專利名稱：一種銀杏幼苗雌雄株的鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物雌雄株的鑒別方法，特別涉及一種針對銀杏雌雄株早期的鑒別方法。
背景技術(shù)：
自然界大部分植物是雌雄同株，而銀杏等少數(shù)樹種卻是雌雄異株；雄銀杏只開花不結(jié)果，雌銀杏才會結(jié)果；即使將雌銀杏的枝條嫁接到雄銀杏樹上，也只有這根枝條結(jié)果。一般從外觀上很難區(qū)分銀杏樹是雄是雌。兩者在樹形上只有細(xì)微差別，雌銀杏的樹冠向兩邊擴(kuò)張，雄銀杏的樹冠是拼命往上長，只有業(yè)內(nèi)專業(yè)人員能區(qū)分雌雄株。雄銀杏由于不結(jié)果的原因，被砍伐的比較多，所以目前自然界中，銀杏樹是雌多、雄少。銀杏雌雄株的生長習(xí)性、形態(tài)、特征與用途各不相同，及早并正確地區(qū)分雌雄株，在生產(chǎn)實踐上具有重要意義。銀杏集藥用、食用、材用和觀賞于一身，具有特殊的經(jīng)濟(jì)價值和重要的科學(xué)研究價值。近幾年來在我國發(fā)展迅速，種植規(guī)模日漸擴(kuò)大，特別是在城市園林綠化工程中被廣泛使用。銀杏為雌雄異株植物，實生樹定植后需20-25年才能開花結(jié)果，分出雌雄。因銀杏種子在成熟時具有一種特殊的臭味，落果腐爛污染城市及行人，所以作為綠化樹種只需雄株，不需要以生產(chǎn)白果為目的的雌株。因此，銀杏雌雄株性別的早期鑒別不僅具有理論意義，而且具有重要的實用價值。在銀杏幼苗幼樹期，可以采用形態(tài)鑒別法、生理生化指標(biāo)法、同工酶譜和染色體核型鑒定法等方法。雖然憑外部形態(tài)特征來鑒別銀杏性別，方法簡單易行，但要等植株達(dá)到一定年齡(大約10年以上)才能區(qū)分雌雄株，而且銀杏雌雄株在苗期形態(tài)指標(biāo)差距不大，缺少數(shù)字化和圖譜的明確標(biāo)準(zhǔn)，因而銀杏苗期形態(tài)鑒定存在一定難度。銀杏的生理生化指標(biāo)大多力求從不同側(cè)面尋找已知性別的成年植株之間進(jìn)行測定，表現(xiàn)出一定的差異性，盡管有些差異在苗期也有反映，但多表現(xiàn)在量的方面，而且隨水分、養(yǎng)分、CO2濃度、溫度、光照和干擾水平等的不同而有所不同。同工酶譜和染色體核型鑒定法準(zhǔn)確率較高，但是酶帶差異不一定是雌雄性別造成的，有可能與其他性狀的變異有關(guān)，諸如葉片性狀等，這些變異在銀杏雌雄株內(nèi)普遍存在，且由于在早期鑒定時，可選擇的酶種類較少，顯色的酶帶不多，有時并不能區(qū)分開雌雄株。而且操作工序復(fù)雜，需要CTAB、PVP、TriS-HCl、酚、氯仿、TE、溴化乙錠等藥品，藥品昂貴，毒性大，還要引物和PCR儀，儀器設(shè)備要求高，要有較高專業(yè)知識的人操作，普通實驗室難以進(jìn)行。所以以上這些方法均不宜在城市園林綠化工程中推廣。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種銀杏雌雄株早期的簡單易行的鑒別方法，實驗藥品用量少，儀器設(shè)備簡單，在園林公司或苗圃，普通工人就可以進(jìn)行操作，將本發(fā)明的技術(shù)應(yīng)用在城市園林綠化工程中，既簡便又有效，具有較高的應(yīng)用價值。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種銀杏幼苗雌雄株的鑒別方法，包括如下步驟:
(一)材料的準(zhǔn)備:取銀杏幼苗葉片，洗凈，吸干水分，備用； (二)檢測:
1)稱取0.5-1.0 g銀杏幼苗葉片，剪碎；
2)加入4-5ml磷酸緩沖液，冰浴研磨呈勻漿；
3)室溫下浸提1-1.5 h ；
4)浸提液在5000rpm離心5 min ；
5)取上清液2ml，加入0.1%溴麝香草酚藍(lán)4-5ml，混勻；
6)置于30°C溫度下，觀察浸提液顏色變化所需的時間，并每隔15min記錄銀杏浸提液的顏色變化。上述的銀杏幼苗雌雄株的鑒別方法，所述的磷酸緩沖液的pH為6.6。優(yōu)選的，pH為6.6的磷酸緩沖液的制備方法如下:將NaH2PO4.H2O 27.8g加水配成IOOOml溶液，Na2HPO4.7H20 53.65g 加水配成 IOOOml 溶液；取 62.5ml NaH2PO4.H2O 溶液和 37.5mlNa2HPO4.7H20溶液混合，加水稀釋至200ml。上述的銀杏幼苗雌雄株的鑒別方法，還包括如下步驟:根據(jù)浸提液顏色變化判定雌雄株，具體方法為:
1)銀杏浸提液在加入溴麝香草酚藍(lán)液后均呈藍(lán)綠色，隨著時間的不斷延長，在IOmin內(nèi)由藍(lán)綠色轉(zhuǎn)至綠色，銀杏雌雄浸提液變化沒有差異；
2)在15-25min后開始出現(xiàn)差異，若為雌株浸提液由綠色轉(zhuǎn)為黃綠色，雄株浸提液仍為綠色，Ih左右差異明顯，若為雌株浸提液呈黃褐色，若為雄株浸提液仍呈綠色；
3)3-4h后兩者都呈黃色,差異消失。本發(fā)明的有益效果是:
1.操作簡便:本發(fā)明由于在銀杏苗期提供了直觀明顯的顯色反應(yīng)，比生理指標(biāo)鑒別法、化學(xué)物質(zhì)分析鑒別法、同工酶圖譜鑒定法、染色體核型鑒定法、核酸技術(shù)鑒別法等方法簡便易行，這些方法都必須有相應(yīng)的儀器設(shè)備和化學(xué)藥品，鑒定成本昂貴，而且需要有專業(yè)人員進(jìn)行操作，而本方法操作簡單，園林公司或苗圃的普通工人就可以進(jìn)行操作。2.準(zhǔn)確率高:銀杏雄株葉片比雌株大，且缺刻深；雌株葉維管束周圍存有脂隙，而雄株沒有。雄株短枝較短，僅在l-2cm左右；雌株短枝由于多年連續(xù)結(jié)種，可以延伸到IOcm以上，所以短枝顯得較長。雄株主枝與主干間夾角很小，大多在30°以內(nèi)，有的幾近平行于主干生長。挺直的枝條看起來比雌株粗壯好看；而雌株夾角很大，可達(dá)50°以上，有的看上去好象垂直于主干長出的，亂而向四方擴(kuò)展。形態(tài)鑒別法簡單方便，但經(jīng)驗性強，可靠性不足。本發(fā)明以溴麝香草酚藍(lán)液進(jìn)行顯色反應(yīng)，銀杏雌雄株顏色變化明顯，在銀杏苗期就可以確定雌雄，準(zhǔn)確率可達(dá)100%，比形態(tài)鑒別法準(zhǔn)確率高，可以在城市園林綠化工程中推廣。3.縮短鑒別時間:本發(fā)明由于采用PH6.6磷酸緩沖液進(jìn)行處理，觀察顏色變化所需時間大大縮短，銀杏雌雄株處理大約IOmin就可以表現(xiàn)出明顯差異，比其它方法所需時間都短，在3小時內(nèi)即可確定雌雄株，。4.節(jié)約成本:銀杏雌雄株特性不同，雌株果實成熟后常散發(fā)出較難聞的氣味，城市園林綠化不宜多種；而作為經(jīng)濟(jì)樹種，為了提高經(jīng)濟(jì)效益、達(dá)到豐產(chǎn)，則普遍傾向于種植雌株。實生樹定植后需20-25年才能開花結(jié)果，分出雌雄。本方法在苗期就可以確定雌雄，避免銀杏成熟以后產(chǎn)生不良結(jié)果，造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失。
