專利名稱：一種試劑盒及操作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫測定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種試劑盒及操作方法。
背景技術(shù)：
目前我國對奶牛妊娠檢測仍然主要依靠直腸檢查，并造成了一定的人為性妊娠流產(chǎn)。孕酮是一種留體類激素，常作為反應(yīng)卵巢活動(dòng)的指示劑，在奶牛生產(chǎn)中，通過監(jiān)測機(jī)體孕酮含量變化來檢測奶牛的妊娠、卵巢機(jī)能和繁殖狀況，是預(yù)防和治療母畜繁殖障礙性疾病的一種有效方法。而奶牛乳汁孕酮檢測，可以避免對奶牛本身的應(yīng)激，減少人為對奶牛繁殖的影響，是奶牛機(jī)體孕酮含量測定的有效途徑。國內(nèi)對奶牛乳汁孕酮檢測的研究相對國外還有一定的差距，目前已有相關(guān)試劑盒面世，在臨床應(yīng)用中取得了不錯(cuò)的效果。針對奶牛乳汁孕酮的檢測，本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用自己制備的酶標(biāo)孕酮抗原和孕酮單克隆抗體，建立了孕酮直接競爭ELISA快速檢測方法，應(yīng)用于試劑盒的初步研制。試劑盒的質(zhì)量控制是一個(gè)嚴(yán)重的問題，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)在具體操作時(shí)主要存在技術(shù)誤差、操作誤差和統(tǒng)計(jì)誤差。因此，需要建立一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，以便得到高質(zhì)量的結(jié)果，有助于應(yīng)用與診斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例提供一種試劑盒及操作方法，旨在解決上述問題。本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種試劑盒，所述試劑盒的組成包括:96孔酶標(biāo)板一塊，孕酮標(biāo)準(zhǔn)品ImL及去激素乳8mL，酶標(biāo)記物5mL，底物A液150 μ L和底物B液10mL，終止液5mL及洗漆液20mL。本發(fā)明實(shí)施例還提供一種試劑盒操作方法，所述方法包括下述步驟:利用蒸餾水配制洗滌工作液；取出酶標(biāo)板，利用所述洗滌液洗滌3min/次，洗2次；將去激素乳將孕酮標(biāo)準(zhǔn)品配制成不同梯度的孕酮濃度，各濃度孕酮標(biāo)準(zhǔn)濃度及待檢樣本分別等比例與酶標(biāo)記物混勻后，以100 μ L/孔加入酶標(biāo)板各孔，在37°C濕盒反應(yīng)50min ；取出酶標(biāo)板，倒掉孔內(nèi)液體，洗滌酶標(biāo)板3min/次，洗3次；利用底物B液將底物A稀釋液成工作液，以100 μ L/孔加入酶標(biāo)板，避光反應(yīng)15min ；在酶標(biāo)板中加入終止液50 μ L/孔，終止反應(yīng)；利用酶標(biāo)儀測定0D450nm值。本發(fā)明實(shí)施例通過對ELISA試劑盒相關(guān)試劑穩(wěn)定性的篩選，確定了不同的穩(wěn)定劑及相關(guān)的處理方法，從而保證了試劑盒的保存時(shí)間。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的酶標(biāo)板穩(wěn)定性示意圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的酶標(biāo)抗原穩(wěn)定性示意圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的工作液A穩(wěn)定性示意圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的工作液B穩(wěn)定性示意圖；圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的試劑盒抑制曲線示意圖；圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的試劑盒測定曲線示意圖；圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的試劑盒在37°C保存9天結(jié)合率示意圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明實(shí)施例通過對ELISA試劑盒相關(guān)試劑穩(wěn)定性的篩選，確定了不同的穩(wěn)定劑及相關(guān)的處理方法，從而保證了試劑盒的保存時(shí)間。在本發(fā)明實(shí)施例中，試劑盒的組成包括:96孔酶標(biāo)板一塊,孕酮標(biāo)準(zhǔn)品(40ng/mL) ImL及去激素乳8mL，酶標(biāo)記物5mL，底物A液(100倍濃縮液)150 μ L和底物B液10mL，終止液(2MH2S04) 5mL及洗滌液(10倍濃縮液)20mL。在本發(fā)明實(shí)施例中，為試劑盒整體效果做基礎(chǔ)，需要考慮各個(gè)部分的穩(wěn)定性，各部分穩(wěn)定性篩選如下:1.