專利名稱：Hplc-dad法同時(shí)測(cè)定苦碟子注射液中10種核苷類成分含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定苦碟子注射液中10種核苷類成分含量的方法。屬于中藥成分分析領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有技術(shù)中，苦碟子別名滿天星，苦荬菜，主要分布于我國(guó)東北及內(nèi)蒙古等地，為菊科植物抱莖苦荬菜(Ixeris sonchifolia(Bge.)Hance)的當(dāng)年生干燥全草,性寒，味苦、辛，具有清熱解毒、排膿止痛之功效[1]?？嗟?碟脈靈)注射液是以苦碟子為原料提取精制而成的靜脈注射液，具有活血化瘀，改善微循環(huán)的作用[2]。該注射液已上市多年，療效確切。實(shí)驗(yàn)研究表明，苦碟子注射液化學(xué)成分比較復(fù)雜，而與其臨床療效相關(guān)的主要活性成分為核苷類、有機(jī)酸類和黃酮類成分?？嗟幼⑸湟?曾用名:碟脈靈注射液)列入國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025450),由通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。處方:抱莖苦荬菜IOOOg,制成1000ml。制法:取抱莖苦荬菜,加水煎煮二次,第一次I小時(shí)，第二次0.5小時(shí),合并煎液，濃縮至每Iml相當(dāng)于原生藥0.5g,放冷至40°C以下，在攪拌下加10%氧化I丐乳調(diào)節(jié)pH值至10，放置12小時(shí)，離心，離心沉淀物稱重，懸浮于5.3倍量95%乙醇中(使含醇量達(dá)80%)，力口50%硫酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3 — 4，充分?jǐn)嚢枋狗磻?yīng)完全，離心，離心液加40%氫氧化鈉溶液中和PH值至7.0,濾過，濾液回收乙醇，并揮盡乙醇，用注射用水稀釋至每Iml相當(dāng)于原生藥4g，置-5°C以下放置12小時(shí)以上，濾過，濾液加0.1 — 0.2%藥用活性炭粉末，煮沸15分鐘，置_5°C以下放置24小時(shí)以上，濾過，濾液加注射用水稀釋至規(guī)定量，調(diào)節(jié)pH值至7.0 -
7.5，濾過，灌封，滅菌，即得。性狀:本品為淺黃棕色至黃棕色的澄明液體。含量測(cè)定:本品每IOml含總黃酮以無水蘆丁(C27H3tlO16)計(jì)，不得少于4.0mg0含抱莖苦荬菜以腺苷(CltlH12N5O4)計(jì)，不得少于0.025mg。功能主治:活血止痛，清熱祛瘀。用于瘀血閉阻的胸痹，證見:胸悶、心痛，口苦，舌暗紅或存瘀斑等。適用于冠心病、心絞痛見上述病狀者。亦可用于腦梗塞者。用法用量:靜脈滴注，一次10 - 40ml，一日I次；用5%葡萄糖或0.9%氯化鈉注射液稀釋至250 - 500ml后應(yīng)用；14天為一療程；或遵醫(yī)囑。規(guī)格:每支裝(I)10ml, (2) 20ml, (3) 40ml。實(shí)驗(yàn)研究表明，苦碟子注射液化學(xué)成分比較復(fù)雜，而與其臨床療效相關(guān)的主要活性成分為核苷類、有機(jī)酸類和黃酮類成分。核苷類成分是生物細(xì)胞維持生命活動(dòng)的基本組成元素，參與DNA代謝過程，通過激活人體中的嘌呤受體發(fā)揮多種生理作用。如胞苷(cytidine)具有抗腫瘤和抗病毒等作用；尿苷(uridine)參與糖原合成，有助于提高細(xì)胞的耐缺氧能力，提高機(jī)體抗體水平，并可以阻斷癌細(xì)胞和病毒的基因合成；鳥苷(guanosine)具有免疫調(diào)節(jié)的生理活性；特別是腺苷(adenosine)具有抗心肌缺血、抗凝血、抗炎、改善心腦血液循環(huán)、防止心率失常、抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放和調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶活性等作用，是苦碟子注射液質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。因此，為了控制產(chǎn)品質(zhì)量，對(duì)苦碟子注射液中的核苷類化合物建立快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的測(cè)定方法具有重要的實(shí)際意義。目前，核苷類化合物含量測(cè)定方法主要有紫外分光光度法、薄層色譜法、高效液相-質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法等。紫外法與薄層法特異性較差，液-質(zhì)與毛細(xì)管電泳法對(duì)儀器要求較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述不足而提供一種采用HPLC-DAD技術(shù)建立同時(shí)測(cè)定10種核苷類化合物(5種核苷:尿苷、腺苷、鳥苷、胞苷、胸苷和5種堿基:尿嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶)成分含量的分析方法，并應(yīng)用該方法測(cè)定苦碟子注射液中主要核苷類化合物的含量，以期為注射液水溶性成分的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為其質(zhì)量控制提供方法學(xué)參考依據(jù)。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是=HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定苦碟子注射液中10種核苷類成分含量的方法，其步驟如下:
(O混合對(duì)照品溶液的配制:
分別精密稱取胞嘧啶、尿嘧 啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷對(duì)照品適量，加水制成含胞嘧啶0.50 μ g.mL'尿嘧啶1.20 μ g.mL—1、胞苷17.50yg.mL'鳥嘌呤 20.00 μ g.mL'尿苷 40.00 μ g.mL'胸腺嘧啶 2.50 μ g.mL'腺嘌呤 10.00 μ g.mL—1、鳥苷 50.00 μ g.mL—1、胸苷 10.00 μ g.mL—1、腺苷 20.00 μ g.mL—1 的混合對(duì)照品溶液，超聲溶解，搖勻，即得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。(2)供試品溶液的配制:
取苦碟子注射液(藥品成品)，采用0.45 ym微孔濾膜過濾，作為供試品溶液，待測(cè)。(3)測(cè)定法:采用HPLC-DAD法分別精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入檢測(cè)器，測(cè)定，即得。色譜條件:色譜柱:Diamonsil C18 (2);檢測(cè)波長(zhǎng):260 nm;流速:1 mL.mirT1 ;柱溫:35 °C;進(jìn)樣量:10 μ L ;梯度洗脫條件:0-5min，體積分?jǐn)?shù)為2%乙腈等度洗脫，5-9min線性增加至9%乙腈，9-15min線性增加至11%乙腈，15_25min線性增加至40%乙腈。上述步驟(3)測(cè)定法中包括線性關(guān)系測(cè)定；即分別精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL置于10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，即得胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷分別為0.25 μ g.mr\0.60 μ g.mL'8.75 μ g.mL'10.00 μ g.mL \20.00 μ g.mL \1.25 μ g.mL \5.00 μ g.mL \25.00 μ g.mL \5.00μ g.πιΓ\10.00 Ug -πιΓ1的混合溶液，依次加水稀釋至刻度，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC測(cè)定。上述步驟(3)測(cè)定法中包括精密度測(cè)定；即精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液:胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷的濃度分別為0.125,0.300、
4.375,5.000、10.00,0.625,2.500、12.50,2.500,5.000 μ g.mL-1 的混合溶液，在色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。上述步驟(3)測(cè)定法中包括重復(fù)性實(shí)驗(yàn)；即取苦碟子注射液，平行實(shí)驗(yàn)6次，制成供試溶液，在色譜條件下，分別測(cè)定6次，計(jì)算每種對(duì)照品的色譜峰面積。上述步驟(3)測(cè)定法中包括穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)；即取苦碟子注射液，室溫放置，于0、2、4、
6、8、12 h進(jìn)樣,在色譜條件下,進(jìn)樣分析,記錄峰面積。上述步驟(3)測(cè)定法中包括回收率實(shí)驗(yàn)；即精密量取苦碟子注射液5.0 mL,平行6份，分別置于10 mL量瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品溶液5.0 mL,其中胞嘧啶0.14μ g.mL'尿嘧啶 0.27 μ g.mL—1、胞苷 3.10 μ g.mL'鳥嘌呤 4.60 μ g.mL—1、尿苷 6.00μ g.mL'胸腺嘧啶 1.20 μ g.mL'腺嘌呤 2.90 μ g.mL'鳥苷 7.2 μ g.mL'胸苷 1.60μ g.mL'腺苷5.00 μ g.mL-1搖勻,在色譜條件下,進(jìn)樣分析,記錄峰面積,計(jì)算加樣回收率。