專利名稱：新型三聚氰胺抗原和抗體及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于小分子化合物免疫化學和殘留分析技術領域；涉及有機合成、免疫化學、生物化學以及物化測試技術等，特別涉及三聚氰胺半抗原、人工抗原、酶標抗原的設計合成和免疫動物、特異性抗體的制備及免疫分析方法的建立，尤其是一種新型三聚氰胺抗原和抗體及應用。
背景技術：
三聚氰胺(melamine)是一種在常用的化學原料，與甲醛縮合聚合可制得三聚氰胺樹脂，可用于塑料及涂料工業(yè)，也可作紡織物防摺、防縮處理劑。三聚氰胺改性樹脂可做色澤鮮艷、耐久、硬度好的金屬涂料，三聚氰胺還可用于堅固、耐熱裝飾薄板，防潮紙及灰色皮革鞣皮劑，合成防火層板的粘接劑，防水劑的固定劑或硬化劑等。三聚氰胺被非法添加至乳制品中以提高其含氮量，從而在用凱氏定氮法測量蛋白含量時獲得較高的蛋白濃度。人如果長期攝入會導致人體泌尿系統(tǒng)膀胱、腎產生結石，并可誘發(fā)膀胱癌。世界各國都制定了三聚氰胺的限量標準，我國參照AOAC制定的標準制定了我國的限量標準:嬰兒配方奶粉中嬰兒配方食品中限量值為lmg/kg，其他普通食品中的限量值為2.5mg/kg。由于三聚氰胺屬于小分子物質，目前的檢測方法包括液相色譜法、液相色譜-質譜/質譜法，氣相色譜-質譜法等，這些方法具有成本較高、分析速度慢，難以滿足大通量的實際需要，因此迫切要求發(fā)展簡便、快速、靈敏的分析技術。三聚氰胺作為一種分子量僅有126的小分子化合物，其免疫分析方法與大分子的免疫分析方法存在較大不同。⑴三聚氰胺本身不具有免疫原性，不能直接免疫動物產生特異性抗體、必須合成突出分子立體結構特異性部位的半抗原，并與大分子載體連接構成接合物，才能免疫動物并產生針對這一目標小分子化合物的特異性抗體。這種半抗原與大分子載體的結合物稱為人工抗原。人工抗原的制備不是任意的，包括結合位點、結合方式、載體種類、以及半抗原與目標分析物任何結構上的差異如大小、形狀、成份、構型、構象、極性、電子云密度等等在內的諸因素，都可能極大地影響著相應抗體的性質，因此它們是決定產生其特異性抗體和建立免疫分析方法的關鍵。⑵雖然小分子化合物不具有免疫原性，但具有反應原性，即具有與相應抗體發(fā)生免疫學反應的能力，并可體外定量進行，遵循質量作用定律。⑶基于抗原抗體免疫反應檢測小分子化合物的分析技術，目前多采用酶聯免疫分析(ELISA)。利用酶促反應顯示抗原抗體的定量結合，操作簡單，又具有相當的靈敏度。小分子化合物依靠 免疫學、免疫化學基本原理和生物技術手段。該技術研究的關鍵是半抗原的分子設計、合成和人工全抗原及抗體的制備。因此，目標分析物分子免疫學特性，以及如何通過化學或生化技術突出和利用這些特性，是該領域重要的研究內容。這一技術目前已成為微量分析研究的一個嶄新領域，可與傳統(tǒng)分析方法并列作為一項新的分析途徑。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種新型三聚氰胺抗原和抗體及應用，設計合成具有氯甲基結構的三聚氰胺類似物，在此基礎上合成三聚氰胺半抗原、人工抗原和酶標抗原，其創(chuàng)新之處在于利用該氯甲基結構與3-巰基丙酸反應接臂制備半抗原，避免了傳統(tǒng)的以三聚氰胺為原料直接合成半抗原過程中反應位點無法控制的缺點。本方法合成的人工抗原免疫動物產生了特異性很高的抗體，并以此為基礎建立了 ELISA方法，可以快速、準確檢測三聚氰胺。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現的:一種三聚氰胺半抗原前體，結構式如下:
權利要求
1.一種三聚氰胺半抗原前體，其特征在于:結構式如下:
2.—種三聚氰胺半抗原，其特怔在于:結構式如下:
3.如權利要求2所述的三聚氰胺半抗原在制備三聚氰胺抗原中的應用。
4.一種三聚氰胺人工抗原，其特征在于:結構式如下:
5.一種如權利要求4所述的三聚氰胺人工抗原經動物免疫后獲得的三聚氰胺抗體。
6.權利要求5所述的三聚氰胺抗體在檢測三聚氰胺方法中或檢測三聚氰胺試劑中的應用。
7.—種三聚氰胺的酶標抗原，其特征在于:結構式如下:
8.權利要求7所述的三聚氰胺的酶標抗原在檢測三聚氰胺方法或檢測三聚氰胺試劑中的應用。
9.一種三聚氰胺的免疫檢測方法，其特征在于:方法如下: 包被:將權利要求5所述的抗體溶于50mmol、pH9-10的碳酸鹽緩沖液中， 配制成10 μ g/mL的包被液，酶標板每孔加100 μ I包被液4°C孵育12-16小時，將包被好酶標板的每個孔，用磷酸鹽緩沖液加0.05%v/v Tween20洗液PBST洗滌三次； 封閉:每孔加入200 μ 1,0.5%脫脂乳粉/PBS封閉液，封閉Ih ； 加樣:將待測樣品溶于磷酸鹽緩沖液PBS中，加樣時每孔加入50 μ I標樣； 競爭反應:將權利要求7所述的酶標抗原溶于PBS緩沖液中，加入待測樣品或標樣后，每孔加入50 μ I酶標抗原溶液，孵育Ih后用PBST洗滌三次； 顯色:顯色底物使用四甲基聯苯胺，將5mg四甲基聯苯胺溶于Iml PBS緩沖液中，配制成濃度為0.1%的底物溶液，顯色時每孔加入150 μ I的底物溶液和5 μ I雙氧水，顯色15分鐘后每孔加入50 μ 15mol /L的硫酸終止；反應液在酶標儀上讀數。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型三聚氰胺抗原和抗體及應用，采用雙胍與氯乙酸乙酯在甲醇鈉條件下合成6-氯甲基-1,3,5-三嗪-2,4-二氨基，再與3-巰基丙酸反應得到半抗原3-((4,6-二氨基-1,3,5-三嗪-2-基)-甲硫基)丙酸，采用活化酯法偶聯蛋白得到人工抗原，經動物免疫、取血、分離抗血清、純化制得三聚氰胺抗體。本合成方法合理，線路簡單，半抗原最大限度的與目標物一致。制備的三聚氰胺抗體靈敏度高，完全滿足三聚氰胺快速檢測的需要。
文檔編號G01N33/543GK103145633SQ20131004886
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月6日 優(yōu)先權日2013年2月6日
發(fā)明者王碩, 劉冰, 史小文 申請人:天津科技大學