專利名稱：一種基于受體傳感器檢測(cè)苦味物質(zhì)地那的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及一種基于受體傳感器用于液相環(huán)境中檢測(cè)苦味物質(zhì)地那的方法。
背景技術(shù)：
苦味物質(zhì)檢測(cè)在食品科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用，具有十分廣闊的應(yīng)用前景和市場(chǎng)開(kāi)發(fā)價(jià)值?？辔痘衔锏姆N類(lèi)多樣、結(jié)構(gòu)各異，給檢測(cè)帶來(lái)諸多困難。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是基于質(zhì)譜分析技術(shù)，所需儀器昂貴、操作復(fù)雜、分析檢測(cè)周期長(zhǎng)，難以滿足當(dāng)今對(duì)苦味物質(zhì)現(xiàn)場(chǎng)、快速檢測(cè)的需求。新興的生物傳感器為解決這一難題提供了新的技術(shù)途徑。但是目前用于苦味物質(zhì)檢測(cè)的生物傳感器多是利用類(lèi)脂膜、溴化物等材料作為敏感元件，存在特異性差、靈敏度低和不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，其應(yīng)用難以滿足特異性苦味物質(zhì)檢測(cè)的要求。因此，如何獲得高度特異的敏感元件，并實(shí)現(xiàn)敏感元件與二級(jí)傳感器的穩(wěn)定耦合是目前苦味物質(zhì)檢測(cè)傳感器進(jìn)一步發(fā)展亟需解決的難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于受體傳感器檢測(cè)苦味物質(zhì)地那的方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種基于受體傳感器檢測(cè)苦味物質(zhì)地那的方法，該方法包括以下步驟:
(1)制備苦味受體蛋白T2R4;
(2)將苦味受體蛋白T2R4固定在石英晶體微天平傳感器表面制成受體傳感器；
(3)將不含任何苦味物質(zhì)的水溶液泵入密閉的檢測(cè)腔內(nèi)，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)后，再將含有某一確定濃度的苦味物質(zhì)地那的溶液泵入檢測(cè)腔，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率再次穩(wěn)定后，諧振頻率的改變量即為此確定濃度的傳感器響應(yīng)值，最后再泵入不含任何苦味物質(zhì)的水溶液，清洗檢測(cè)腔，即完成一次檢測(cè)過(guò)程；至少間隔IOmin后，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率穩(wěn)定后，再泵入含有另一確定濃度的苦味物質(zhì)地那的溶液進(jìn)行下一次檢測(cè)；重復(fù)上述步驟，可以得到一系列苦味物質(zhì)地那的濃度對(duì)應(yīng)的傳感器諧振頻率改變量，得到地那濃度-諧振頻率改變量曲線；
(4)對(duì)于未知濃度的苦味物質(zhì)地那，首先將不含任何苦味物質(zhì)的水溶液泵入密閉的檢測(cè)腔內(nèi)，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)Ftl后，再將含有未知濃度的苦味物質(zhì)地那的待測(cè)溶液泵入檢測(cè)腔，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率穩(wěn)定到F1后，得到諧振頻率改變量F1- F0,最后根據(jù)上述步驟3得到的地那濃度-諧振頻率改變量曲線得到待測(cè)溶液中苦味物質(zhì)地那的濃度，實(shí)現(xiàn)液相中苦味物質(zhì)地那的濃度檢測(cè)。進(jìn)一步地，所述步驟(I)包括以下子步驟:
(1.0構(gòu)建表達(dá)載體:含有人苦味受體基因T2R4和rho-tag信號(hào)肽序列全長(zhǎng)cDNA的jmLpCEP4/rho-T2R4的基因序列如SEQ ID N0.1，構(gòu)建苦味受體基因22的表達(dá)載體過(guò)程如下:首先，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，獲取和擴(kuò)增苦味受體基因序列全長(zhǎng)cDNA，并對(duì)苦味受體基因進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?，上游引物序列如SEQ ID N0.2所示，下游引物序列如SEQ ID N0.3所示，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用高保真聚合酶STAR在50 μ L反應(yīng)體系中進(jìn)行，溫度循環(huán)首先是94°C預(yù)變性30秒，接著進(jìn)行29個(gè)循環(huán)的95°C變性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸60秒，最后是20 0C降溫20秒；擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過(guò)限制性內(nèi)切酶的雙酶切反應(yīng)亞克隆到表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)治μ /和Afoi /之間，完成苦味受體的表達(dá)載體的構(gòu)建，并通過(guò)測(cè)序?qū)蛐蛄羞M(jìn)行鑒定得表達(dá)載體的基因序列如SEQ IDN0.4所示；
(1.2)人胚胎腎細(xì)胞HEK-293的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:HEK_293細(xì)胞培養(yǎng)液為添加了體積百分比為10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μ g/mL)的DMEM，培養(yǎng)條件為37°C、體積百分比為5% CO2的培養(yǎng)箱；轉(zhuǎn)染之前一天，HEK-293細(xì)胞被接種于六孔培養(yǎng)皿中，每孔接種0.5 2X IO5 cells/mL濃度的細(xì)胞500 μ L，在不含抗生素的培養(yǎng)液里生長(zhǎng)至轉(zhuǎn)染前90-95%的融合度；轉(zhuǎn)染試劑為Iipofectamin 2000，使用步驟1.1構(gòu)建好的表達(dá)載體pCEP4/rho-T2R4-hise轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞；每孔使用4 μ g表達(dá)質(zhì)粒，首先把表達(dá)質(zhì)粒用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋到50 μ L，混勻；再用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋10 UL的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Iipfectamin 2000至50 yL,在室溫下孵育5 min ;接著把稀釋的表達(dá)質(zhì)粒和Iipfectamin2000混合,搖勻，室溫孵育20 min ;把100 μ L的混合液加到六孔板中每一個(gè)含有細(xì)胞和培養(yǎng)液的孔中，前后搖板混勻后，在37°C、體積百分比為5% CO2的培養(yǎng)箱孵育24 h;含有特異性抗融合表達(dá)的His6-tag的苦味受體蛋白T2R4即可在細(xì)胞膜表面表達(dá)；
