專利名稱：一種提高生物發(fā)光分析方法靈敏度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)分析領(lǐng)域，更確切的說(shuō)是一種新的提高熒光素酶生物化學(xué)分析靈敏度的方法。該發(fā)明也包含實(shí)施該生物化學(xué)分析方法所需的試劑包。
背景技術(shù)：
微生物的檢測(cè)無(wú)論是在臨床檢測(cè)還是在工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域都具有重要的意義。當(dāng)前，對(duì)微生物的檢測(cè)主要采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法，該方法需要較長(zhǎng)的時(shí)間對(duì)微生物在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)，然后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)獲取微生物的濃度。該方法步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，很多時(shí)候難以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求。ATP生物熒光檢測(cè)法是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種新的微生物檢測(cè)方法，它具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等諸多優(yōu)點(diǎn)。ATP(adenosine triphosphate,中文三磷酸腺苷)作為重要的能量分子存在于所有的生物體內(nèi)，通過(guò)測(cè)定一定條件下ATP的數(shù)量，可以間接推斷微生物的數(shù)量或濃度。ATP生物熒光檢測(cè)法利用微生物細(xì)胞內(nèi)的三磷酸腺苷(ATP)與熒光素-熒光素酶間的復(fù)雜生化反應(yīng)，產(chǎn)生生物熒光，然后通過(guò)熒光測(cè)定儀或液閃測(cè)定儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。在熒光素、熒光素酶、溫度、PH等外界條件相同的情況下，上述熒光強(qiáng)度與ATP的數(shù)量成正比關(guān)系。
熒光素酶+Mg2+
ATP+熒光素+O2 - AMP+ PPi+氧化熒光素+光 在進(jìn)行上述生光反應(yīng)以測(cè)試ATP的數(shù)量之前，首先需要通過(guò)一定的物理、化學(xué)手段打破細(xì)胞壁和細(xì)胞膜以釋放ATP。但是，物理方法如機(jī)械擠壓、煮沸、超聲等方法繁瑣，有時(shí)還較為昂貴，因此，通常采用化學(xué)手段釋放ATP。常用的化學(xué)手段包括各種釋放劑，如表面活性劑、酸、堿，甚至有機(jī)溶劑等。上述釋放反應(yīng)中的釋放液除了滿足對(duì)ATP釋放的目的外，還應(yīng)具有如下兩種作用:一是應(yīng)迅速鈍化釋放過(guò)程中細(xì)胞ATP分解酶，減少或消除其對(duì)ATP的分解作用；二是不能對(duì)后續(xù)生光反應(yīng)中的熒光素酶帶來(lái)不利影響。上述對(duì)釋放液滿足生物酶所具有的兩種截然相反效果的要求導(dǎo)致對(duì)釋放液的選擇很難兩全，通常是兼顧二者要求妥協(xié)后的成分，從而降低了生物發(fā)光檢測(cè)的靈敏度。迄今，已經(jīng)提出了幾種上述問(wèn)題的解決方法。例如，常用的解決方法之一是對(duì)釋放ATP后的溶液在反應(yīng)前先稀釋到一定濃度(如50倍稀釋)，以降低釋放劑的濃度，減輕釋放液對(duì)熒光素酶的影響。但是，這種方法不能過(guò)分稀釋，否則會(huì)減低ATP反應(yīng)的檢測(cè)靈敏度，導(dǎo)致兩難。美國(guó)專利(U.S.Pat.N0.5，558，986)采用環(huán)糊精解決釋放劑對(duì)熒光素酶的抑制作用。