酸(MPA，用作穩(wěn)定劑)，用 Imol/L的NaOH溶液將反應(yīng)溶液的pH值調(diào)節(jié)為6.5，繼續(xù)向溶液中通氮?dú)獬?。攪拌下，力口?0.134g(0.46mmol)Al2Se3及過量硫酸進(jìn)行反應(yīng)(用以產(chǎn)生新鮮的H2Se3),在此狀態(tài)下，產(chǎn)生了 ZnSe的前驅(qū)體。然后加熱回流2h，經(jīng)過成核以及生長階段，得到熒光發(fā)射波長為390nm的ZnSe量子點(diǎn)。純化:參照文獻(xiàn)[AlexeyShavel, Nikolai Gaponik, Alexander Eychmller.J.Phys.Chem.B.2004, 108, 5905-5908]純化，具體為:將 ZnSe 量子點(diǎn)用 3000 MW 的超濾離心管于4°C離心15 min用以消除未反應(yīng)完的MPA。然后用50 mmol/L、pH 7.4的PBS緩沖液洗滌三遍，取離心管的上部溶液再溶于PBS緩沖液中，用50 000 MW的超濾離心管進(jìn)行第二次超濾離心，離心后將離心管下部的溶液在3000 MW的超濾離心管中經(jīng)過離心濃縮，使得量子點(diǎn)的濃度達(dá)到0.1 μ mol/L,高分辨透射電鏡結(jié)果表明制得的ZnSe量子點(diǎn)平均粒徑為 4.4 nm。)制備PEDOT/Azure I /ZnSe 修飾電極:
將直徑3 mm的鉬盤電極依次用直徑1.0,0.3和0.05 μ m的Al2O3粉在麂皮上拋光至鏡面，每次拋光后用清水洗去表面污物，再分別用超純水、乙醇各超聲清洗3 min,氮?dú)獯蹈伞⒋?。以BMMBF4為電解液與支持電解質(zhì)，于5ml的BMMBF4中加入作為反應(yīng)單體的EDOT
2.5mmol，攪拌均勻。先通氮?dú)獗Ｗo(hù)30min用以使溶液處于氮?dú)夥諊?。?5°C溫度條件下采用三電極體系，以清洗干凈的直徑為3mm鉬盤電極為工作電極，鉬片為對比電極，銀絲作參比電極，攪拌狀態(tài)下，在上述電解液中于+1.25 V (vs.Ag)的工作電位恒電位電聚合，聚合電量為1.0 mC，得到表面包覆有藍(lán)色PEDOT聚合物薄膜的修飾電極(即PEDOT修飾電極)。將PEDOT修飾電極用去離子水沖洗干凈，晾干。取5 μ I質(zhì)量百分比為5%的天青I水溶液滴涂于PEDOT修飾電極表面，晾干成膜，用去離子水反復(fù)沖洗，用以去除非共價鍵合的天青I，晾干，然后浸入Iml的ZnSe量子點(diǎn)溶液(量子點(diǎn)濃度0.1 μ mol/L)中浸泡12h，取出后用去尚子水清洗干凈，晾干備用，即為PEDOT/Azure I /ZnSe修飾電極。)構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器:
將PEDOT/Azure I /ZnSe修飾電極浸入到30 μ I含1.0 mg/mL甲胎蛋白抗體的磷酸緩沖溶液中4°C孵育12h以使抗體分子結(jié)合在修飾電極表面，然后用PBST溶液清洗修飾電極用以移走電極表面物理吸附的抗體；再將修飾電極浸入到30μ I含1.0mg/L HRP的磷酸緩沖溶液中放置4小時，取出，用PBST溶液清洗干凈，由此即得到電化學(xué)免疫傳感器；所述PBST溶液是由0.1 mol/L的磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀配置的磷酸緩沖溶液和濃度0.05%的Tween-20組成的混合溶液。一)電化學(xué)免疫傳感器檢測AFP:
將制備好的電化學(xué)免疫傳感器浸入到30 μ L含有不同濃度AFP的樣品溶液中于37°C孵育20 min，用PBST溶液清洗電極表面后，與鉬片對電極、甘汞參比電極組成三電極系統(tǒng)，在5ml含有2.0 mmol/L H2O2的pH 7.4磷酸緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安電化學(xué)檢測。整個檢測過程保持在氮?dú)夥諊?，掃描電位區(qū)間為-ο.6 0.3V (vs.SCE，Saturated CalomelElectrode)。根據(jù)響應(yīng)電流與AFP濃度的對數(shù)之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線。得到“響應(yīng)電流一 AFP濃度”的線性曲線為1=2.52861ogC-0.2386，線性相關(guān)系數(shù)為0.9868 (結(jié)果見圖
3)。AFP在5X 10_5 ng/ml 250 ng/ml范圍內(nèi)，響應(yīng)電流與AFP濃度的對數(shù)保持良好的線性關(guān)系，檢測限為10_6 ng/ml。二)電化學(xué)免疫傳感器的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性:
將電化學(xué)免疫傳感器浸入到30 μ L含有5 ng/ml AFP的標(biāo)準(zhǔn)溶液中于37 1:免疫反應(yīng)20 min，然后用PBST溶液清洗電極表面后，與鉬片對電極，甘汞參比電極，組成三電極系統(tǒng)，在5ml含有2.0 mmol/L H2O2的pH 7.4磷酸緩沖溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安電化學(xué)檢測。整個檢測過程保持在氮?dú)夥諊?，掃描電位區(qū)間為-0.6 0.3V (vs.SCE)。每隔三天對相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)打測試，60天后，傳感器的電流響應(yīng)保持在96.2%。 同時制備6個電化學(xué)免疫傳感器，浸入到同一份含有5ng/ml AFP的標(biāo)準(zhǔn)品中于37°〇免疫反應(yīng)20 min,測試響應(yīng)電流，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在4.7%以內(nèi)。將電化學(xué)免疫 傳感器浸泡在piranha溶液(由濃硫酸與30%過氧化氫按體積比3:I混和而得)中5min即可除去電極表面的生物分子和有機(jī)物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對免疫修飾電極的再生。重復(fù)上述的電極修飾過程即可得到全新的AFP傳感器。對于連續(xù)再生5次的傳感器，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 5.6%。三)電化學(xué)免疫傳感器在檢測實(shí)際血清樣品中AFP濃度的應(yīng)用:
將電化學(xué)免疫傳感器置于6份實(shí)際血清樣品中免疫反應(yīng)20 min后，按上述實(shí)驗(yàn)方法測量其電流值。然后通過線性方程求出樣品中的AFP濃度，并和醫(yī)院臨床診斷中所使用的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法得到的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見表I。由表I可看出，采用本發(fā)明方法制備的免疫傳感器所得的檢測結(jié)果和傳統(tǒng)臨床檢測結(jié)果基本相一致。因此，表明該免疫傳感器可滿足臨床對AFP檢測的需求。
表1:電化學(xué)免疫法與化學(xué)發(fā)光酶免疫祛的AfP檢測結(jié)果對比
權(quán)利要求
1.一種檢測甲胎蛋白的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其特征在于，包括下述步驟: 1)制備水溶性ZnSe量子點(diǎn)； 2)制備PEDOT/Azure I /ZnSe 修飾電極; 3)構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器。
2.如權(quán)利要求1所述檢測甲胎蛋白的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟2)具體為:將處理清潔的鉬盤電極浸入含有0.5 mol/L 3，4-乙烯二氧噻吩單體的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體中，在45°C溫度條件下，以鉬盤電極為工作電極，銀絲為參比的+1.25 V的工作電位恒電位電聚合得到PEDOT薄膜修飾電極，聚合電量為1.0 mC ;然后將PEDOT薄膜修飾電極用去離子水洗凈，晾干，取5 μ I濃度5%的天青I溶液滴涂于PEDOT薄膜修飾電極表面，晾干成膜，用去離子水反復(fù)沖洗用以去除非共價鍵合的天青I，晾干，然后浸入ZnSe量子點(diǎn)溶液中浸泡12h，取出后用去離子水清洗干凈，晾干備用，即為PEDOT/Azure I /ZnSe修飾電極。
3.如權(quán)利要求1所述檢測甲胎蛋白的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟3)具體為:將步驟2)所得修飾電極浸入到30 μ I含1.0 mg/mL甲胎蛋白抗體的磷酸緩沖溶液中4°C孵育12h，然后用PBST溶液清洗電極用以去除與修飾電極結(jié)合不夠穩(wěn)定的抗體；再將修飾電極浸入到含1.0mg/L辣根過氧化物酶的磷酸緩沖溶液中放置4小時，取出，用PBST溶液清洗干凈，由此即得到電化學(xué)免疫傳感器；所述PBST溶液是由0.1 mol/L的磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀配置的磷酸緩沖溶液和濃度0.05%的Tween-20組成的混合溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測甲胎蛋白的免疫生物傳感器的制備方法，其通過將聚(3，4-乙烯二氧噻吩)、天青Ⅰ、ZnSe量子點(diǎn)及甲胎蛋白抗體自組裝修飾到鉑盤電極上得到。它利用染料分子天青Ⅰ作為電子媒介體，與聚(3，4-乙烯二氧噻吩)共同構(gòu)建了抗體分子的固定載體，用ZnSe量子點(diǎn)來吸附在復(fù)合物薄膜表面，用于結(jié)合抗體分子與辣根過氧化物酶，將ZnSe量子點(diǎn)的化學(xué)放大作用與免疫傳感器的特異性相結(jié)合，融合兩者的優(yōu)點(diǎn)，增強(qiáng)了電化學(xué)檢測甲胎蛋白靈敏度和檢測限。
文檔編號G01N33/68GK103105497SQ20131004737
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者劉珂珂, 褚艷紅, 劉清, 劉沖 申請人:河南省科學(xué)院高新技術(shù)研究中心