(1.3)苦味受體蛋白T2R4的提取:轉(zhuǎn)染后的HEK-293細(xì)胞用PBS清洗，并從六孔板收集；收集的細(xì)胞用超聲波探頭超聲5 min，然后16000 g離心40 min ;浮在表面的是細(xì)胞溶質(zhì)部分，小球是膜部分；浮在表面的部分用丙酮沉淀，沉淀物和尿素標(biāo)本緩沖液混合；小球用含有蛋白酶抑制劑雞尾酒的細(xì)胞裂解液在0°C冰凍條件下溶解30 min ;然后，將尿素樣品緩沖液加入到溶解的小球溶液中，即可獲得粗提的膜蛋白，其中含有異源表達(dá)于細(xì)胞膜上的苦味受體蛋白T2R4 ;含有苦味受體蛋白T2R4的細(xì)胞膜組分用于構(gòu)建石英晶體微天平傳感器，細(xì)胞膜的疏水環(huán)境有利于保持苦味受體的結(jié)構(gòu)和功能。所述步驟(2)具體為:本發(fā)明的苦味受體傳感器制備過(guò)程如下；在干凈的石英晶體微天平傳感器的金電極表面通過(guò)金硫鍵共價(jià)固定一層可以特異性識(shí)別融合表達(dá)的Hi s6-tag標(biāo)簽的自組裝巰基化單鏈DNA適配體，該適配體由5’末端共價(jià)修飾了 HS-(CH2)6基團(tuán)的SEQ ID N0.5所示的基因序列組成,反應(yīng)條件為室溫下反應(yīng)I小時(shí)；用質(zhì)量百分比為1%的牛血清白蛋白封閉石英晶體微天平傳感器的金電極表面未反應(yīng)的位點(diǎn)，封閉條件為室溫下I小時(shí)；把含有異源表達(dá)的苦味受體蛋白T2R4的細(xì)胞膜均勻涂覆在石英晶體微天平傳感器的金電極表面，并放在室溫孵育過(guò)夜，使苦味受體蛋白通過(guò)融合表達(dá)的His6_tag與適配體發(fā)生特異性的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)在石英晶體微天平傳感器的金電極表面特異性固定和純化苦味受體蛋白T2R4的目的；石英晶體微天平傳感器的金電極表面用PBS沖洗，除去未結(jié)合的多余物質(zhì)；完成石英晶體微天平傳感器的構(gòu)建。本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明采用苦味受體蛋白作為傳感器的敏感元件，克服了傳統(tǒng)的苦味物質(zhì)檢測(cè)傳感器中所采用的類(lèi)脂膜、溴化物等材料存在的特異差、靈敏度低的缺點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)液相環(huán)境中特異性苦味物質(zhì)地那的檢測(cè)。該傳感器采用自組裝適配體固定苦味受體蛋白，不僅可以形成高度穩(wěn)定的自組裝敏感膜，提高傳感器的穩(wěn)定性，而且由于適配體和苦味受體蛋白間特異性的相互作用，可以實(shí)現(xiàn)膜受體的片上純化，細(xì)胞膜上其它蛋白由于缺乏與適配體的親和力，在制備傳感器的過(guò)程中會(huì)被沖洗去除，進(jìn)而有利于提高受體蛋白在傳感器表面的固定效率和分布密度，最終有助于提高傳感器的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。該檢測(cè)方法檢測(cè)腔小，可以大大節(jié)約檢測(cè)試劑，顯著減少樣品的消耗量。此外，該傳感器采用石英晶體微天平作為二級(jí)傳感器，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)苦味物質(zhì)的實(shí)時(shí)、快速檢測(cè)，克服了基于質(zhì)譜的檢測(cè)方法存在的檢測(cè)周期長(zhǎng)、檢測(cè)流程復(fù)雜、無(wú)法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的缺點(diǎn)，適合應(yīng)用于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)便攜式苦味物質(zhì)檢測(cè)傳感器。以上這些優(yōu)點(diǎn)和功能可以滿足液相環(huán)境中特異性苦味物質(zhì)的實(shí)時(shí)快速檢測(cè)，可廣泛用于生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境保護(hù)和食品行業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域。


圖1是本發(fā)明用于特異性苦味物質(zhì)檢測(cè)傳感器的檢測(cè)腔體結(jié)構(gòu) 圖2是本發(fā)明苦味受體蛋白T2R4固定在石英晶體微天平傳感器表面的結(jié)構(gòu)示意圖
圖3是本發(fā)明制備苦味受體蛋白的基因表達(dá)結(jié)構(gòu) 圖4是本發(fā)明制備苦味受體蛋白的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 圖5是本發(fā)明表達(dá)有苦味受體蛋白的HEK-293細(xì)胞在可見(jiàn)光視野下的圖片。圖6是與圖5同一視野下的表達(dá)有苦味受體蛋白的HEK-293細(xì)胞熒光照片。圖7是本發(fā)明的傳感器檢測(cè)不同苦味物質(zhì)的結(jié)果 圖8是本發(fā)明的傳感器檢測(cè)不同濃度地那的結(jié)果 圖中，注射泵1、第一硅膠導(dǎo)管2、第二硅膠導(dǎo)管3、廢液缸4、腔蓋5、固定柱6、上環(huán)狀墊圈7、石英晶體微天平傳感器8、下環(huán)狀墊圈9、傳感器電極接口 10、傳感器底座11、脂質(zhì)雙分子層12、苦味受體蛋白13、融合表達(dá)的His6-tagl4、牛血清白蛋白15、適配體16、金電極17、石英晶體\B、Kpn /酶切位點(diǎn)19、Μ /酶切位點(diǎn)20、rho-tag信號(hào)肽21，苦味受體基因22、His6-tag 標(biāo)簽基因 23。
具體實(shí)施例方式下面詳細(xì)介紹以苦味受體蛋白T2R4作為敏感元件的石英晶體微天平傳感器檢測(cè)苦味物質(zhì)的基本原理以及具體步驟。本發(fā)明基于受體傳感器檢測(cè)苦味物質(zhì)地那的方法，包括以下步驟:
1、制備苦味受體蛋白T2R4，該步驟包括以下子步驟:
1.1表達(dá)載體的構(gòu)建 含有苦味受體基因22 (人苦味受體基因T2R4)和rho-tag信號(hào)肽21序列全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒的基因序列如SEQ ID N0.1。采用基因工程技術(shù)，對(duì)苦味受體基因22進(jìn)行適當(dāng)改造，構(gòu)建苦味受體基因22的表達(dá)載體。首先，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，獲取和擴(kuò)增苦味受體基因序列全長(zhǎng)cDNA，并對(duì)苦味受體基因進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎棥Ｉ嫌我镄蛄腥鏢EQ ID N0.2所示:5’ -CGGGGTACCGAGAGCCGCAGCCATGAACGGCACAGAGGGCCC-3，，其中下劃線部分為 kozak序列，有助于提高受體蛋白的表達(dá)量；下游引物序列如SEQ ID N0.3所示:5’ -TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTAATGGTGATGGTGATGATGTTTTTTGAAACAAAGAATC-3’，其中下劃線部分為序列23的反向互補(bǔ)序列，用于苦味受體蛋白13的標(biāo)記以及與二級(jí)傳感器的耦合。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)使用高保真聚合酶STAR在50 μ L反應(yīng)體系中進(jìn)行，包括IyL pCEP4/rho~T2R4質(zhì)粒，I μ L上游引物，I μ L下游引物，4 μ L濃度為IOmM的dNTP混合物，0.5 μ L高保真聚合酶STAR ，10 μ L PCR緩沖液(含Mg2+)和32.5 μ L去離子水；溫度循環(huán)首先是94°C預(yù)變性30秒，接著進(jìn)行29個(gè)循環(huán)的95°C變性30秒、58 V退火30秒、72°C延伸60秒，最后是20 V降溫20秒。擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過(guò)限制性內(nèi)切酶的雙酶切反應(yīng)亞克隆到表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)命/7 /和/之間，完成苦味受體的表達(dá)載體的構(gòu)建，并通過(guò)測(cè)序?qū)蛐蛄羞M(jìn)行鑒定得表達(dá)載體的基因序列如SEQ ID N0.4所示。1.2人胚胎腎細(xì)胞HEK-293的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
HEK-293細(xì)胞培養(yǎng)液為添加了體積百分比為10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μ g/mL)的DMEM，培養(yǎng)條件為37°C、體積百分比為5% CO2的培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染之前一天，HEK-293細(xì)胞被接種于六孔培養(yǎng)皿中，每孔接種0.5 2X105 cells/mL濃度的細(xì)胞500μ L，在不含抗生素的培養(yǎng)液里生長(zhǎng)至轉(zhuǎn)染前90-95%的融合度。轉(zhuǎn)染試劑為Iipofectamin2000 (Invitrogen,美國(guó))，使用步驟1.1構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞。每孔使用4 μ g表達(dá)質(zhì)粒，首先把表達(dá)質(zhì)粒用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液稀釋到50UL,混勻。再用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋10 μ L的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Iipfectamin 2000至50 μ L,在室溫下孵育5 min。接著把稀釋的表達(dá)質(zhì)粒和Iipfectamin 2000混合(總體積為100 μ L),搖勻，室溫孵育20 min。把100 μ L的混合液加到六孔板中每一個(gè)含有細(xì)胞和培養(yǎng)液的孔中，前后搖板混勻后，在37°C、體積百分比為5% CO2的培養(yǎng)箱孵育24 h-48 h。含有特異性抗融合表達(dá)的His6-tagl4的苦味受體蛋白13即可在細(xì)胞膜表面表達(dá)，苦味受體蛋白13即為苦味受體蛋白T2R4。1.3逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)
采用RT-PCR的方法檢測(cè)苦味受體蛋白T2R4在mRNA水平的表達(dá)。HEK-293細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，按Trizol —步法提取細(xì)胞總RNA。首先，取出六孔板細(xì)胞至已滅好菌的超凈工作臺(tái)中，吸棄培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)洗一次。每孔加入0.5 mL Trizol試劑，用移液器吹打細(xì)胞，使細(xì)胞脫落，裂解。再將上述細(xì)胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，在室溫(15°C 30°C)下放置5 min。在上述EP管中，按照每I mL Trizol加0.2 mL氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15 S，在室溫下(15°C 30°C )放置2 3min后，12000 g(2°C 8°C )離心18 min ;樣品分為三層，底層為黃色的有機(jī)相，上層為水相和一個(gè)中間層。取上層水相置于新1.5 mL EP管中，按照每I mL Trizol加0.5 mL異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下(15°C 30°C)放置10 min, 12000 g (2°C 8°C )離心10 min。棄上清，按照每I mL Trizol加I mL 75%乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混合，7500 g (2°C 8°C)離心5 min，棄上清。讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥。用不含RNA酶的水溶解RNA沉淀，提取的RNA放在-70°C冰箱保存。取5 yL RNA溶液在260 nm及280 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)紫外吸光度，估計(jì)其純度，并計(jì)算核酸含量(RNA 260 nm吸光度為I相當(dāng)于40 μ g/mL)。將RNA溶液稀釋為0.2 yg/yL，取11 μ L RNA溶液，I yL隨機(jī)六聚引物，混勻，短暫離心數(shù)秒，70°C溫育5 min ;于冰浴下冷卻，依次加入4 μ L逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、I μ LRnasin (20 U)和 2 μ L dNTP,混勻,短暫離心,25°C溫育 5 min ;加入 I μ L PrimeScript RTase (200 U/ μ L)逆轉(zhuǎn)錄酶，混勻，短暫離心，總量為20 μ L的反應(yīng)體系于30°C溫育10min ；42° C反應(yīng)45 min，在95°C條件下放置5 min停止反應(yīng)。立即置冰上。產(chǎn)物放在_20°C保存。