專利名稱：一種水產(chǎn)品中組胺的快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組胺的檢測(cè)方法，尤其是涉及一種水產(chǎn)品中組胺的快速檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
組胺是一種具有生物活性的低分子含氮有機(jī)化合物，普遍存在于各類食品如發(fā)酵制品、乳制品、酒類、水產(chǎn)品及其制品中，尤其水產(chǎn)品最為突出。組胺作為人體內(nèi)的一種化學(xué)傳導(dǎo)物質(zhì)，通過(guò)與細(xì)胞膜上的兩類受體(Hl和H2)作用而發(fā)揮毒性，如食入過(guò)量組胺，輕者引起過(guò)敏反應(yīng)，重者將危機(jī)生命。一些蛋白含量較高的中上層魚(yú)類如金槍魚(yú)、鯖魚(yú)、秋刀魚(yú)等，若在其死后不加以合理控制，極易產(chǎn)生組胺，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的組胺中毒事件多發(fā)生在此類魚(yú)中。同時(shí)，水產(chǎn)品中以鮐鰺、鯖魚(yú)等易產(chǎn)組胺的中上層魚(yú)類為原料的產(chǎn)品，因?yàn)榻M胺含量超標(biāo)而被禁止出口的事件近年來(lái)時(shí)有發(fā)生，給水產(chǎn)品出口貿(mào)易帶來(lái)很大影響。因此，為確保水產(chǎn)食品食用安全，促進(jìn)水產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易，亟需一個(gè)快速、精確、可靠的組胺檢測(cè)方法。目前，水產(chǎn)品中組胺的檢測(cè)方法主要包括HPLC法、毛細(xì)管電泳法、比色法、生化傳感器法、酶聯(lián)免疫法、薄層色譜法等。這些方法一般都需要進(jìn)行酸萃取，有機(jī)溶劑萃取等比較繁瑣的前處理過(guò)程及衍生化過(guò)程，使得這些分析方法復(fù)雜、費(fèi)時(shí)；薄層色譜雖然不需要昂貴設(shè)備，具有操作簡(jiǎn)單、快速、分析量大以及成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，但該法是半定量檢測(cè)方法，只能用于組胺的監(jiān)測(cè)及前期篩選。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種不需要復(fù)雜的前處理過(guò)程及繁瑣的衍生化過(guò)程，可進(jìn)行定性定量分析的簡(jiǎn)單快速的水產(chǎn)品中組胺的快速檢測(cè)方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為:一種水產(chǎn)品中組胺的快速檢測(cè)方法，具體包括以下步驟:
(1)將魚(yú)肉樣品在冰浴下用組織搗碎機(jī)充分勻漿后，將魚(yú)肉樣品加入到帶塞頂空樣品瓶中，然后加入5倍魚(yú)肉重量的蒸餾水、用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0-10.0，并加入氯化鈉固體使其含量達(dá)到30wt% ；
(2)將磁力攪拌吸附萃取棒加入步驟(I)的樣品瓶中，蓋上瓶蓋，在電磁攪拌器上于30-45 °C萃取0.5-3h，其中電磁攪拌速度為1000-1500r/Min ；
(3)萃取完畢，將磁力攪拌吸附萃取棒用蒸餾水沖洗干凈，用無(wú)塵吸水紙吸去磁力攪拌吸附萃取棒上的水分后，待用；
(4)組胺的分離分析 氣相色譜分析條件:
帶直接熱解析進(jìn)樣系統(tǒng)的氣相色譜儀Agilent6890氣相色譜儀；
色譜柱:具備溫度范圍為280°C以上的鍵合固定相毛細(xì)管柱；
熱解析進(jìn)樣系統(tǒng)一級(jí)熱解析溫度:280°C，時(shí)間5min，捕集溫度-20—-30°C，二級(jí)熱解析溫度280°C，時(shí)間3-5min，氫火焰離子化(FID)檢測(cè)器溫度300°C ；
色譜柱柱溫:150°C，保持2min ;然后以15°C /min的速度升溫至230°C，保留Imin，再以50°C /min的速度升溫至290°C,保留5min ；
(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立
采用內(nèi)標(biāo)法，在樣品中加入不同濃度的組胺標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)化合物1，9-壬二醇，在步驟
