專利名稱：一種基于γ-Fe₂O₃納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種致病菌的快速檢測方法，尤其涉及一種基于Y -Fe2O3納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法。
背景技術(shù)：
基本原理:單克隆抗體或抗原分子與酶分子通過共價鍵結(jié)合，這種結(jié)合不會改變單克隆抗體、抗原和酶的免疫學特性及生物活性，特異性的單克隆抗體只會與特異性的抗原結(jié)合。其主要的原理步驟:1.向待檢樣本中加入目標菌的第I抗體，若存在目標菌，則與I抗結(jié)合形成I抗復合物；2.利用磁性F-Fe2O3納米粒子，通過修飾抗體實現(xiàn)表面功能化，將I抗的抗體即2抗偶聯(lián)在磁珠表面，形成特異性免疫磁珠，并將多余活性位點封閉。2.將另一部分目標菌的特異性I抗單克隆抗體采用一定的方法固定在固相載體表面，并將多余活性位點封閉。3.將第2步制備的2抗特異性免疫磁珠加入到第I步的待檢樣本中，用于抓取富集目標菌，通過外加磁場將磁珠分離出來，此時，結(jié)合了目標菌的I抗復合物和沒有結(jié)合目標菌的過量I抗都會與磁珠表面的2抗結(jié)合，還是混在一起。4.將上述混在一起的磁珠，加到第2步的固相載體表面，則抓取了目標菌的磁珠將與固相載體表面I抗發(fā)生特異性結(jié)合，形成雙抗夾心，用無菌的去離子水清洗可以將未發(fā)生結(jié)合的磁珠洗脫。
5.再采用洗脫劑將固定載體上的結(jié)合的特異性納米免疫磁珠洗下來，磁分離清洗掉離子、溶劑。此部分磁珠如果存在，就是抓取了目標菌的磁珠。由于F-Fe2O3納米粒子具有順磁和超順磁特性，對于磁共振儀器非常敏感，相對于其他分子而言，微量的r -Fe2O3納米粒子能夠大幅降低無菌的去離子水的自旋-晶格馳豫參數(shù)Tl和自旋-自旋弛豫時間T2，而無菌的去離子水在一定的均勻場強下，T1/T2是固定的。將洗脫液置于核磁共振儀中，與無菌的去離子水對照組進行對照。顯著發(fā)生T1/T2值降低的說明有磁珠存在，從而間接說明食品樣品中有致病菌檢出。磁珠含量與T1/T2值降低呈正比。通過加標，可以定量檢測目標菌。該方法中F-Fe2O3納米粒子磁珠既是分離富集的手段，同時F-Fe2O3納米粒子具有的順磁和超順磁特性，又可作為定量檢測的探針。該方法的主要優(yōu)點就是快速、靈敏度高。相對于致病菌的微生物培養(yǎng)2-3天甚至幾天的時間，此方法主要取決于樣品的預處理時間，核磁共振檢測只需幾分鐘。因此，用該方法可做大規(guī)模待檢樣本的陽性篩選，檢出的陽性樣還需用微生物培養(yǎng)進行確證。目前，國內(nèi)外還沒有文獻報道這種方法，但是采用免疫磁珠進行致病菌的富集、目標物的富集等的報道還是很多的，但都沒有采用核磁共振做進一步的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于Y -Fe2O3納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，用于對各種不同的食品樣品進行評價，該方法是一種客觀有效的檢出食品中有害致病菌的方法，從而在某種程度上大大縮減了食品樣品有害致病菌的篩選時間?！N基于F-Fe2O3納米粒子間接富集的核磁共振技術(shù)快速檢測出食品中的有害致病菌的方法。利用核磁共振儀對順磁、超順磁物質(zhì)的響應敏感性，提出核磁共振弛豫參數(shù)變化與F-Fe2O3納米粒子超順磁免疫磁珠含量的相關(guān)性指標。不同的致病菌檢出下限不同。該方法依賴于建立的可用于食品樣品中有害致病菌特征性免疫磁珠富集、分離，從核磁共振弛豫信號參數(shù)變化的角度，檢測出樣品中的有害致病菌；采用目標菌的I抗標記形成I抗復合物；采用偶聯(lián)I抗抗體即2抗的超順磁免疫磁珠，可以將樣品中的特異性致病菌進行富集并分離；由于核磁共振儀自旋-晶格弛豫效率和自旋-自旋弛豫效率對r -Fe2O3納米粒子非常敏感,即在去離子水中，存在微量的超順磁F-Fe2O3納米粒子，則水的自旋-晶格弛豫時間(Tl)和/自旋-自旋弛豫(T2)就會顯著下降。