然后在50 μ L反應(yīng)體系中加入2 μ g的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物序列如 SEQ ID N0.2 所示:5’ -CGGGGTACCGAGAGCCGCAGCCATGAACGGCACAGAGGGCCC-3’ ；下游引物序列如 SEQ ID N0.3 所示:5’ -TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTAATGGTGATGGTGATGATGTTTTTTGAAACAAAGAATC-3’ ；冰浴下，取2.5 U Taq DNA 聚合酶、2.0 μ L。0嫩模板、5.0 μ L PCR緩沖液、4.0 uL MgCl2U-O yL dNTP、上下游引物各0.4 Ug及去離子水35.5 μ L混勻，短暫離心；總量為50 μ L的反應(yīng)體系于94°C預(yù)變性30 S，再以29個(gè)循環(huán)的95°C變性30秒、58°C退火30秒、720C延伸60秒擴(kuò)增，最后20 V降溫20秒。稱取I g瓊脂糖，加入96 mLTBE緩沖液加熱使溶解，加入4 μ L 1% DNA green，配成質(zhì)量百分比為I %的瓊脂糖凝膠；取標(biāo)準(zhǔn)DNA marker和PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣；110 V電壓下電泳30 min ;電泳后通過(guò)紫外成像系統(tǒng)觀察電泳條帶。1.4細(xì)胞免疫熒光鑒定
通過(guò)使用帶有突光標(biāo)記的特異性抗His6-tagl4的單克隆抗體檢測(cè)融合了 His6-tagl4的苦味受體蛋白13在HEK-293的表達(dá)及其細(xì)胞膜上的分布情況。為進(jìn)行熒光顯微鏡的觀察，先將轉(zhuǎn)染孵育好的細(xì)胞接種在六孔板中，370C，體積百分比濃度為5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。再用0-4°C甲醇在_20°C靜置20 min，用PBS洗2遍，每次5 min。用體積百分比為10%的胎牛血清(FBS)封閉，37°C恒溫培養(yǎng)箱，封閉30 min，PBS洗2遍，每次5 min。取出蓋玻片，在保濕盒中孵育一抗(His6-tag兔抗一抗，CST公司)，4°C過(guò)夜(一抗按1:500的比例稀釋，用體積百分比10% FBS/PBS稀釋)。用體積百分比為10%的FBS/PBS洗3次，每次5 min。隨后進(jìn)行二抗孵育:FITC標(biāo)記的二抗(FITC-抗兔二抗，1:200用體積百分比為10%的FBS/PBS稀釋)在室溫或4°C側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)，避光，之后用體積百分比為的10%的FBS/PBS洗3遍，每次5min。最后是封片:將蓋玻片取出，放在干凈的載玻片上，體積百分比為90%的甘油封片，用指甲油封片固定四周。封片后就可以使用激光共聚焦顯微鏡觀察，激發(fā)波長(zhǎng)為492 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm。1.5苦味受體蛋白T2R4的提取
轉(zhuǎn)染后的HEK-293細(xì)胞用PBS (pH 7.4)清洗，并從六孔板收集。收集的細(xì)胞用超聲波探頭超聲5 min，然后16000 g離心40 min。浮在表面的是細(xì)胞溶質(zhì)部分，小球是膜部分。浮在表面的部分用丙酮沉淀，沉淀物和尿素標(biāo)本緩沖液混合。小球用含有蛋白酶抑制劑雞尾酒的細(xì)胞裂解液在0°C冰凍條件下溶解30 min。然后，將尿素樣品緩沖液加入到溶解的小球溶液中，即可獲得粗提的膜蛋白，其中含有異源表達(dá)于細(xì)胞膜上的苦味受體蛋白13。含有苦味受體蛋白13的細(xì)胞膜組分用于構(gòu)建石英晶體微天平傳感器8，細(xì)胞膜的疏水環(huán)境有利于保持苦味受體蛋白13的結(jié)構(gòu)和功能。本步驟I中，子步驟1.3和1.4用于驗(yàn)證苦味受體13已在細(xì)胞膜表面成功表達(dá)，并非本步驟I的必要子步驟。2、苦味受體蛋白T2R4在石英晶體微天平傳感器表面的固定
本發(fā)明的受體傳感器制備過(guò)程如下；在干凈的石英晶體微天平傳感器的金電極表面17通過(guò)金硫鍵共價(jià)固定一層可以特異性識(shí)別融合表達(dá)的His6-tagl4的巰基化單鏈DNA適配體16，該適配體16的序列由HS-(CH2)6和SEQ ID N0.5所示的基因序列共價(jià)連接組成:(5，-HS-(CH2)6-GCTATGGGTGGTCTGGTTGGGATTGGCCCCGGGAGCTGGC-3’)，反應(yīng)條件為室溫下反應(yīng)I小時(shí)；用體積百分比為1%的牛血清白蛋白15封閉石英晶體微天平傳感器的金電極17表面未反應(yīng)的位點(diǎn)，封閉條件為室溫下I小時(shí)；把含有異源表達(dá)的苦味受體蛋白13的細(xì)胞膜均勻涂覆在石英晶體微天平傳感器的金電極17表面，并放在室溫孵育過(guò)夜，使苦味受體蛋白13通過(guò)融合表達(dá)的His6-tagl4與適配體16發(fā)生特異性的結(jié)合,實(shí)現(xiàn)在石英晶體微天平傳感器的金電極17表面特異性固定和純化苦味受體蛋白13的目的。石英晶體微天平傳感器的金電極17表面用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.0)沖洗，除去未結(jié)合的多余物質(zhì)。完成用于苦味物質(zhì)地那檢測(cè)的受體傳感器的構(gòu)建。3、苦味物質(zhì)地那的檢測(cè)
3.1石英晶體微天平傳感器原理
石英晶體微天平傳感器是一種質(zhì)量敏感型傳感器，其基本原理是石英晶體的諧振頻率與其表面的表面微小的壓力變化相關(guān)，通過(guò)記錄石英晶體諧振頻率的變化監(jiān)測(cè)石英晶體表面微小的壓力變化?；谶@一原理，石英晶體表面微小的質(zhì)量變化也可以通過(guò)監(jiān)測(cè)石英晶體諧振頻率的變化來(lái)檢測(cè)。因此，可以利用這個(gè)原理構(gòu)建生物傳感器，用來(lái)測(cè)定敏感元件與待測(cè)物質(zhì)的特異性吸附作用。當(dāng)苦味物質(zhì)被固定于石英晶體表面的苦味受體蛋白特異性吸附時(shí)，石英晶體表面的質(zhì) 量發(fā)生變化，這一變化將引起石英晶體諧振頻率的改變，而且頻率的改變與石英晶體表面質(zhì)量的改變成正比，滿足公式:^ F=KA &其中J A為石英晶體諧振頻率的變化量(Hz)，^為石英晶體表面的質(zhì)量變化(g)，f為相關(guān)系數(shù)，F(xiàn)為石英晶體的初始頻率(MHz)，A為電極總的表面積(cm2)，r為晶體的密度(g/cm3)， 為晶體的厚度(cm)。因此，通過(guò)監(jiān)測(cè)石英晶體諧振頻率的變化可以計(jì)算出其表面的質(zhì)量變化，獲得苦味物質(zhì)與表面受體蛋白相互作用信息，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)苦味物質(zhì)的檢測(cè)。3.2檢測(cè)過(guò)程