(4)的氣相色譜分析條件下，測(cè)出一系列不同濃度的組胺標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的組胺峰面積，并根據(jù)內(nèi)標(biāo)化合物校正峰面積后，確定組胺的含量與組胺峰面積的定量關(guān)系，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(6)樣品測(cè)定
根據(jù)上述步驟(I)- (4)獲得待測(cè)樣品的組胺峰面積，根據(jù)組胺的含量與組胺峰面積的定量關(guān)系，計(jì)算得到待測(cè)樣品中的組胺含量。所述的磁力攪拌吸附萃取棒表面設(shè)置有烯酸酯涂層(PA:Polyacrylate)或者乙二醇娃酮(EG- Silicone: Ethylene Glycol (EG)-Silicone)涂層。由于這兩個(gè)涂層是具有一定的極性，更適合組胺這種極性化合物的萃取。所述的色譜柱采用0V-1701，其長(zhǎng)X內(nèi)徑X膜厚度=30mX0.53mmXmmXl.5mm。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明公開(kāi)了一種水產(chǎn)品中組胺的快速檢測(cè)方法，采用無(wú)溶劑磁攪拌子吸附萃取技術(shù)結(jié)合在線熱解析進(jìn)樣和GC分離檢測(cè)技術(shù)直接對(duì)水產(chǎn)品中的組胺進(jìn)行定量分析。由于組胺的沸點(diǎn)高達(dá)209.5°C，一般不能直接進(jìn)行GC分析，需要進(jìn)行分離純化、再衍生化才能進(jìn)行分析，本方法利用磁攪拌子吸附萃取技術(shù)的特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)復(fù)雜水產(chǎn)品中的組胺的直接萃取，并通過(guò)使用耐高溫的鍵合相毛細(xì)管氣相色譜柱可實(shí)現(xiàn)高沸點(diǎn)化合物的分離， 能夠在不通過(guò)復(fù)雜的前處理過(guò)程及繁瑣的衍生化過(guò)程的情況下直接分析樣品中的組胺，檢測(cè)極限達(dá)到5(^g/kg，是一種簡(jiǎn)單快速、操作簡(jiǎn)便的無(wú)溶劑組胺萃取和無(wú)衍生化組胺分離檢測(cè)相結(jié)合的組胺定性定量檢測(cè)方法。


圖1為鯖魚(yú)樣品中組胺的含量與組胺峰面積的定量關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。具體實(shí)施例1
本發(fā)明一種水產(chǎn)品中組胺的快速檢測(cè)方法，具體包括以下步驟:
(1)將魚(yú)肉樣品在冰浴下用組織搗碎機(jī)充分勻漿后，將魚(yú)肉樣品加入到帶塞頂空進(jìn)樣瓶中，然后加入5倍魚(yú)肉重量的蒸餾水，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0-10.0，并加入NaCl固體使其含量達(dá)到30wt% (NaCl在魚(yú)肉樣品溶液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%)；
(2)將長(zhǎng)度為Icm的Twister磁力攪拌吸附萃取棒加入步驟(I)的樣品瓶中，蓋上瓶蓋，在電磁攪拌器上于30-45 °C萃取0.5-3h，電磁攪拌速度為1000-1500r/Min ；
(3)萃取完畢，將磁力攪拌吸附萃取棒用蒸餾水沖洗干凈，用無(wú)塵吸水紙吸去磁力攪拌吸附萃取棒上的水分，將磁力攪拌吸附萃取棒放入存儲(chǔ)器備用；
(4)組胺的分離分析 氣相色譜分析條件:帶直接熱解析進(jìn)樣系統(tǒng)的氣相色譜儀Agilent6890氣相色譜儀色譜柱:0V-1701 (長(zhǎng)X內(nèi)徑X膜厚度=30mX0.53mmXmmXl.5mm)，或其他同類型高溫穩(wěn)定性色譜柱。非極性柱、弱極性柱、中極性柱、應(yīng)用溫度范圍為280°C以上的鍵合固定相毛細(xì)管柱均可使用，其中中極性柱效果最好。熱解析系統(tǒng)一級(jí)熱解析溫度:280°C，5min，捕集溫度-20—-30°C，二級(jí)熱解析溫度280°C，3-5min，氫火焰離子化(FID)檢測(cè)器溫度300°C ;柱溫:150°C,2min ;以15。。/min升溫至230°C，保留lmin，再以50°C /min升溫至290°C ；
(5)組胺的定性，載與樣品分析相同條件下進(jìn)行組胺標(biāo)準(zhǔn)品分析，比較樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰進(jìn)行定性，并通過(guò)GC-MS進(jìn)行確認(rèn)；