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，核苷類成分在乙腈-水梯度洗脫系統(tǒng)的分離效果更好，且HPLC-DAD法操作簡(jiǎn)便，核苷類成分在適宜的色譜條件下可以獲得理想的分離效果，在本發(fā)明選定的色譜條件下，苦碟子注射液中核苷類物質(zhì)的色譜峰15min內(nèi)既可完成分析，分離效果良好，該法測(cè)定快速、結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性良好，是一種測(cè)定苦碟子注射液中核苷類成分的可靠方法，可為苦碟子注射液品質(zhì)評(píng)價(jià)體系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2、通過對(duì)18批苦碟子注射液中核苷類成分的分析，結(jié)果表明，該注射液中含有9種核苷，其中含量較高的有鳥苷、尿苷、腺苷、鳥嘌呤及胞苷等，不同批次注射液中各核苷含量具有一定的差異，但與臨床療效相關(guān)的腺苷批間差異較小。說明以核苷為指標(biāo)的注射劑生產(chǎn)工藝較為穩(wěn)定，也提示應(yīng)對(duì)其他核苷類成分開展相關(guān)研究，以期對(duì)苦碟子注射液的質(zhì)量及安全性進(jìn)行更加全面的評(píng)價(jià)。3、本發(fā)明所建立同時(shí)測(cè)定苦碟子注射液中10種核苷類成分的分析方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，準(zhǔn)確可靠，可為苦碟子注射液質(zhì)量控制提供依據(jù)。下面將結(jié)合附圖、實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。


圖1是本發(fā)明混合對(duì)照品溶液HPLC譜圖。圖2是本發(fā)明供試品溶液HPLC譜圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定苦碟子注射液中10種核苷類成分含量的方法:
I儀器與試藥
1.1儀器
Waters-e2695-HPLC系統(tǒng)(包括四元梯度泵，在線真空脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，2998光電二極管陣列檢測(cè)器PDA, Empower 2色譜工作站)，Sartorius ΒΤ12 型分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)，KH 2200Β型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)
1.2試藥
胞嘧啶對(duì)照品(批號(hào):C94998BGF0，天津希恩思生化科技有限公司)；尿嘧啶對(duì)照品(批號(hào):100469-200401，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；胞苷對(duì)照品(批號(hào):101056874，SIGMA公司)；鳥嘌呤對(duì)照品(批號(hào):HCCTH-BG，上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；尿苷對(duì)照品(批號(hào):1001290893，SIGMA公司);胸腺嘧啶對(duì)照品(批號(hào):T55620BGF0，天津希恩思生化科技有限公司);腺嘌呤對(duì)照品(批號(hào):A73241BGF0，天津希恩思生化科技有限公司);鳥苷對(duì)照品(批號(hào):G24210BGQ0，天津希恩思生化科技有限公司)；胸苷對(duì)照品(批號(hào):T55590BGF0，天津希恩思生化科技有限公司)；腺苷對(duì)照品(批號(hào):110879-200202，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，所有對(duì)照品純度經(jīng)HPLC峰面積歸一化法計(jì)算大于99%?？嗟幼⑸湟?通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，批號(hào):120311T、120312T、120314Τ、120315Τ、120316Τ、120317Τ、129318Τ、120319Τ、120312、120532、120109、I10601、111011、120438、120625、120209、111105、111218)。乙腈(色譜純，SIGMA 公司)，甲醇(色譜純，天津康科德科技有限公司)，超純水，其他試劑均為分析純。2方法與結(jié)果
2.1混合對(duì)照品溶液的配制
分別精密稱取胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷對(duì)照品適量，加水制成含胞嘧啶0.50 μ g.mL'尿嘧啶1.20 μ g.mL—1、胞苷17.50yg.mL'鳥嘌呤 20.00 μ g.mL'尿苷 40.00 μ g.mL'胸腺嘧啶 2.50 μ g.mL'腺嘌呤 10.00 μ g.mL—1、鳥苷 50.00 μ g.mL—1、胸苷 10.00 μ g.mL—1、腺苷 20.00 μ g.mL—1 的混合對(duì)照品溶液，超聲溶解，搖勻，即得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。2.2供試品溶液的配制