石英晶體微天平傳感器8諧振頻率的信號(hào)通過(guò)傳感器電極接口 10傳送到QCM200系統(tǒng)，用于記錄石英晶體微天平傳感器8諧振頻率的改變。由注射泵I通過(guò)第一硅膠導(dǎo)管2將不含任何苦味物質(zhì)的水溶液泵入密閉的檢測(cè)腔內(nèi)，待石英晶體微天平傳感器8的諧振頻率達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)后，再由注射泵I將濃度確定的含有苦味物質(zhì)地那的待測(cè)溶液通過(guò)第一硅膠導(dǎo)管2泵入檢測(cè)腔，待石英晶體微天平傳感器8的諧振頻率再次穩(wěn)定后，諧振頻率的改變量即為對(duì)應(yīng)濃度的傳感器響應(yīng)值。最后再由注射泵I通過(guò)第一硅膠導(dǎo)管2泵入不含任何苦味物質(zhì)的水溶液，清洗檢測(cè)腔，即完成一次檢測(cè)過(guò)程。至少間隔IOmin后，待石英晶體微天平傳感器8的諧振頻率穩(wěn)定后可泵入待測(cè)溶液到檢測(cè)腔進(jìn)行下一次檢測(cè)。重復(fù)上述步驟，可以確定一系列濃度的苦味物質(zhì)地那對(duì)應(yīng)的傳感器諧振頻率改變量，得到地那濃度-諧振頻率改變量曲線。對(duì)于未知濃度的苦味物質(zhì)地那，首先由注射泵I通過(guò)第一硅膠導(dǎo)管2將不含任何苦味物質(zhì)的水溶液泵入密閉的檢測(cè)腔內(nèi)，待石英晶體微天平傳感器8的諧振頻率達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)Ftl后，再由注射泵I將待測(cè)未知濃度的苦味物質(zhì)地那通過(guò)第一硅膠導(dǎo)管2泵入檢測(cè)腔，待石英晶體微天平傳感器8的諧振頻率穩(wěn)定到F1后，得到諧振頻率改變量F1- F0,根據(jù)上述步驟得到的地那濃度-諧振頻率改變量曲線推算出待測(cè)苦味物質(zhì)地那的濃度，實(shí)現(xiàn)液相中苦味物質(zhì)的檢測(cè)。
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。如圖1所示，本發(fā)明用于特異性苦味物質(zhì)檢測(cè)傳感器的檢測(cè)腔體結(jié)構(gòu)圖，包括:圖中，注射泵1、第一硅膠導(dǎo)管2、第二硅膠導(dǎo)管3、廢液缸4、腔蓋5、固定柱6、上環(huán)狀墊圈7、石英晶體微天平傳感器8、下環(huán)狀墊圈9、傳感器電極接口 10、傳感器底座11。其中，由腔蓋
5、上環(huán)狀墊圈7、石英晶體微天平傳感器8和傳感器底座11的側(cè)壁組成一個(gè)密閉的檢測(cè)腔，通過(guò)固定柱6實(shí)現(xiàn)腔蓋5與傳感器底座11的連接和固定。注射泵I通過(guò)第一硅膠導(dǎo)管2向檢測(cè)腔泵入溶液，檢測(cè)廢液由第二硅膠導(dǎo)管3輸出到廢液缸4。石英晶體微天平傳感器8通過(guò)上環(huán)狀墊圈7和下環(huán)狀墊圈9固定于檢測(cè)腔底部。石英晶體微天平傳感器8通過(guò)傳感器電極接口 10與外圍檢測(cè)系統(tǒng)連接?？辔妒荏w表達(dá)載體的構(gòu)建如圖3所示，使其更加適合應(yīng)用于構(gòu)建生物傳感器，包括在苦味受體基因22的5’端引入rho-tag信號(hào)肽基因21，以利于表達(dá)的受體蛋白定位于細(xì)胞膜上；在苦味受體基因22的3 ’端引入Hi s6-tag標(biāo)簽基因23，用于表達(dá)Hi s6-tag標(biāo)簽，通過(guò)與適配體16特異性結(jié)合,實(shí)現(xiàn)苦味受體蛋白13的固定和純化。其中，5’端的治7/7 J酶切位點(diǎn)19和3’端的Afoi /酶切位點(diǎn)用于將苦味受體基因亞克隆到表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)域。圖4是本發(fā)明制備苦味受體蛋白13的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果圖，提示苦味受體蛋白13在mRNA水平上有顯著表達(dá)。圖5是本發(fā)明中表達(dá)有備苦味受體蛋白13的HEK-293細(xì)胞在可見(jiàn)光視野的照片；圖6是與圖5同一視野下的熒光照片；結(jié)果提示在蛋白質(zhì)水平，苦味受體蛋白13有顯著表達(dá)，而且表達(dá)的苦味受體蛋白13主要分布在細(xì)胞脂膜。如圖2所示，本發(fā)明固定有苦味受體的石英晶體微天平傳感器結(jié)構(gòu)示意圖，包括:脂質(zhì)雙分子層12、苦味受體蛋白13、融合表達(dá)的His6-tagl4、牛血清白蛋白15、適配體16、金電極17、石英晶體18。上述石英晶體微天平傳感器8主要應(yīng)用于液相環(huán)境中苦味物質(zhì)的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中，采用不同的苦味物質(zhì)測(cè)試傳感器的特異性，包括硫酸鎂(30 mM)、地那(I mM)、水楊素(D-(-)-salicin, I mM)和奎寧(I mM)。采用不同濃度的T2R4天然配體地那測(cè)試傳感器的靈敏度。圖7是傳感器檢測(cè)不同苦味物質(zhì)的結(jié)果。采用不含苦味受體蛋白T2R4的HEK-293細(xì)胞膜作為陰性對(duì)照。其中，傳感器對(duì)不同苦味物質(zhì)的響應(yīng)以含有苦味受體蛋白T2R4的傳感器對(duì)地那的響應(yīng)進(jìn)行了歸一化處理。結(jié)果表明，含有苦味受體蛋白T2R4的傳感器對(duì)地那的響應(yīng)顯著高于對(duì)奎寧的響應(yīng)，也顯著高于不含苦味受體蛋白T2R4的傳感器對(duì)地那的響應(yīng)(*# < 0.0Ln = 6)。說(shuō)明該傳感器檢測(cè)苦味物質(zhì)地那具有良好的特異性。圖8是傳感器檢測(cè)不同濃度的地那的結(jié)果。傳感器對(duì)不同濃度地那的響應(yīng)以傳感器對(duì)0.1 mM地那的響應(yīng)進(jìn)行了歸一化處理。在地那濃度為0.01 mM到0.3 mM的范圍內(nèi)，該傳感器對(duì)地那具有濃度依賴的線性響應(yīng)特征。<110>浙江大學(xué)〈120〉一種基于受體傳感器檢測(cè)苦味物質(zhì)地那的方法
〈160〉5
<170>PatentIn version 3.3
〈210〉I
〈211〉11193
〈212〉DNA
<213>Homo sapiens
〈400〉 I
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac240
atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc tacttggcag tacatctacg360
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacaccaat gggcgtggat420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa taaccccgcc ccgttgacgc540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc600
gtcagatctc tagaagctgg gtaccgagag ccgcagccat gaacggcaca gagggcccca660
atttttatgt gcccttctcc aacgtcacag gcgtggtgcg gagccccttc gagcagccgc720agtactacct ggcggaacca tggcagttct ccatgcttcg gttattctat ttctctgcta780