具體實施例方式實施例1 溫度和pH值對銀杏雌雄株鑒別方法的影響 (一)材料與方法
分別取10株20年生已知的成熟銀杏雌雄株葉片和10株3年生已知雌雄的銀杏幼苗葉片，洗凈，吸干水分，備用。稱取0.5-1.0 g銀杏葉片，剪碎，加入4-5 ml磷酸緩沖液，冰浴研磨呈勻漿，室溫下浸提1-1.5 h;浸提液在5000 rpm離心5 min。取上清液2 ml，加入0.1%溴麝香草酚藍(lán)4-5ml，混勻，觀察環(huán)境溫度和磷酸緩沖液的pH值對浸提液顏色變化的影響。(二)溫度對顏色變化的影響
固定磷酸緩沖液的PH6.6，分別在20°C、25°C、30°C溫度下觀察浸提液顏色變化情況。試驗發(fā)現(xiàn)，溫度和浸提液顏色變化的關(guān)系很密切。20°C下觀察，雌雄株浸提液出現(xiàn)顏色差異和差異消失的時間分別是約IOh左右和約12h左右；25°C下觀察，雌雄株浸提液出現(xiàn)顏色差異和差異消失的時間分別是約6h左右和約8h左右；30°C則分別縮短到Ih左右和3-4h。由此可知，30 V為觀察浸提液顏色變化的最佳溫度。(三)不同pH值磷酸緩沖液的影響
以ρΗ6.0、ρΗ6.4、ρΗ6.6、ρΗ6.8、ρΗ7.0、ρΗ7.5磷酸緩沖液浸提，然后在30°C的環(huán)境下，觀察浸提液的顏色變化。預(yù)先為其創(chuàng)造一個微酸環(huán)境，以蒸餾水(ΡΗ6.2)浸提液為對照，觀察雌雄株浸提液顏色變化的情況。結(jié)果表明，ΡΗ7.0、ρΗ7.5磷酸緩沖液的浸提液基本保持起始時的顏色，雌雄株浸提液顏色始終無明顯差異，不能達(dá)到區(qū)分雌雄株的目的；ΡΗ6.0磷酸緩沖液的浸提液，雖然起始時的顏色已接近變色臨界點，卻不能使顏色變化的進(jìn)程提早，情況基本與對照一致。但是以ΡΗ6.6磷酸緩沖液浸提，不僅雌雄株浸提液出現(xiàn)顏色差異的時間提前，從而為觀察提供了足夠的時間。因此，ΡΗ6.6磷酸緩沖液為優(yōu)選磷酸緩沖液。實施例2 —種銀杏幼苗雌雄株的鑒別方法 一、步驟如下:
(一)材料的準(zhǔn)備:
1)選取銀杏幼苗生長健壯的葉片；
2)葉片經(jīng)流水沖洗4-5min；
3)吸干水分；
4)用保鮮袋密封；
5)4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> (二)檢測方法:
1)制備磷酸緩沖液，方法如下:將NaH2PO4.H2O 27.8g加水配成IOOOml溶液，Na2HPO4.7H20 53.65g 加水配成 IOOOml 溶液；取 62.5ml NaH2PO4.H2O 溶液和 37.5mlNa2HPO4.7H20溶液混合，加水稀釋至200ml，得濃度為0.2mol/L, pH為6.6的磷酸緩沖液；
2)稱取0.5-1.0 g銀杏葉片，剪碎；
3)加入4-5ml磷酸緩沖液，冰浴研磨呈勻漿；
4)室溫下浸提1-1.5 h ；
5)浸提液在5000rpm離心5 min ；
6)取上清液2ml，加入0.1%溴麝香草酚藍(lán)4-5ml，混勻； 7)置于30°C溫度下，觀察浸提液顏色變化所需時間的長短，并每隔15min記錄銀杏浸提液的顏色變化；
(三)根據(jù)浸提液顏色變化判定雌雄株，具體方法為:
1)銀杏浸提液在加入溴麝香草酚藍(lán)液后均呈藍(lán)綠色，隨著時間的不斷延長，在IOmin內(nèi)由藍(lán)綠色轉(zhuǎn)至綠色，銀杏雌雄浸提液變化沒有差異；