在一定條件下，超順磁免疫磁珠的順磁特性使核磁共振的弛豫衰減信號T2/T1產(chǎn)生線性減小。通過定量檢測出樣品中的免疫磁珠含量，從而可以間接定量出食品樣品中的有害致病菌含量。檢測出的致病菌含量與磁珠含量線性相關(guān)，擬合度較好。最終以超順磁免疫磁珠與致病菌間的對應關(guān)系為紐帶，確定食品樣本中的致病菌菌落數(shù)。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，步驟如下:
O向待檢樣本中加入目標菌的第I抗體，若存在目標菌，則與I抗結(jié)合形成I抗復合
物；
2)2抗即第I抗體的抗體免疫磁珠的制備；
3)將目標菌特異性I抗單克隆抗體固定在固相載體表面；
4)免疫磁珠富集目標菌株，并分離:將第2步制得的2抗免疫磁珠加入第I步的待檢樣品，充分混合震蕩，抓取目標菌后通過施加外加磁場，則磁珠就匯集到磁場一邊，吸走上清液則可以分離出磁珠若待檢樣本中有目標菌，則被磁珠所富集，加少量無菌的去離子水則形成目標菌的磁珠懸濁液；此時，結(jié)合了目標菌的I抗復合物和沒有結(jié)合目標菌的過量I抗都會與磁珠表面的2抗結(jié)合,還是混在一起。4)將富集的磁珠懸濁液加到第3步制作的固定了 I抗單克隆抗體的固相載體上，若存在目標菌則形成雙抗夾心；用無菌的去離子水清洗，則沒有抓取到目標菌的磁珠就被洗掉，若不存在目標菌，則所有磁珠都被洗掉；
5)之后，用洗脫劑將固定板上的雙抗夾心的磁珠洗下來，用外加磁場分離磁珠的方法用無菌的去離子水清洗掉離子和溶劑，如果還存在磁珠就是抓到目標菌的磁珠；
6)這部分磁珠，加入無菌的去離子水形成磁珠的懸濁液，進行核磁共振的弛豫時間測定，以無菌的去離子水為空白，測得的懸濁液的弛豫時間T1/T2相比無菌的去離子水有顯著降低，則說明含有磁珠，從而間接證明樣本中有目標致病菌，磁珠的量與T1/T2的下降呈正比，可以通過定量磁珠而間接定量出目標菌的量。所述NMR納米探針為F-Fe2O3納米粒子,納米粒徑小于1000納米。所述的目標菌的最終檢出評價方法基于核磁共振技術(shù)的弛豫時間特性參數(shù)的變化。所述弛豫時間特性，是指自旋-晶格弛豫時間(Tl)和自旋-自旋弛豫時間(T2)。所述弛豫時間特性，Tl采用180° - τ -90°脈沖方法測定，Τ2采用CPMG序列方法測定。所述的I抗指目標菌的單克隆抗體，2抗指第I抗體的抗體，可以是單抗也可以是多抗。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供一種客觀的快速檢測出食品中的有害致病菌的方法，其特征是依賴于建立的可用于檢測超順磁免疫磁珠的核磁共振檢測方法。該方法可以客觀有效地對食品中有害致病菌進行檢測，相比于致病菌的生物培養(yǎng)確認，該方法具有快速檢測的優(yōu)勢，可以用于大規(guī)模樣本的快速篩選。
具體實施例方式實例I
檢驗食品樣本中測定其是否含有有害致病菌——李斯特菌。1.2抗免疫磁珠制備:1抗米用李斯特囷的兔抗IgG單克隆抗體，2抗為李斯特囷的羊抗兔IgG，可以是單抗也可以是多抗。2抗免疫磁珠制備:磁珠與單克隆抗體的偶聯(lián)。采用商品化的羧基化磁珠，或采用微乳液法自行制備Y-Fe2O3納米微球，通過包被修飾成羧基化磁珠或氨基化磁珠。以羧基化磁珠為例，其與2抗偶聯(lián)步驟:①清洗:分別取5mg羧基化磁珠于5mL離心管中，2mL PB (0.02M, pH=6.0)洗2次，洗滌后用2mL MES (0.05M,pH=6.0)重懸；②活化:超聲使磁珠分散，再分別加入Img EDC, Img NHSS (用0.05M，pH=6.0MES溶解)，25°C活化2h，旋轉(zhuǎn)儀15r/min保持懸浮狀態(tài)；③偶聯(lián):磁分離，吸去上清，2mL PB(0.02M, pH=7.4)洗滌一次并轉(zhuǎn)移至新的離心管，3mL PB (0.02M, pH=7.4)重懸，超聲使磁珠分散。