ttattgcctc agttatttta aattttgtag gaatcattat gaatctgttt attacagtgg840
tcaattgcaa aacttgggtc aaaagccata gaatctcctc ttctgatagg attctgttca900
gcctgggcat caccaggttt cttatgctgg gactatttct ggtgaacacc atctacttcg960
tctcttcaaa tacggaaagg tcagtctacc tgtctgcttt ttttgtgttg tgtttcatgt1020
ttttggactc gagcagtgtc tggtttgtga ccttgctcaa tatcttgtac tgtgtgaaga1080
ttactaactt ccaacactca gtgtttctcc tgctgaagcg gaatatctcc ccaaagatcc1140
ccaggctgct gctggcctgt gtgctgattt ctgctttcac cacttgcctg tacatcacgc1200
ttagccaggc atcacctttt cctgaacttg tgactacgag aaataacaca tcatttaata1260
tcagtgaggg catcttgtct ttagtggttt ctttggtctt gagctcatct ctccagttca1320
tcattaatgt gacttctgct tccttgctaa tacactcctt gaggagacat atacagaaga1380
tgcagaaaaa tgccactggt ttctggaatc cccagacgga agctcatgta ggtgctatga1440
agctgatggt ctatttcctc atcctctaca ttccatattc agttgctacc ctggtccagt1500
atctcccctt ttatgcaggg atggatatgg ggaccaaatc catttgtctg atttttgcca1560
ccctttactc tccaggacat tctgttctca ttattatcac acatcctaaa ctgaaaacaa1620
cagcaaagaa gattctttgt ttcaaaaaat aggcggccgc tcgaggccgg caaggccgga1680
tccagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa1740
aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg1800
caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggaggt1860
gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtatggctg attatgatcc1920ggctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag1980
acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca ggcgtcagcg2040
ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg aggtcgactc tagaggatcg atgccccgcc2100
ccggacgaac taaacctgac tacgacatct ctgccccttc ttcgcggggc agtgcatgta2160
atcccttcag ttggttggta caacttgcca actgggccct gttccacatg tgacacgggg2220
ggggaccaaa cacaaagggg ttctctgact gtagttgaca tccttataaa tggatgtgca2280
catttgccaa cactgagtgg ctttcatcct ggagcagact ttgcagtctg tggactgcaa2340
cacaacattg cctttatgtg taactcttgg ctgaagctct tacaccaatg ctgggggaca2400
tgtacctccc aggggcccag gaagactacg ggaggctaca ccaacgtcaa tcagaggggc2460
ctgtgtagct accgataagc ggaccctcaa gagggcatta gcaatagtgt ttataaggcc2520
cccttgttaa ccctaaacgg gtagcatatg cttcccgggt agtagtatat actatccaga2580
ctaaccctaa ttcaatagca tatgttaccc aacgggaagc atatgctatc gaattagggt2640
tagtaaaagg gtcctaagga acagcgatat ctcccacccc atgagctgtc acggttttat2700
ttacatgggg tcaggattcc acgagggtag tgaaccattt tagtcacaag ggcagtggct2760
gaagatcaag gagcgggcag tgaactctcc tgaatcttcg cctgcttctt cattctcctt2820
cgtttagcta atagaataac tgctgagttg tgaacagtaa ggtgtatgtg aggtgctcga2880
aaacaaggtt tcaggtgacg cccccagaat aaaatttgga cggggggttc agtggtggca2940
ttgtgctatg acaccaatat aaccctcaca aaccccttgg gcaataaata ctagtgtagg3000
aatgaaacat tctgaatatc tttaacaata gaaatccatg gggtggggac aagccgtaaa3060gactggatgt ccatctcaca cgaatttatg gctatgggca acacataatc ctagtgcaat3120
atgatactgg ggttattaag atgtgtccca ggcagggacc aagacaggtg aaccatgttg3180
ttacactcta tttgtaacaa ggggaaagag agtggacgcc gacagcagcg gactccactg3240
gttgtctcta acacccccga aaattaaacg gggctccacg ccaatggggc ccataaacaa3300
agacaagtgg ccactctttt ttttgaaatt gtggagtggg ggcacgcgtc agcccccaca3360
cgccgccctg cggttttgga ctgtaaaata agggtgtaat aacttggctg attgtaaccc3420
cgctaaccac tgcggtcaaa ccacttgccc acaaaaccac taatggcacc ccggggaata3480
cctgcataag taggtgggcg ggccaagata ggggcgcgat tgctgcgatc tggaggacaa3540
attacacaca cttgcgcctg agcgccaagc acagggttgt tggtcctcat attcacgagg3600
