專利名稱：一種糞便蛋白萃取方法及試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)提取純化領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種糞便中蛋白質(zhì)提取純化的方法及試劑。
背景技術(shù)：
胃腸道疾病時，糞便中往往含有較多量的炎癥細胞(包括白細胞、淋巴細胞)、脫落的胃腸上皮細胞和胃腸道微生物及其代謝產(chǎn)物等。對某些特定糞便蛋白的分析，可以輔助診斷胃腸道疾病。現(xiàn)有如糞便乳鐵蛋白酶聯(lián)免疫檢測試劑盒和鈣衛(wèi)蛋白酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，均需要在檢測前對糞便樣本進行蛋白提取和純化。有文獻報道，糞便蛋白提取可用一定比例的磷酸鹽加一定比例的尿素進行提取純化。本發(fā)明一方面在文獻方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了磷酸鹽和尿素的比例，大大提高了糞便蛋白的得率；另一方面，在試劑盒中配備了一種簡易的糞便取樣器和離心管，使糞便稱量、提取更方便、更準確。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種得率高、簡便、準確的糞便蛋白提取純化試劑盒，具體來說，該試劑盒包含了取樣器、離心管、提取液。其中取樣器是由金屬或塑料制成的如圖所示的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

所述的離心管是容量為15ml的連蓋離心管。所述的微孔板是每孔容量300ul的酶標板或微孔板。所述的提取液含磷酸鹽與尿素，更佳地提取糞便中的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一方面，提供了一種提取純化糞便蛋白質(zhì)的方法，包括步驟:(I)樣品取樣稱量:(2)用權(quán)利要求1-4任一所述的試劑盒進行提取與純化，把稱量好的糞便樣本加入離心管中，加入2倍稀釋后的提取液，充分混勻，震蕩20分鐘，取Iml粗提液至1.5mlEP管中，2000rpm/分離心20分鐘，吸取上清液到微孔板中。(3)分析蛋白得率。本發(fā)明試劑盒的檢測原理為:提取液含有可使蛋白變性的尿素，通過機械振蕩使細胞破裂，糞便中的蛋白溶解到溶液中，再用離心方法去掉糞便中的雜質(zhì)，就可以得到含有較高濃度的蛋白質(zhì)的上清液。


:取樣器結(jié)構(gòu)圖。提供下述實施例是為了更好地理解本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的內(nèi)容和保護范圍構(gòu)成任何限制。實施例1提取液主要成分濃度對糞便蛋白提取得率的影響
1.1樣品取樣稱量:將權(quán)利要求1-4所述的取樣器與離心管進行稱量，用取樣器取50-200mg糞便樣本并轉(zhuǎn)移入離心管后再次進行稱量。兩數(shù)相減得到糞便樣本的重量。1.2以棋盤法將磷酸鹽與尿素按不同濃度配制為多份提取液(表1)，并2倍稀釋備用。1.3糞便蛋白提取:按V: W = 50 (V為提取液體積，單位ul ;W為樣本重量，單位為mg)的比例在離心管中加入提取液，充分混勻，震蕩20分鐘，取Iml粗提液至1.5mlEP管中，3000rpm/分離心15分鐘，吸取上清液。重復此步驟至所有配比的提取液均與適量樣本作用并得到上清液。用PBS將上清液分別2倍稀釋。1.4分析蛋白得率:以50體積BCA試劑加I體積Cu試劑(50: I)配制成工作液，在96孔板中加入20ul上清液/標準品與200ul工作液，37°C孵育15分鐘。用酶標儀在562nm讀數(shù)，所得上清液OD值(0D值高表示蛋白濃度高)如表I。表1提取液濃度初篩(0D值)
權(quán)利要求
1.一種糞便蛋白提取試劑盒，其中包括:糞便取樣器、15ml離心管、提取液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述糞便取樣器由如圖結(jié)構(gòu)的金屬或塑料制品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取液，其特征在于，所述的提取液含0.1M-1M磷酸鹽與1M-9M尿素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的提取液，其特征在于，所述的提取液含0.3M磷酸鹽與3.0M尿素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取液，其特征在于，所述的提取液含0.05M-2.0M Tris0
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的提取液，其特征在于，所述的提取液含0.15M Tris0
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取液，其特征在于，所述的提取液PH為8.0-9.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的提取液，其特征在于，所述的提取液pH為8.5。
9.一種糞便樣本中蛋白提取純化的方法，包括步驟: (1)樣品取樣稱量； (2)用權(quán)利要求1-4任一所述的試劑盒進行提取純化，用取樣器取出糞便樣本，用電子天平稱量，連同取樣器一起放入15ml離心管中；將提取液稀釋2倍，按V: W = 50的比例將稀釋后的處理液加入離心管中，充分混勻，震蕩20分鐘，取Iml粗提液至1.5mlEP管，2000轉(zhuǎn)離心20分鐘，取上清液，即提取出糞便蛋白； (3)分析蛋白得率。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種糞便蛋白萃取方法與試劑，屬于蛋白質(zhì)提取純化領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的糞便蛋白提取和純化試劑盒包括糞便取樣器、微孔板和提取液。本發(fā)明的糞便蛋白萃取方法用機械處理與提取液的聯(lián)合作用可有效提取糞便中蛋白以供檢測，具有簡便、得率高、樣本量小、減少污染等特點，可用于糞便蛋白標本酶聯(lián)免疫等檢測的前處理。
文檔編號G01N1/28GK103149067SQ20131006227
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者朱凡, 武書, 陳菲 申請人:蘇州和銳醫(yī)藥科技有限公司