專(zhuān)利名稱(chēng)：依諾肝素鈉生產(chǎn)過(guò)程中肝素芐基酯的酯化率的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種依諾肝素鈉生產(chǎn)過(guò)程中肝素芐基酯的酯化率的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
肝素類(lèi)藥物是抗凝血藥的首選藥物，使用歷史已有70多年，除具有抗凝血、抗血栓作用外，還有降血脂等作用，但具有生物利用度低、副作用大等缺陷，限制了肝素在臨床上的應(yīng)用。近年來(lái)具有高抗栓活性和低出血副作用的新一代抗凝藥物——低分子量肝素(LMWH)被開(kāi)發(fā)上市。新一代抗凝藥的抗血栓作用優(yōu)于肝素，而抗凝血作用卻低于肝素，并具有生物利用度高、體內(nèi)半衰期長(zhǎng)、出血傾向小、口服易吸收等特點(diǎn)。除用于治療血栓病外，還可抑制動(dòng)脈粥樣硬化，抗腫瘤、抗炎等，且臨床應(yīng)用無(wú)需監(jiān)護(hù)，用藥便捷。
低分子量肝素(LMWH)(Robert J.Linhardt, PH.D.And Nur Sibel Guany, M.S,Seminar in Thrombosis and Hemostasis，1999，25 (3):5-16)是在分離普通肝素時(shí)得到的一些低分子量組分，或肝素裂解后產(chǎn)生的小分子片段，長(zhǎng)度約普通肝素的1/3。LMWH分子量在3000-8000Da之間，平均分子量為5000Da左右。與普通肝素相比，通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在同等劑量下，LMWH的抗凝作用小于肝素，但其體內(nèi)和體外抗血栓作用明顯強(qiáng)于普通肝素。
依諾肝素鈉(Enoxaparin Sodium)作為其中的一種低分子肝素，占有低分子肝素60%以上的市場(chǎng)份額，是最為主要的低分子肝素。它通過(guò)對(duì)豬腸粘膜肝素的芐基酯衍生物進(jìn)行堿解聚而獲得。其中肝素芐基酯的制備中酯化程度的控制是生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵。
肝素芐基酯的酯化程度直接影響依諾肝素成品中1，6_脫水結(jié)構(gòu)、分子量及其分布、活性等關(guān)鍵指標(biāo)的情況，其酯化率決定了后期降解的工藝參數(shù)，從而影響和制約依諾肝素鈉的生產(chǎn)收率和產(chǎn)品成本，但目前還沒(méi)有任何一種對(duì)肝素芐基酯的酯化率進(jìn)行檢測(cè)的方法面世，造成了酯化率控制的實(shí)施困難。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種依諾肝素鈉生產(chǎn)過(guò)程中肝素芐基酯的酯化率的檢測(cè)方法。利用該方法可以簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)肝素芐基酯的酯化率，對(duì)下一步的降工藝解提供數(shù)據(jù)支持，從而實(shí)現(xiàn)控制依諾肝素鈉成品的1，6脫水結(jié)構(gòu)、分子量及其分布、活性等關(guān)鍵指標(biāo)的目的。
本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是按以下方式實(shí)現(xiàn)的:依諾肝素鈉生產(chǎn)過(guò)程中肝素芐基酯的酯化率的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟:
(I)測(cè)試液配制
檢測(cè)液:稱(chēng)取一定量的肝素芐基酯樣品，將樣品置于堿性環(huán)境下使其發(fā)生beta-消除反應(yīng)以生成苯甲醇，反應(yīng)一定時(shí)間后加入冰乙酸終止反應(yīng)，并用超純水稀釋定各，備用;
對(duì)照液:稱(chēng)取一定量的苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)品，加入超純水溶解，備用；
(2)樣品檢測(cè)利用辛基硅膠柱，采用帶紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀對(duì)步驟(I)所述檢測(cè)液和對(duì)照液做進(jìn)樣檢測(cè)，并通過(guò)如下公式計(jì)算得到酯化率X:
權(quán)利要求
1.依諾肝素鈉生產(chǎn)過(guò)程中肝素芐基酯的酯化率的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟: (1)測(cè)試液配制 檢測(cè)液:稱(chēng)取一定量的肝素芐基酯樣品，將樣品置于堿性環(huán)境下使其發(fā)生beta-消除反應(yīng)以生成苯甲醇，反應(yīng)一定時(shí)間后加入冰乙酸終止反應(yīng)，并用超純水稀釋定容，備用；對(duì)照液:稱(chēng)取一定量的苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)品，加入超純水溶解，定容，備用； (2)樣品檢測(cè) 利用辛基硅膠柱，采用帶紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀對(duì)步驟(I)所述檢測(cè)液和對(duì)照液做進(jìn)樣檢測(cè)，并通過(guò)如下公式計(jì)算得到酯化率X:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的依諾肝素鈉生產(chǎn)過(guò)程中肝素芐基酯的酯化率的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(I)中檢測(cè)液的配制過(guò)程為:稱(chēng)取0.5 1.0g肝素芐基酯樣品于反應(yīng)容器中，加入IOml的5mol/L的氫氧化鈉溶液溶解，水浴控溫60 70°C，反應(yīng)120分鐘，加入IOml冰乙酸終止反應(yīng)，用超純化水稀釋定容至100ml，搖勻，備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的依諾肝素鈉生產(chǎn)過(guò)程中肝素芐基酯的酯化率的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟⑵中高效液相色譜儀所用流動(dòng)相為甲醇、乙腈的混合水溶液，甲醇、乙腈、超純水的體積比為10: 20: 70。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的依諾肝素鈉生產(chǎn)過(guò)程中肝素芐基酯的酯化率的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(2)中高效液相色譜儀的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為256nm，流速為1.0±0.lml/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的依諾肝素鈉生產(chǎn)過(guò)程中肝素芐基酯的酯化率的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(2)中辛基硅膠柱的內(nèi)徑為4.6_，長(zhǎng)為150_，每米檢測(cè)柱的理論塔板數(shù)不低于20000。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種依諾肝素鈉生產(chǎn)過(guò)程中肝素芐基酯的酯化率的檢測(cè)方法，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。該方法采用反相液相色譜法，利用帶紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀對(duì)肝素芐基酯在堿性環(huán)境下脫落生成的苯甲醇進(jìn)行定量檢測(cè)，并以此反映肝素芐基酯的酯化率，從而達(dá)到控制依諾肝素鈉成品質(zhì)量的目的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的檢測(cè)方法可以簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)肝素芐基酯的酯化率，從而降低依諾肝素鈉成品的不合格風(fēng)險(xiǎn)和企業(yè)生產(chǎn)成本，具有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N30/02GK103175925SQ20131008828
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月20日
發(fā)明者周霞, 林勇 申請(qǐng)人:山東辰中生物制藥有限公司