tcgctgagag cacggtgggc taatgttgcc atgggtagca tatactaccc aaatatctgg3660
atagcatatg ctatcctaat ctatatctgg gtagcatagg ctatcctaat ctatatctgg3720
gtagcatatg ctatcctaat ctatatctgg gtagtatatg ctatcctaat ttatatctgg3780
gtagcatagg ctatcctaat ctatatctgg gtagcatatg ctatcctaat ctatatctgg3840
gtagtatatg ctatcctaat ctgtatccgg gtagcatatg ctatcctaat agagattagg3900
gtagtatatg ctatcctaat ttatatctgg gtagcatata ctacccaaat atctggatag3960
catatgctat cctaatctat atctgggtag catatgctat cctaatctat atctgggtag4020
cataggctat cctaatctat atctgggtag catatgctat cctaatctat atctgggtag4080
tatatgctat cctaatttat atctgggtag cataggctat cctaatctat atctgggtag4140
catatgctat cctaatctat atctgggtag tatatgctat cctaatctgt atccgggtag4200
catatgctat cctcatgcat atacagtcag catatgatac ccagtagtag agtgggagtg4260ctatcctttg catatgccgc cacctcccaa gggggcgtga attttcgctg cttgtccttt4320
tcctgctggt tgctcccatt cttaggtgaa tttaaggagg ccaggctaaa gccgtcgcat4380
gtctgattgc tcaccaggta aatgtcgcta atgttttcca acgcgagaag gtgttgagcg4440
cggagctgag tgacgtgaca acatgggtat gcccaattgc cccatgttgg gaggacgaaa4500
atggtgacaa gacagatggc cagaaataca ccaacagcac gcatgatgtc tactggggat4560
ttattcttta gtgcggggga atacacggct tttaatacga ttgagggcgt ctcctaacaa4620
gttacatcac tcctgccctt cctcaccctc atctccatca cctccttcat ctccgtcatc4680
tccgtcatca ccctccgcgg cagccccttc caccataggt ggaaaccagg gaggcaaatc4740
tactccatcg tcaaagctgc acacagtcac cctgatattg caggtaggag cgggctttgt4800
cataacaagg tccttaatcg catccttcaa aacctcagca aatatatgag tttgtaaaaa4860
gaccatgaaa taacagacaa tggactccct tagcgggcca ggttgtgggc cgggtccagg4920
ggccattcca aaggggagac gactcaatgg tgtaagacga cattgtggaa tagcaagggc4980
agttcctcgc cttaggttgt aaagggaggt cttactacct ccatatacga acacaccggc5040
gacccaagtt ccttcgtcgg tagtcctttc tacgtgactc ctagccagga gagctcttaa5100
accttctgca atgttctcaa atttcgggtt ggaacctcct tgaccacgat gctttccaaa5160
ccaccctcct tttttgcgcc tgcctccatc accctgaccc cggggtccag tgcttgggcc5220
ttctcctggg tcatctgcgg ggccctgctc tatcgctccc gggggcacgt caggctcacc5280
atctgggcca ccttcttggt ggtattcaaa ataatcggct tcccctacag ggtggaaaaa5340
tggccttcta cctggagggg gcctgcgcgg tggagacccg gatgatgatg actgactact5400
權(quán)利要求
1.一種基于受體傳感器檢測(cè)苦味物質(zhì)地那的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)制備苦味受體蛋白T2R4； (2)將苦味受體蛋白T2R4固定在石英晶體微天平傳感器表面制成受體傳感器； (3)將不含任何苦味物質(zhì)的水溶液泵入密閉的檢測(cè)腔內(nèi)，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)后，再將含有某一確定濃度的苦味物質(zhì)地那的溶液泵入檢測(cè)腔，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率再次穩(wěn)定后，諧振頻率的改變量即為此確定濃度的傳感器響應(yīng)值，最后再泵入不含任何苦味物質(zhì)的水溶液，清洗檢測(cè)腔，即完成一次檢測(cè)過(guò)程；至少間隔IOmin后，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率穩(wěn)定后，再泵入含有另一確定濃度的苦味物質(zhì)地那的溶液進(jìn)行下一次檢測(cè)；重復(fù)上述步驟，可以得到一系列苦味物質(zhì)地那的濃度對(duì)應(yīng)的傳感器諧振頻率改變量，得到地那濃度-諧振頻率改變量曲線； (4)對(duì)于未知濃度的苦味物質(zhì)地那，首先將不含任何苦味物質(zhì)的水溶液泵入密閉的檢測(cè)腔內(nèi)，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)Ftl后，再將含有未知濃度的苦味物質(zhì)地那的待測(cè)溶液泵入檢測(cè)腔，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率穩(wěn)定到F1后，得到諧振頻率改變量F1- F0,最后根據(jù)上述步驟3得到的地那濃度-諧振頻率改變量曲線得到待測(cè)溶液中苦味物質(zhì)地那的濃度，實(shí)現(xiàn)液相中苦味物質(zhì)地那的濃度檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述苦味物質(zhì)地那的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟I包括以下子步驟: (1.0構(gòu)建表達(dá)載體:含有人苦味受體基因T2R4和rho-tag信號(hào)肽序列全長(zhǎng)cDNA的jmLpCEP4/rho-T2R4的基因序列如SEQ ID N0.1，構(gòu)建苦味受體基因22的表達(dá)載體過(guò)程如下:首先，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引 物，獲取和擴(kuò)增苦味受體基因序列全長(zhǎng)cDNA，并對(duì)苦味受體基因進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?