2)在15-25min后開始出現(xiàn)差異，若為雌株浸提液由綠色轉(zhuǎn)為黃綠色，雄株浸提液仍為綠色，Ih左右差異明顯，若為雌株浸提液呈黃褐色，若為雄株浸提液仍呈綠色；
3)3-4h后兩者都呈黃色,差異消失。二、實驗結(jié)果
1、形態(tài)鑒別法采用:
(I)雌株主枝在主干上著生角度大，向四面展開，有時下垂；雄株主枝在主干上著生角度小、挺直向上。(2)雌株樹冠形成早，為圓頭形，頂端平或稍有突起；雄株樹冠形成遲，常呈塔形。(3)雌株葉裂較少、較淺，不達(dá)葉之中部；雄株葉裂較深、缺刻超過葉的中部。2、結(jié)論
①用本發(fā)明的方法和形態(tài)鑒別法分別對50株20年生成熟銀杏已知的雌雄株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明:形態(tài)鑒別法準(zhǔn)確率為95%。形態(tài)鑒別法經(jīng)驗性強，即使經(jīng)驗豐富的人員也很難準(zhǔn)確鑒別，而且銀杏雌雄株苗期形態(tài)差異不大，無法進(jìn)行外部形態(tài)鑒別。而采用本發(fā)明以溴麝香草酚藍(lán)液進(jìn)行顯色反應(yīng)的方法準(zhǔn)確率為100%。②用本發(fā)明的方法對50株3年生銀杏幼苗已知雌雄株進(jìn)行鑒定，準(zhǔn)確率為100%。
權(quán)利要求
1.一種銀杏幼苗雌雄株的鑒別方法，其特征在于包括如下步驟: (一)材料的準(zhǔn)備:取銀杏幼苗葉片，洗凈，吸干水分，備用； (二)檢測: 1)稱取0.5-1.0 g銀杏幼苗葉片，剪碎； 2)加入4-5ml磷酸緩沖液，冰浴研磨呈勻漿； 3)室溫下浸提1-1.5 h ； 4)浸提液在5000rpm離心5 min ； 5)取上清液2ml，加入0.1%溴麝香草酚藍(lán)4-5ml，混勻； 6)置于30°C溫度下，觀察浸提液顏色變化的時間。
2.如權(quán)利要求1所述的一種銀杏幼苗雌雄株的鑒別方法，其特征在于:所述的磷酸緩沖液的pH為6.6。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種銀杏幼苗雌雄株的鑒別方法，其特征在于:根據(jù)浸提液顏色變化判定雌雄株，具體方法為: O銀杏浸提液在加入溴麝香草酚藍(lán)液后均呈藍(lán)綠色，隨著時間的不斷延長，在IOmin內(nèi)由藍(lán)綠色轉(zhuǎn)至綠色，銀杏雌雄浸提液變化沒有差異； 2)在15-25min后開始出現(xiàn)差異，若為雌株浸提液由綠色轉(zhuǎn)為黃綠色，雄株浸提液仍為綠色，Ih左右差異明顯，若為雌株浸提液呈黃褐色，若為雄株浸提液仍呈綠色； 3)3-4h后兩者都呈黃色,差異消失。
全文摘要
本發(fā)明提供一種銀杏幼苗雌雄株的鑒別方法。主要針對城市園林綠化中銀杏幼苗雌雄株苗期的鑒別。通過配制磷酸緩沖液，利用溴麝香草酚藍(lán)液的顯色反應(yīng)，加之苗期適宜的處理，保障了銀杏幼苗雌雄株早期的鑒別所需要的各種條件。經(jīng)過銀杏幼苗雌雄株的研磨、浸提、離心等步驟，提供一種可在城市園林綠化的生產(chǎn)實踐中大面積應(yīng)用，既可解決銀杏幼苗雌雄株鑒別難題，又可操作簡便、準(zhǔn)確率高、縮短鑒別時間、節(jié)約成本的有效方法。
文檔編號G01N21/25GK103149159SQ201310047438
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者李悅, 陳忠林, 張利紅, 侯偉, 徐蘇男 申請人:遼寧大學(xué)