環(huán)糊精具有錐形結(jié)構(gòu)，外表面親水而內(nèi)表面憎水，通過(guò)將微生物破壁后的釋放劑收容于環(huán)糊精的空腔，可以有效減輕后續(xù)生光過(guò)程中對(duì)熒光素酶的活性抑制作用。但是，環(huán)糊精自身價(jià)格較高，效果有限，且需要額外的加入環(huán)糊精步驟，較為繁瑣。美國(guó)專利(U.S.Pat.N0.7，829，280)采用不溶性樹(shù)脂沉淀破壁后的釋放劑以達(dá)到減低釋放液對(duì)熒光素酶抑制作用的目的。但是，該方法仍然需要額外的加入步驟，此外，還存在需要添加量大，成本高，操作不易等缺點(diǎn)。因此，尋找一種更為簡(jiǎn)便易行、有效的兼顧ATPase抑制和熒光素酶保護(hù)的方法，將對(duì)生物發(fā)光分析方法的提高和推廣具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有ATP生物熒光檢測(cè)中細(xì)胞釋放液即離子型表面活性劑對(duì)細(xì)胞釋放過(guò)程中對(duì)三磷酸腺苷分解酶的抑制和生光過(guò)程中對(duì)熒光素酶的保護(hù)發(fā)光反應(yīng)中熒光素酶活性抑制的問(wèn)題，提供一種有效的兼顧二者要求的檢測(cè)方法和檢測(cè)用試劑盒。本申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，ATP釋放用的離子表面活性劑(包括陽(yáng)離子表面活性劑和陰離子表面活性劑)在過(guò)量的情況下形成膠束，可以與具有相反電荷的植物多糖衍生物形成單一相，其原理主要是通過(guò)表面活性劑與植物多糖衍生物憎水段的相互作用，達(dá)到植物多糖衍生物在表面活性劑膠束作用下溶解，從而形成均一相；上述均一相稀釋到一定濃度下后，表面活性劑不能形成膠束，表面活性劑的親水端(帶有電荷)可以與植物多糖衍生物所具有的相反電荷作用，導(dǎo)致絮凝，從而極大地減低溶液中表面活性劑的濃度。利用上述原理，在細(xì)胞釋放段采用高濃度的表面活性劑，保證細(xì)胞釋放過(guò)程中對(duì)ATP的有效釋放和ATP分解酶的快速淬滅，細(xì)胞釋放完畢后，對(duì)上述釋放液進(jìn)行稀釋，利用多糖的離子電荷將表面活性劑絮凝減低其濃度，以極大降低表面活性劑對(duì)后續(xù)生光反應(yīng)中熒光素酶的影響。上述方法可以極大地提高細(xì)胞樣品熒光生物化學(xué)分析的檢測(cè)靈敏度。本發(fā)明提供的高靈敏度生物發(fā)光檢測(cè)方法的檢測(cè)步驟是:I)制備細(xì)胞釋放液，該釋放液含有高濃度的離子表面活性劑和與表面活性劑具有相反電荷的離子植物多糖衍生物，獲得第一種混合液；2)混合第一種混合液與細(xì)胞樣品，釋放ATP，獲得第二種混合液；3)將第二種混合液稀釋，直至出現(xiàn)絮凝，取上層清夜，獲得第三種混合液；4)將第三種混合液與熒光素-熒光素酶混合進(jìn)行生物發(fā)光檢測(cè)；第一種混合液中所用的離子表面活性劑包括各種陰離子或陽(yáng)離子表面活性劑以及各自之間的混合物。典型的陰離子表面活性劑包括羧酸鹽表面活性劑、硫酸鹽表面活性齊U、磷酸鹽表面活性劑、磺酸鹽表面活性劑以及它們的混合物；典型的陽(yáng)離子表面活性包括胺鹽表面活性劑、季銨鹽表面活性劑、雜環(huán)類表面活性劑以及它們的混合物等。第一種混合液中所用的離子植物多糖衍生物中所指的植物多糖是植物細(xì)胞代謝產(chǎn)生的聚合度超過(guò)10個(gè)的聚糖，是由許多相同或不同的單糖以a —或β —糖苷鍵所組成的化合物；將上述植物多糖通過(guò)各種化學(xué)的或物理的手段衍生化，獲得離子植物多糖衍生物。上述離子植物多糖衍生物可以通過(guò)市售或?qū)嶒?yàn)室合成獲得。陽(yáng)離子化或陰離子化的各種離子植物多糖衍生物均可以作為絮凝表面活性劑的有效成分，典型的離子植物多糖包括海藻膠、豆科植物膠、微生物代謝膠、果膠、蛋白質(zhì)膠、纖維素膠、甘露膠、淀粉以及它們的混合物等；典型的陰離子植物多糖衍生物包括羧酸鹽衍生物、硫酸鹽衍生物、磷酸鹽衍生物、磺酸鹽衍生物以及它們的混合物；典型的陽(yáng)離子植物多糖衍生物包括胺鹽衍生物、季銨鹽衍生物、雜環(huán)類陽(yáng)離子衍生物以及它們的混合物等。上述離子植物多糖衍生物可以結(jié)合稀釋劑、酶抑制中和劑、螯合劑、環(huán)糊精、糊精及它們的混合物使用。