取苦碟子注射液，采用0.45 ym微孔濾膜過濾，作為供試品溶液，待測(cè)。2.3色譜條件
色譜柱:Diamonsil C18 (2) (200 mmX4.6 mm, 5 μ m);檢測(cè)波長(zhǎng):260 nm;流速:1mL.mirT1 ;柱溫:35 V ;進(jìn)樣量:10 μ L ;梯度洗脫條件:0_5min，體積分?jǐn)?shù)為2%乙腈等度洗脫，5-9min線性增加至9%乙腈，9_15min線性增加至11%乙腈，15_25min線性增加至40%乙腈。2.4專屬性實(shí)驗(yàn)
在“2.3”項(xiàng)色譜條件下，胞嘧啶，尿嘧啶，胞苷，鳥嘌呤，尿苷，胸腺嘧啶，腺嘌呤，鳥苷，胸苷，腺苷的混合對(duì)照品溶液和苦碟子注射液供試品溶液的HPLC譜圖見圖1、2，混合對(duì)照品及苦碟子注射液供試品中10種核苷類成分達(dá)到基線分離。參見圖1、2，I胞嘧啶，2尿嘧啶，3胞苷，4鳥嘌呤，5尿苷，6胸腺嘧啶，7腺嘌呤，8鳥苷，9胸苷，10腺苷。2.5線性關(guān)系考察
分別精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液(胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷分別為 0.50 μ g.ιιιΓ\ .20 μ g.mL'17.50 μ g.mL'20.00Ug* mL_1>40.00 μ g.mL_1>2.50 μ g.mL—1、10.00 μ g.mL'50.00 μ g.mL—1、10.00yg.mdOO μ g mr1的混合溶液)5 mL置于10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，即得胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷分別為0.25 μ g mL—1、
0.60 μ g.mL \8.75 μ g.mL \ 10.0O μ g.mL \20.0O μ g.mL \1.25 μ g.mL \5.0Oμ g.mL'25.0O μ g.mL_1>5.0O μ g.mL—1、10.0O μ g.mL—1 的混合溶液,依次加水稀釋至刻度，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC測(cè)定。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得出各個(gè)化合物的回歸方程及相關(guān)系數(shù)， 結(jié)果見表I。結(jié)果表明，10種核苷類成分在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。表I 10種核苷類成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍
權(quán)利要求
1.一種HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定苦碟子注射液中10種核苷類成分含量的方法，其特征在于步驟如下: (O混合對(duì)照品溶液的配制: 分別精密稱取胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷對(duì)照品適量，加水制成含胞嘧啶0.50 μ g.mL'尿嘧啶1.20 μ g.mL—1、胞苷17.50yg.mL-1、鳥嘌呤 20.00 yg iL-1、尿苷 40.00 μ g.mL'胸腺嘧啶 2.50 μ g.mL'腺嘌呤 10.00 μ g.mL—1、鳥苷 50.00 μ g.mL—1、胸苷 10.00 μ g.mL—1、腺苷 20.00 μ g.mL—1 的混合對(duì)照品溶液，超聲溶解，搖勻，即得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液； (2)供試品溶液的配制: 取苦碟子注射液，采用0.45 μ m微孔濾膜過濾，作為供試品溶液，待測(cè)； (3)測(cè)定法:采用HPLC-DAD法分別精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入檢測(cè)器，測(cè)定，即得； 色譜條件:色譜柱:Diamonsil C18 (2);檢測(cè)波長(zhǎng):260 nm ;流速:1 mL *min_1 ;柱溫:35°C;進(jìn)樣量:10 μ L ;梯度洗脫條件:0-5min，2%乙腈等度洗脫，5_9min線性增加至9%乙腈，9-15min線性增加至11%乙腈，15_25min線性增加至40%乙腈。