(6)組胺的定性定量:采用內(nèi)標(biāo)法，在樣品中加入不同濃度的組胺標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)化合物1，9-壬二醇，在相同 條件下，測(cè)出添加、不添加標(biāo)準(zhǔn)化的樣品的中組胺峰面積，并根據(jù)內(nèi)標(biāo)化合物校正峰面積后，做出組胺的含量與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算同條件下待測(cè)樣品中組胺的含量。具體實(shí)施例2
本發(fā)明一種水產(chǎn)品中組胺的快速檢測(cè)方法同實(shí)施例1，其區(qū)別在于:
步驟(I)中魚(yú)肉樣品取市售鯖魚(yú)樣品，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為9.0 ;
步驟(2)中在電磁攪拌器上于38°C萃取1.5h，電磁攪拌速度為1250r/Min ；
步驟(4)中組胺的分離分析:
氣相色譜條件分析條件:
熱解析系統(tǒng)一級(jí)熱解析溫度:280°C，5min，捕集溫度_25°C，二級(jí)熱解析溫度280°C，4min，氫火焰離子化(FID)檢測(cè)器溫度300°C ;柱溫:150°C，2min ；以15°C /min升溫至230°C，保留 lmin，再以 50°C /min 升溫至 290°C，
通過(guò)實(shí)施例2的方法得到的組胺的含量與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。具體實(shí)施例3 檢測(cè)極限的測(cè)定
按照上述實(shí)施例1的方法，在步驟I中不加入樣品，而是加入逐漸稀釋的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，并依次按照上述實(shí)施例1中2-6步驟進(jìn)行分析，設(shè)定FID檢測(cè)器范圍為1，衰減為1，信噪比為3，直至稀釋到在該條件下檢測(cè)不到組胺的信號(hào)峰，能檢測(cè)到組胺信號(hào)峰所對(duì)應(yīng)的組胺標(biāo)準(zhǔn)品的濃度即為該方法的檢測(cè)極限，按照該方法測(cè)定的檢測(cè)極限約為5(^g/kg。具體實(shí)施例4 回收率試驗(yàn)
取市售鯖魚(yú)樣品4.0g，按照上述步驟I處理后，分別加入20、41、80、119、159Pg組胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照上述實(shí)施例2的方法，檢測(cè)組胺含量，未添加標(biāo)準(zhǔn)品的鯖魚(yú)組胺含量為47.5±2.3Pg，添加組胺標(biāo)準(zhǔn)品的樣品組胺含量分別為69.2±2.0 (變異系數(shù)CV 2.4%) μδ,90.4±3.1(CV 3.4%) μδ,126.3±11.2(CV8.9%) μδ,167.6±9.2(CV 5.5%) μδ,201.3±8.9(CV 4.4%) Pg，據(jù)此結(jié)果得到該方法的回收率分別為108.5%，104.6%, 97.3%，100.9%, 96.7%。說(shuō)明此檢測(cè)方法具有較高的回收率。具體實(shí)施例5
試驗(yàn)參數(shù)鹽含量對(duì)分析效果的影響 取市售鯖魚(yú)樣品4.0g，按照上述實(shí)施例2方法，其中步驟I分別采用加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的NaCl和不加NaCl兩種方式，測(cè)定組胺含量，每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5次重復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為，不加NaCl的樣品組胺含量為273±33 (CV 12.1%) Pg/kg，加NaCl的檢測(cè)結(jié)果為352±16 (CV4.5%) Pg/kg。說(shuō)明NaCl的加入能提高樣品的萃取率，顯著提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。具體實(shí)施例6 水產(chǎn)樣品中組胺含量的測(cè)定