再分別將275 μ g第2抗體羊抗兔IgG加入到已活化磁珠中，25V偶聯(lián)3h，旋轉(zhuǎn)儀15r/min保持懸浮狀態(tài)；④封閉:磁分離，取出上清(上清中的蛋白含量待檢)，加入lmg/mL乙醇胺及l(fā)mg/mL BSA封閉(0.02M，pH=7.4的PB溶解，并調(diào)節(jié)pH至中性)，25°C封閉2h，旋轉(zhuǎn)儀15r/min保持懸浮狀態(tài)；⑤保存:0.0lM PBS洗滌磁珠2次，磁分離，去上清，用3mL pH7.4PB (0.02M, 0.02% NaN3，0.5%BSA)重懸，存于4°C。制備的免疫磁珠備用。2.1抗單克隆抗體固定:可以采用常規(guī)的酶標板固定方法，也可以采用以下方法。用干凈的蓋玻片5 X 5_2正方形，鍍膜機先噴一層Cr (2-4 nm)用以幫助固定金。再用在表面濺射噴上一層納米金，再采用200微升2 mmol 二硫基-琥珀酰亞胺-丙酸酯(DSP)對納米金進行修飾(DMS0，二甲基亞砜稀釋DSP)。加入李斯特菌的兔抗IgG單克隆單抗，SP將100 β LlOO β g/mL單克隆抗體通過共價偶聯(lián)法固定在玻璃板上并37 °C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，I小時，將板上剩余的活性位點進行封閉并干燥。3.將食品樣本進行預處理，必要時采用FDA增菌法，對樣品進行過濾、增菌活化等預處理，得到待檢樣本。將待檢樣本中加入第I抗體，李斯特菌的兔抗IgG。若待檢樣本中存在李斯特菌，將與I抗形成I抗復合物。將第I步制得的第2抗體李斯特菌的羊抗兔IgG磁珠加入后進行充分震蕩。上磁力架分離磁珠，加少量無菌的去離子水得到磁珠的懸濁液。此時，如果待檢樣本中有目標李斯特菌，則通過第2抗體與第I抗體的相互作用，從而捕獲該復合物，達到了目標菌富集的目的。此時，結(jié)合了目標菌的I抗復合物和沒有結(jié)合目標菌的過量I抗都會與磁珠表面的2抗結(jié)合,還是混在一起。將此富集的磁珠懸池液加到第2步所制備的I抗固定板上，則磁珠乳液中結(jié)合了李斯特菌的磁珠會進一步與固定板上的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成雙抗夾心結(jié)構(gòu)。此時用無菌的去離子水清洗，就可以將沒有結(jié)合李斯特菌的磁珠洗去。在固定板上剩下的就只有結(jié)合了李斯特菌的磁珠。
4.用洗脫液(甲醇等)將固定板上的結(jié)合了李斯特菌的磁珠洗脫下來。上磁力架，分離磁珠并清洗1-2次，將離子、溶劑洗去。得到的溶液，用核磁共振儀(NMR20，紐邁公司)測定溶液的Tl和T2。以無菌的去離子水為空白，溶液測得的T1/T2與空白相比較，有顯著差異，說明溶液中有磁珠存在，從而說明樣本中有李斯特菌，磁珠的量與T1/T2的下降值呈正比。下降的越多說明磁珠越多，從而間接說明李斯特菌越多，通過加標驗證可以定量檢測樣本中目標菌的數(shù)目。
具體實施例方式實例2
測定食品樣品是否含有有害致病菌大腸桿菌0157:H7。1.2抗免疫磁珠制備:1抗采用0157:H7的兔抗IgG單克隆抗體，2抗為0157:H7的羊抗兔IgG，可以是單抗也可以是多抗。2抗免疫磁珠制備:磁珠與單克隆抗體的偶聯(lián)。采用商品化的羧基化磁珠，或采用微乳液法自行制備Y-Fe2O3納米微球，通過包被修飾成羧基化磁珠或氨基化磁珠。以羧基化磁珠為例，其與2抗偶聯(lián)步驟:①清洗:分別取5mg羧基化磁珠于5mL離心管中，2mL PB (0.02M, pH=6.0)洗2次，洗滌后用2mL MES (0.05M,pH=6.0)重懸；②活化:超聲使磁珠分散，再分別加入Img EDC, Img NHSS (用0.05M，pH=6.0MES溶解)，25°C活化2h，旋轉(zhuǎn)儀15r/min保持懸浮狀態(tài)；③偶聯(lián):磁分離，吸去上清，2mL PB(0.02M，pH=7.4)洗滌一次并轉(zhuǎn)移至新的離心管，3mL PB (0.02M,pH=7.4)重懸，超聲使磁珠分散。再分別將275 μ g第2抗體加入到已活化磁珠中，25V偶聯(lián)3h，旋轉(zhuǎn)儀15r/min保持懸浮狀態(tài)；④封閉:磁分離，取出上清(上清中的蛋白含量待檢)，加入lmg/mL乙醇胺及Img/mL BSA封閉(0.02M，pH=7.4的PB溶解，并調(diào)節(jié)pH至中性)，25°C封閉2h，旋轉(zhuǎn)儀15r/min保持懸浮狀態(tài)；⑤保存:0.0lM PBS洗滌磁珠2次，磁分離，去上清，用3mL pH7.4 PB (0.02M,