在第一種混合液中，所用的離子表面活性劑的優(yōu)先濃度為0.1% 10% ;離子植物多糖的優(yōu)先濃度為0.01% 10%，更為優(yōu)先濃度為0.05 I %，優(yōu)先電荷密度為0.1 7meq/g。本發(fā)明還提供了執(zhí)行上述高靈敏度生物發(fā)光檢測(cè)方法的試劑盒，包括I)細(xì)胞釋放液(1-1OOmL)，該釋放液含有高濃度離子表面活性劑和與表面活性劑具有相反電荷的離子植物多糖衍生物；2)生物發(fā)光試劑(1-1OOmL) ；3)檢測(cè)用緩沖液；4)ATP標(biāo)準(zhǔn)液(1-500 μ L) ；5)其它試劑。上述提到的化學(xué)試劑盒可以應(yīng)用于生物化學(xué)分析，如熒光素酶分析、酶分析、核酸分析、免疫分析等。


圖1示出了在細(xì)菌樣品條件下釋放試劑組中添加與未添加陽(yáng)離子植物多糖衍生物(3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨瓜兒膠)對(duì)ATP熒光強(qiáng)度的影響。圖2示出了在細(xì)菌樣品條件下釋放劑組中添加與未添加陰離子植物多糖衍生物(羧甲基纖維素)對(duì)ATP熒光強(qiáng)度的影響。圖3示出了在ATP標(biāo)準(zhǔn)液樣品條件下釋放試劑組中添加與未添加陽(yáng)離子植物多糖衍生物(3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨瓜兒膠)對(duì)ATP熒光強(qiáng)度的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。但是，應(yīng)該明白，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:針對(duì)現(xiàn)有的生物發(fā)光分析方法中，細(xì)胞釋放液不能兼顧鈍化細(xì)胞ATP釋放酶和保護(hù)熒光素酶的缺點(diǎn)，利用釋放液中離子表面活性劑與相反電荷的離子植物多糖衍生物間在不同濃度下相互作用及結(jié)果的不同，既實(shí)現(xiàn)了對(duì)三磷酸腺苷釋放酶(ATPase)的抑制又減低了對(duì)熒光素酶的負(fù)面作用，無(wú)需采用妥協(xié)方法；本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)還在于實(shí)現(xiàn)上述兼顧優(yōu)點(diǎn)可以在不增加額外操作步驟的情況下實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例1采用大腸桿菌樣品(lxl08CFU/mL)進(jìn)行離子植物多糖衍生物有效性的驗(yàn)證。首先構(gòu)建生物發(fā)光試劑盒，如下:細(xì)胞ATP釋放試劑組(LY-Ol)由以下成分組成:Tricine (pH7.8): IOmM脫氧膽酸鈉:2%EDTA:0.15mMATP發(fā)光試劑組(L L-Ol)由以下成分組成::蟲(chóng)突光素酶:5mg/mL蟲(chóng)突光素:1.5mM
Tricine (pH7.8):20mMMg2+:20mM牛血清蛋白:0.5%EDTA:50mMDTT:1mM取大腸桿菌樣品50 μ L，分別加入含有O %、0.4%的陽(yáng)離子植物多糖衍生物(3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨瓜兒膠，簡(jiǎn)稱“陽(yáng)離子瓜兒膠”)的三磷酸腺苷釋放試劑組(LY-Ol) 50 μ L，釋放時(shí)間4min，稀釋10倍，取上清液100 μ L，加入三磷酸腺苷發(fā)光試劑組(LL-Ol) 100 μ L，用微量熒光檢測(cè)儀(北京濱松光子股份的9504型熒光檢測(cè)儀)立即檢測(cè)熒光強(qiáng)度，記錄熒光值。結(jié)果如圖1示。檢測(cè)結(jié)果顯示了添加陽(yáng)離子瓜兒膠的三磷酸腺苷釋放試劑在同等發(fā)光試劑條件下具有遠(yuǎn)高于未添加陽(yáng)離子瓜兒膠的發(fā)光強(qiáng)度，證明了其對(duì)ATP分解酶的抑制作用。實(shí)施例2