，上游引物序列如SEQ ID N0.2所示，下游引物序列如SEQ ID N0.3所示，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用高保真聚合酶STAR在50 μ L反應(yīng)體系中進(jìn)行，溫度循環(huán)首先是94°C預(yù)變性30秒，接著進(jìn)行29個(gè)循環(huán)的95°C變性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸60秒，最后是.20 0C降溫20秒；擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過(guò)限制性內(nèi)切酶的雙酶切反應(yīng)亞克隆到表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)治μ /和Afoi /之間，完成苦味受體的表達(dá)載體的構(gòu)建，并通過(guò)測(cè)序?qū)蛐蛄羞M(jìn)行鑒定得表達(dá)載體的基因序列如SEQ IDN0.4所示； (1.2)人胚胎腎細(xì)胞HEK-293的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:HEK_293細(xì)胞培養(yǎng)液為添加了體積百分比為10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μ g/mL)的DMEM，培養(yǎng)條件為37°C、體積百分比為5% CO2的培養(yǎng)箱；轉(zhuǎn)染之前一天，HEK-293細(xì)胞被接種于六孔培養(yǎng)皿中，每孔接種0.5 2X IO5 cells/mL濃度的細(xì)胞500 μ L，在不含抗生素的培養(yǎng)液里生長(zhǎng)至轉(zhuǎn)染前90-95%的融合度；轉(zhuǎn)染試劑為Iipofectamin 2000，使用步驟1.1構(gòu)建好的表達(dá)載體pCEP4/rho-T2R4~his6轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞；每孔使用4 μ g表達(dá)質(zhì)粒，首先把表達(dá)質(zhì)粒用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋到50 μ L，混勻；再用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋10 UL的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Iipfectamin 2000至50 yL,在室溫下孵育5 min ;接著把稀釋的表達(dá)質(zhì)粒和Iipfectamin/2000混合,搖勻，室溫孵育20 min ;把100 μ L的混合液加到六孔板中每一個(gè)含有細(xì)胞和培養(yǎng)液的孔中，前后搖板混勻后，在37°C、體積百分比為5% CO2的培養(yǎng)箱孵育24 h;含有特異性抗融合表達(dá)的His6-tag的苦味受體蛋白T2R4即可在細(xì)胞膜表面表達(dá)；(1.3)苦味受體蛋白T2R4的提取:轉(zhuǎn)染后的HEK-293細(xì)胞用PBS清洗，并從六孔板收集；收集的細(xì)胞用超聲波探頭超聲5 min，然后16000 g離心40 min ;浮在表面的是細(xì)胞溶質(zhì)部分，小球是膜部分；浮在表面的部分用丙酮沉淀，沉淀物和尿素標(biāo)本緩沖液混合；小球用含有蛋白酶抑制劑雞尾酒的細(xì)胞裂解液在0°C冰凍條件下溶解30 min ;然后，將尿素樣品緩沖液加入到溶解的小球溶液中，即可獲得粗提的膜蛋白，其中含有異源表達(dá)于細(xì)胞膜上的苦味受體蛋白T2R4 ;含有苦味受體蛋白T2R4的細(xì)胞膜組分用于構(gòu)建石英晶體微天平傳感器，細(xì)胞膜的疏水環(huán)境有利于保持苦味受體的結(jié)構(gòu)和功能。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述苦味物質(zhì)地那的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟2具體為:本發(fā)明的受體傳感器制備過(guò)程如下:在干凈的石英晶體微天平傳感器的金電極表面通過(guò)金硫鍵共價(jià)固定一層可以特異性識(shí)別融合表達(dá)的His6-tag標(biāo)簽的巰基化單鏈DNA適配體，該適配體的序列由HS-(CH2)6和SEQ ID N0.5所示的基因序列共價(jià)連接組成；反應(yīng)條件為室溫下反應(yīng)I小時(shí)；用質(zhì)量百分比為1%的牛血清白蛋白封閉石英晶體微天平傳感器的金電極表面未反應(yīng)的位點(diǎn)，封閉條件為室溫下I小時(shí)；把含有異源表達(dá)的苦味受體蛋白T2R4的細(xì)胞膜均勻涂覆在石英晶體微天 平傳感器的金電極表面，并放在室溫孵育過(guò)夜，使苦味受體蛋白通過(guò)融合表達(dá)的His6-tag與適配體發(fā)生特異性的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)在石英晶體微天平傳感器的金電極表面特異性固定和純化苦味受體蛋白T2R4的目的；石英晶體微天平傳感器的金電極表面用PBS沖洗，除去未結(jié)合的多余物質(zhì)；完成用于苦味物質(zhì)地那檢測(cè)的受體傳感器的構(gòu)建。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于受體傳感器檢測(cè)苦味物質(zhì)地那的方法，首先在HEK-293細(xì)胞表面表達(dá)了帶有His6-tag標(biāo)簽的苦味受體蛋白T2R4，并提取苦味受體蛋白T2R4將其利用適配體有效地固定在石英晶體微天平表面構(gòu)建成受體傳感器；通過(guò)測(cè)試一系列含已知確定濃度苦味物質(zhì)地那的溶液，得到地那濃度-諧振頻率改變量標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后測(cè)試含有未知濃度苦味物質(zhì)地那的待測(cè)溶液，根據(jù)石英晶體微天平諧振頻率的改變量和地那濃度-諧振頻率改變量標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)溶液中苦味物質(zhì)地那的濃度。本發(fā)明方法所需儀器簡(jiǎn)單、操作方便，解決了敏感元件苦味受體蛋白T2R4與石英晶體微天平的穩(wěn)定耦合，實(shí)現(xiàn)了液相環(huán)境中苦味物質(zhì)地那的快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N5/02GK103149110SQ20131006024
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月26日
發(fā)明者吳春生, 鄒玲, 杜立萍, 王平 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)