取冰鮮鯖魚(yú)、將該樣品室溫空氣中放置24h、市售糟鯖魚(yú)、市售活蝦、蝦室溫放置24h，分別取上述5個(gè)樣品按照上述實(shí)施例1的檢測(cè)方法分析其組胺含量，結(jié)果為冰鮮鯖魚(yú)、室溫空氣中放置24h的鯖魚(yú)、市售糟鯖魚(yú)、市售活蝦、室溫放置24h的蝦的組胺含量分別為:31.3mg/kg,152.5mg/kg,253.2 mg/kg, 10lPg/kg,146Pg/kg。當(dāng)然，上述說(shuō)明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種水產(chǎn)品中組胺的快速檢測(cè)方法，其特征在于具體包括以下步驟: (1)將魚(yú)肉樣品在冰浴下用組織搗碎機(jī)充分勻漿后，將魚(yú)肉樣品加入到帶塞頂空樣品瓶中，然后加入5倍魚(yú)肉重量的蒸餾水、用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0-10.0，并加入氯化鈉固體使其含量達(dá)到30wt% ； (2)將磁力攪拌吸附萃取棒加入步驟(I)的樣品瓶中，蓋上瓶蓋，在電磁攪拌器上于30-45 °C萃取0.5-3h，其中電磁攪拌速度為1000-1500r/Min ； (3)萃取完畢，將磁力攪拌吸附萃取棒用蒸餾水沖洗干凈，用無(wú)塵吸水紙吸去磁力攪拌吸附萃取棒上的水分后，待用； (4)組胺的分離分析 氣相色譜分析條件: 帶直接熱解析進(jìn)樣系統(tǒng)的氣相色譜儀Agilent6890氣相色譜儀； 色譜柱:具備溫度范圍為280°C以上的鍵合固定相毛細(xì)管柱； 熱解析進(jìn)樣系統(tǒng)一級(jí)熱解析溫度:280°C，時(shí)間5min，捕集溫度-20—-30°C，二級(jí)熱解析溫度280°C，時(shí)間3-5min，氫火焰離子化(FID)檢測(cè)器溫度300°C ； 色譜柱柱溫:150°C，保持2min ;然后以15°C /min的速度升溫至230°C，保留Imin，再以50°C /min的速度升溫至290°C,保留5min ； (5)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 采用內(nèi)標(biāo)法，在樣品中加入不同濃度的組胺標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)化合物1，9-壬二醇，在步驟(4)的氣相色譜分析條件下，測(cè)出一系列不同濃度的組胺標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的組胺峰面積，并根據(jù)內(nèi)標(biāo)化合物校正峰面積后，確定組胺的含量與組胺峰面積的定量關(guān)系，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線； (6)樣品測(cè)定 根據(jù)上述步驟(I)- (4)獲得待測(cè)樣品的組胺峰面積，根據(jù)組胺的含量與組胺峰面積的定量關(guān)系，計(jì)算得到待測(cè)樣品中的組胺含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水產(chǎn)品中組胺的快速檢測(cè)方法，其特征在于:所述的磁力攪拌吸附萃取棒表面設(shè)置有烯酸酯涂層或乙二醇硅酮涂層。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水產(chǎn)品中組胺的快速檢測(cè)方法，其特征在于:所述的色譜柱采用0V-1701，其長(zhǎng)X內(nèi)徑X膜厚度=30mX0.53_X_X1.5_。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種水產(chǎn)品中組胺的快速檢測(cè)方法，特點(diǎn)是包括將魚(yú)肉樣品在冰浴下用組織搗碎機(jī)充分勻漿后，將魚(yú)肉樣品加入到帶塞試劑瓶中，然后加入5倍魚(yú)肉重量的蒸餾水以及氯化鈉，調(diào)節(jié)pH值為8.0-10.0的步驟；將磁力攪拌吸附萃取棒加入試劑瓶中，在電磁攪拌器上于45-60℃萃取0.5-3h的步驟；將磁力攪拌吸附萃取棒用蒸餾水沖洗干凈，吸去水分后，在線熱解析進(jìn)樣和GC分離檢測(cè)技術(shù)直接對(duì)水產(chǎn)品中的組胺進(jìn)行定量分析；最后根據(jù)組胺的含量與組胺峰面積的定量關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品中組胺含量的步驟，優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)單快速，不需要復(fù)雜的前處理過(guò)程及繁瑣的衍生化過(guò)程。
文檔編號(hào)G01N30/02GK103163239SQ20131005968
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月26日
發(fā)明者歐昌榮, 湯海青, 曹錦軒, 蘇秀榕, 賀林娟, 黃玲, 廖媛媛, 謝誠(chéng) 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)