2.按照權(quán)利要求1所述的HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定苦碟子注射液中10種核苷類成分含量的方法，其特征在于步驟(3)測(cè)定法中包括線性關(guān)系測(cè)定；即分別精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL置于10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，即得胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷分別為0.25 yg*mr\0.60 μ g.mL'8.75 μ g.mL'10.00 μ g.mL \20.00 μ g.mL \1.25 μ g.mL \5.00 μ g.mL \25.00 μ g.mL \5.00μ g.πιΓ\10.00 Ug -πιΓ1的混合溶液，依次加水稀釋至刻度，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC測(cè)定。
3.按照權(quán)利要求1所述的HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定苦碟子注射液中10種核苷類成分含量的方法，其特征在于步驟(3)測(cè)定法中包括精密度測(cè)定；即精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液:胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷的濃度分別為0.125、0.300,4.375,5.000、10.00,0.625,2.500、12.50,2.500,5.000 μ g.ml/1 的混合溶液，在色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。
4.按照權(quán)利要求1所述的HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定苦碟子注射液中10種核苷類成分含量的方法，其特征在于步驟(3)測(cè)定法中包括重復(fù)性實(shí)驗(yàn)；即取苦碟子注射液，平行實(shí)驗(yàn)6次，制成供試溶液，在色譜條件下，分別測(cè)定6次，計(jì)算每種對(duì)照品的色譜峰面積。
5.按照權(quán)利要求1所述的HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定苦碟子注射液中10種核苷類成分含量的方法，其特征在于步驟(3)測(cè)定法中包括穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)；即取苦碟子注射液，室溫放置，于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣,在色譜條件下,進(jìn)樣分析,記錄峰面積。
6.按照權(quán)利要求1所述的HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定苦碟子注射液中10種核苷類成分含量的方法，其特征在于步驟(3)測(cè)定法中包括回收率實(shí)驗(yàn)；即精密量取苦碟子注射液5.0 mL,平行6份，分別置于10 mL量瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品溶液5.0 mL，其中胞嘧啶0.14μ g.mL'尿嘧啶 0.27 μ g.mL—1、胞苷 3.10 μ g.mL'鳥嘌呤 4.60 μ g.mL—1、尿苷 6.00μ g.mL'胸腺嘧啶 1.20 μ g.mL'腺嘌呤 2.90 μ g.mL'鳥苷 7.2 μ g.mL'胸苷 1.60μ g.mL'腺苷5.00 μ g.mL-1搖勻,在色譜條件下,進(jìn)樣分析,記錄峰面積,計(jì)算加樣回收率。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定苦碟子注射液中10種核苷類成分含量的方法。屬于中藥成分分析領(lǐng)域。其步驟如下(1)混合對(duì)照品溶液的配制。2)供試品溶液的配制。(3)測(cè)定法:采用HPLC-DAD法分別精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入檢測(cè)器，測(cè)定，即得。色譜條件色譜柱DiamonsilC18(2)；檢測(cè)波長(zhǎng)260nm；流速1mL·min-1；柱溫35℃；進(jìn)樣量10μL；梯度洗脫條件0-5min，體積分?jǐn)?shù)為2%乙腈等度洗脫，5-9min線性增加至9%乙腈，9-15min線性增加至11%乙腈，15-25min線性增加至40%乙腈。本發(fā)明所建立同時(shí)測(cè)定苦碟子注射液中10種核苷類成分的分析方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，準(zhǔn)確可靠，可為苦碟子注射液質(zhì)量控制提供依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N30/02GK103149301SQ20131007106
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月7日
發(fā)明者劉睿, 馬思萌, 任曉亮, 李遇伯, 張艷軍 申請(qǐng)人:通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司