細(xì)胞ATP釋放試劑組(LY-02)由以下成分組成:Tricine (pH7.8): IOmM十六烷基三甲基溴化銨(CTAB):1.5%EDTA:0.15mMATP發(fā)光試劑組(LL-02)由以下成分組成::蟲(chóng)熒光素酶:3mg/mL蟲(chóng)熒光素:3mMTricine (pH7.8):20mMMg2+:20mM牛血清蛋白:0.5%DTT: ImMEDTA:50mM取大腸桿菌樣品50yL，分別加入含有0%、0.4%的羧甲基纖維素鈉(CMC)的三磷酸腺苷釋放試劑組(LY-02) 50 μ L，釋放時(shí)間4min，稀釋10倍，取上清液100 μ L，加入三磷酸腺苷發(fā)光試劑組(LL-02) 100 μ L，用微量熒光檢測(cè)儀(北京濱松光子股份的9504型熒光檢測(cè)儀)立即檢測(cè)熒光強(qiáng)度，記錄熒光值。結(jié)果如圖2示。檢測(cè)結(jié)果顯示了添加羧甲基纖維素鈉的三磷酸腺苷釋放試劑在同等發(fā)光試劑組條件下具有遠(yuǎn)高于未添加羧甲基纖維素鈉的發(fā)光強(qiáng)度，證明了其對(duì)ATP分解酶的抑制作用。實(shí)施例3配制ATP 標(biāo)準(zhǔn)液:lxl(T7mol/L。細(xì)胞ATP釋放試劑組(LY-03)由以下成分組成:Tricine (pH7.8): IOmM脫氧膽酸鈉:2%EDTA:0.15mMATP發(fā)光試劑組(LL-03)由以下成分組成::
蟲(chóng)熒光素酶:lmg/mL蟲(chóng)突光素:2mMTricine (pH7.8):20mMMg2+:20mM牛血清蛋白:0.5%DTT:1mMEDTA:50mM取ATP標(biāo)準(zhǔn)液50 μ L，分別加入含有O %、0.4 %的陽(yáng)離子瓜兒膠的三磷酸腺苷釋放試劑組(LY-03)50yL，稀釋10倍，取上清液100 μ L，加入三磷酸腺苷發(fā)光試劑組(LL-03) 100yL，用微量熒光檢測(cè)儀(北京濱松光子股份的9504型熒光檢測(cè)儀)立即檢測(cè)熒光強(qiáng)度，記錄熒光值。結(jié)果如圖3示。檢測(cè)結(jié)果顯示了添加陽(yáng)離子瓜兒膠的三磷酸腺苷釋放試劑在同等發(fā)光試劑組條件下具有遠(yuǎn)高于未添加陽(yáng)離子瓜兒膠的發(fā)光強(qiáng)度，證明了其對(duì)熒光素酶抑制的減低作用。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種提高生物發(fā)光分析方法靈敏度的方法，其特征在于執(zhí)行生物發(fā)光分析過(guò)程中，在含有離子表面活性劑的細(xì)胞釋放液中添加帶有相反電荷的離子植物多糖衍生物，利用離子表面活性劑與相反電荷的離子植物多糖衍生物間在不同濃度下相互作用及結(jié)果的不同，同時(shí)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞釋放過(guò)程中對(duì)三磷酸腺苷分解酶的抑制和生光過(guò)程中對(duì)熒光素酶的保護(hù)作用，提高生物發(fā)光分析方法的靈敏度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于細(xì)胞釋放液中離子表面活性劑與相反電荷的離子植物多糖衍生物指的是:陰離子表面活性劑與陽(yáng)離子植物多糖衍生物體系，或者陽(yáng)離子表面活性劑與陰離子植物多糖衍生物體系。
3.權(quán)利要求1所述的離子表面活性劑與相反電荷的離子植物多糖衍生物間在不同濃度下相互作用及結(jié)果的不同指的是:離子表面活性劑在一定濃度下形成膠束，離子表面活性劑與離子植物多糖衍生物間通過(guò)表面活性劑的膠束作用以及它們間憎水段的相互作用，使得植物多糖衍生物溶解而形成均一相；上述均一相稀釋到一定濃度后，表面活性劑的濃度不足以形成膠束，表面活性劑親水端帶有的電荷與離子植物多糖衍生物所帶有的相反電荷作用，產(chǎn)生絮凝和沉淀。