0.02% NaN3，0.5%BSA)重懸，存于4°C。制備的免疫磁珠備用。2.1抗單克隆抗體固定:可以采用常規(guī)的酶標板固定方法，也可以采用以下方法。用干凈的蓋玻片5 X 5_2正方形，鍍膜機先噴一層Cr (2-4 nm)用以幫助固定金。再用在表面濺射噴上一層納米金，再采用200微升2 mmol 二硫基-琥珀酰亞胺-丙酸酯(DSP)對納米金進行修飾(DMS0，二甲基亞砜稀釋DSP)。加入0157:H7兔抗IgG單克隆抗體，即將100 β LlOO β g/mL單克隆抗體通過共價偶聯(lián)法固定在玻璃板上并37 °C孵育45 min。加入牛血清蛋白將板上剩余的活性位點進行封閉并干燥。3.將食品樣本進行預處理，對樣品進行過濾、增菌活化等預處理，得到待檢樣本。將待檢樣本中加入第I抗體，0157:H7的兔抗IgG。若待檢樣本中存在0157:H7，將與I抗形成I抗復合物。將第I步制得的第2抗體0157:H7的羊抗兔IgG抗體磁珠加入后進行充分震蕩。上磁力架分離磁珠，加少量水得到磁珠的乳液。此時，如果待檢樣本中有目標大腸桿菌0157:H7，則通過第2抗體與第I抗體的相互作用，從而捕獲該復合物，達到了目標菌富集的目的。此時，結(jié)合了目標菌的I抗復合物和沒有結(jié)合目標菌的過量I抗都會與磁珠表面的2抗結(jié)合，還是混在一起。將此富集的磁珠懸濁液加到第2步所制備的I抗固定板上，則磁珠懸濁液中結(jié)合了大腸桿菌0157:H7的磁珠會進一步與固定板上的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成雙抗夾心結(jié)構(gòu)。此時用無菌的去離子水清洗，就可以將未結(jié)合大腸桿菌0157:H7的磁珠洗去。在固定板上剩下的就只有結(jié)合了大腸桿菌0157:H7的磁珠。
4.用洗脫液(甲醇等)將固定板上的結(jié)合了大腸桿菌0157:H7的磁珠洗脫下來。上磁力架，分離磁珠并用無菌的去離子水清洗1-2次，將離子、溶劑洗去。得到的溶液，用核磁共振儀(NMR20，紐邁公司)測定溶液的Tl和T2，以去離子水為空白，溶液測得的T1/T2與空白比較，有顯著差異，說明溶液中有磁珠存在，從而說明樣本中有大腸桿菌0157:H7,磁珠的量與T1/T2的下降值呈正比。下降的越多說明磁珠越多，從而間接說明大腸桿菌0157:H7越多，通過加標驗證可以定量檢測樣本中目標菌的數(shù)目。
權(quán)利要求
1.一種基于Y-Fe2O3納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特征步驟如下: 1)將檢測目標菌與目標菌的I抗結(jié)合形成I抗復合物； 2)檢測目標菌的I抗抗體，即2抗特異性免疫磁珠的制備； 3)將目標菌I抗特異性單克隆抗體在固相載體上的固定； 4)免疫磁珠富集目標菌株，并分離:將第2步制得的2抗免疫磁珠加入到第I步結(jié)合了 I抗的待檢樣品，充分混合震蕩，抓取目標菌后通過施加外加磁場，則磁珠就匯集到磁場一邊，吸走上清液則可以分離出磁珠，若待檢樣本中有目標菌，目標菌首先與I抗結(jié)合形成復合物，在加入2抗磁珠后，通過2抗與I抗的相互作用，從而捕獲I抗復合物，被磁珠所富集，加少量無菌的去離子水則形成目標菌的磁珠懸濁液； 4)將富集的磁珠懸濁液加到第3步固定了I抗的單克隆抗體的固相載體上，若存在目標菌則形成雙抗夾心，用無菌的去離子水清洗，則沒有抓取到目標菌的磁珠就被洗掉，若不存在目標菌，則所有磁珠都被洗掉； 