4.權(quán)利要求1中所述的同時(shí)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞釋放過(guò)程中對(duì)ATP分解酶的抑制和生光過(guò)程中對(duì)熒光素酶的保護(hù)作用指的是:利用權(quán)利要求1和3中所述的離子表面活性劑與相反電荷的離子植物多糖衍生物間在不同濃度下相互作用及結(jié)果的不同，在細(xì)胞釋放階段，細(xì)胞釋放液為高濃度的均一相，實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP分解酶的強(qiáng)烈抑制作用；待細(xì)胞釋放完畢后，對(duì)上述釋放后溶液稀釋，絮凝其中的釋放劑及其它雜質(zhì)，減低釋放劑及其它雜質(zhì)對(duì)生光過(guò)程中熒光素酶的抑制作用。
5.權(quán)利要求1和2所指的離子表面活性劑指的是所有適用于細(xì)胞釋放用的離子表面活性劑，包括陰離子表面活性劑和陽(yáng)離子表面活性劑。陰離子表面活性劑包括但不限于羧酸鹽表面活性劑、硫酸酯鹽表面活性劑、磷酸酯鹽表面活性劑、磺酸鹽表面活性劑以及它們的混合物；陽(yáng)離子表面活性劑包括但不限于季銨鹽表面活性劑、胺鹽型表面活性劑、雜環(huán)類表面活性以及它們的混合物。
6.權(quán)利要求1和2中所述的離子植物多糖衍生物中的植物多糖指的是植物細(xì)胞代謝產(chǎn)生的聚糖，是由許多相同或不同的單糖以α —或β —糖苷鍵所組成的化合物，包括但不限于海藻膠、豆科植物膠、微生物代謝膠、果膠、蛋白質(zhì)膠、纖維素膠、甘露膠、淀粉以及它們的混合物；該出所指的衍生物指的是通過(guò)對(duì)上述植物多糖進(jìn)行各種衍生化反應(yīng)而獲得的各種衍生植物多糖，包括陰離子植物多糖和陽(yáng)離子植物多糖。陰離子植物多糖包括但不限于羧酸鹽植物多糖、硫酸酯鹽植物多糖、磷酸酯鹽植物多糖、磺酸鹽植物多糖以及它們的混合物；陽(yáng)離子植物多糖包括但不限于季銨鹽植物多糖、胺鹽型植物多糖、雜環(huán)類表面活性以及它們的混合物。
7.本發(fā)明還提供了一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述方法配套構(gòu)建的細(xì)胞釋放液試劑，其特征在于該釋放液含有權(quán)利要求5中所指的離子表面活性劑和權(quán)利要求6中所指的帶有相反電荷的離子植物多糖衍生物。
8.按權(quán)利要求書(shū)7所述的試劑中離子表面活性劑的濃度為0.1% 10%。
9.按權(quán)利要求書(shū)7所述的試劑中離子植物多糖的濃度為0.01 % 99%，所帶電荷密度為 0.1 7meq/g。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的提高生物發(fā)光分析方法靈敏度的方法。本方法針對(duì)現(xiàn)有的生物發(fā)光分析方法中，細(xì)胞三磷酸腺苷(ATP)釋放劑(離子表面活性劑)不能同時(shí)有效地鈍化細(xì)胞ATP分解酶(ATPase)和保護(hù)熒光素酶(luciferase)的缺點(diǎn)，在ATP釋放液中添加帶有與離子表面活性劑相反電荷的離子植物多糖衍生物，利用離子表面活性劑與相反電荷的離子植物多糖衍生物間在不同濃度下相互作用及結(jié)果的不同，同時(shí)實(shí)現(xiàn)ATP釋放過(guò)程中對(duì)三磷酸腺苷分解酶的抑制和對(duì)熒光素酶的保護(hù)作用，提高生物發(fā)光分析方法靈敏度。本發(fā)明還包括了實(shí)現(xiàn)上述方法所配套構(gòu)建的化學(xué)試劑。
文檔編號(hào)G01N21/76GK103175826SQ201310047919
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者萬(wàn)冬云 申請(qǐng)人:萬(wàn)冬云