5)之后，用洗脫劑將固定板上的雙抗夾心的磁珠洗下來，用外加磁場分離磁珠的方法，用無菌的去離子水清洗掉離子和溶劑，如果還存在磁珠就是抓到目標菌的磁珠； 6)這部分磁珠，加入無菌的去離子水形成磁珠的懸濁液，進行核磁共振的弛豫時間測定，在固定場強下，無菌的去離子水的T1/T2是一個恒定值，以無菌的去離子水為空白，測得的懸濁液的弛豫時間T1/T2相比無菌的去離子水有顯著降低，則說明含有磁珠，從而間接證明樣本中有目標致病菌，磁珠的量與T1/T2的下降呈正比，可以通過加標定量磁珠而間接定量出目標菌的量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的 基于Y-Fe2O3納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特征是所述NMR納米探針為r_Fe203納米粒子,納米粒徑小于1000納米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于Y-Fe2O3納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特征是所述的目標菌的最終檢出評價方法基于核磁共振技術(shù)的弛豫時間的變化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于Y-Fe2O3納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特征是所述NMR弛豫時間特性，是指自旋-晶格弛豫時間(Tl)和自旋_自旋弛豫時間(T2)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于Y-Fe2O3納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特征是所述弛豫時間特性，Tl采用180 - τ -90 脈沖方法測定，Τ2采用CPMG序列方法測定。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于Y-Fe2O3納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特征是目標菌先與I抗結(jié)合形成復合物，用2抗特異性免疫磁珠富集、分離，I抗起信號放大作用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于Y-Fe2O3納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特征是I抗指目標菌單克隆抗體，2抗指第I抗體的抗體，可以是單克隆也可以是多克隆抗體。
全文摘要
一種基于γ-Fe2O3納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，屬于食品安全致病菌快速檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明依賴于建立的可以用于食品液體樣本中致病菌的核磁共振檢測方法，利用1抗特異性結(jié)合目標菌，利用γ-Fe2O3納米粒子材料制備2抗免疫磁珠針對性地富集1抗標記的目標菌株，利用γ-Fe2O3納米粒子的順磁和超順磁特性對核磁共振衰減信號弛豫時間的影響，檢測出樣本中是否含有目標致病菌。γ-Fe2O3納米粒子既是富集手段也是檢測探針。不同的具體的對應關(guān)系為順磁免疫磁珠，在一定條件下顯示出線性關(guān)系，即免疫磁珠含量大，樣品的T2/T1值越小，在一定范圍能夠定量檢測目標菌。該方法可以用于食品樣本中有害致病菌的快速檢測，從而可以作為大批待檢樣品的快速篩選。
文檔編號G01N24/08GK103197070SQ20131008358
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月17日
發(fā)明者張錦勝, 唐群, 賴衛(wèi)華 申請人:南昌大學