酶標(biāo)板穩(wěn)定性篩選在本發(fā)明實(shí)施例中，孕酮單克隆抗體在最佳包被、封閉方式處理后，倒掉孔內(nèi)液體；置于溫度30°C、濕度低于30%的條件下處理酶標(biāo)板120min，同時(shí)設(shè)置空白對照。取出酶標(biāo)板用放入干燥、密封的袋中后，分別置于37°C進(jìn)行加速破壞和4°C對照，每天分別拿出一塊，按ELISA法檢測酶標(biāo)板上固相抗體的活性。2.酶標(biāo)記物穩(wěn)定性的篩選在本發(fā)明實(shí)施例中，通過添加不同的穩(wěn)定劑，保證酶標(biāo)記物的酶活性及抗原、抗體的免疫學(xué)活性達(dá)到穩(wěn)定的效果。用配制好的穩(wěn)定劑溶液稀釋酶標(biāo)抗原到工作濃度，同時(shí)設(shè)置空白。配制后的工作液分別置于37°C進(jìn)行加速破壞和4°C對照，并作新鮮對照。每天按直接ELISA法檢測酶標(biāo)抗體工作液的活性。3.顯色系統(tǒng)穩(wěn)定劑的篩選(I) TMB工作液(底物A液)穩(wěn)定性篩選在本發(fā)明實(shí)施例中，用DMA溶解TMB.2Ηα，配制100倍濃縮的底物A液，配制后分別置于37°C進(jìn)行加速破壞和4°C對照。每天按直接ELISA法檢測底物溶液A的活性。⑵H2O2工作液(底物B液)穩(wěn)定性篩選在本發(fā)明實(shí)施例中，將過氧化氫分別稀釋于不同濃度的磷酸-檸檬酸鹽緩沖液(pH5.0)配制成不同濃度的底物B液(B1、B2、B3、B4)的工作液。配制后的工作液分別置于4°C和37°C進(jìn)行加速破壞，并作新鮮對照。每天按直接ELISA法檢測底物溶液B的活性。
4.洗滌劑及終止液的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)室常用的PBST—般置于室溫條件下使用15d左右，其洗滌效果不變，在本發(fā)明實(shí)施例中，采用10倍濃縮的PBST，在使用時(shí)，只須用蒸餾水稀釋后便可使用。終止液應(yīng)用2MH2S04，其酸性穩(wěn)定，可直接應(yīng)用。5.孕酮標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性篩選(I)去激素乳的制備在本發(fā)明實(shí)施例中，采取發(fā)情期奶牛的新鮮乳汁，經(jīng)去激素處理，用于ELISA法測定試驗(yàn)。(2)孕酮標(biāo)準(zhǔn)品的制備用精密天平稱取一定量的孕酮標(biāo)準(zhǔn)品，制成高濃度的孕酮標(biāo)準(zhǔn)品。配制方法如下:首先用去激素乳將高濃度孕酮標(biāo)準(zhǔn)品配制成40ng/mL的孕酮乳樣標(biāo)準(zhǔn)品，再由去激素乳將40ng/mL的孕酮乳樣標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋，配制成40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL>1.25ng/mL、0.625ng/mL、0ng/mL 等濃度標(biāo)準(zhǔn)孕酮乳樣濃度。本發(fā)明實(shí)施例試中劑盒操作方法實(shí)現(xiàn)方式，詳述如下:利用蒸餾水配制洗滌工作液；取出酶標(biāo)板，利用洗滌液洗滌3min/次，洗2次；將去激素乳將孕酮標(biāo)準(zhǔn)品配制成不同梯度的孕酮濃度:40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、l.25ng/mL、0.625ng/mL、0ng/mL,各濃度孕酮標(biāo)準(zhǔn)濃度及待檢樣本分別等比例與酶標(biāo)記物混勻后，以100 μ L/孔加入酶標(biāo)板各孔，在37°C濕盒反應(yīng)50min ；取出酶標(biāo)板，倒掉孔內(nèi)液體，洗滌酶標(biāo)板3min/次，洗3次；利用底物B液將底物A液稀釋成工作液，加入酶標(biāo)板100 μ L/孔，避光反應(yīng)15min ；在酶標(biāo)板中加入終止液50 μ L/孔，終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀測定0D450nm值。在本發(fā)明實(shí)施例中，對上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定如下:(I)精確判定按上述操作，酶標(biāo)儀測定0D450nm值，BO為零孕酮濃度(Ong/mL)抑制時(shí)的OD值，B 為不同孕麗濃度(40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL)抑制時(shí)的 OD 值，代入公式 Logit (B/BO) = Ln [ (B/BO) / (1-B/B0)]，以 Lg[P]為橫坐標(biāo)，Logit (Β/Β0)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,利用Microsoft Excel擬合曲線方程。將所得Β/Β0值代入曲線方程求出乳汁樣品中的孕酮含量。(2)半定量判定避光顯色后，取出酶標(biāo)板根據(jù)孕酮乳樣標(biāo)準(zhǔn)品所顯出的不同深度的藍(lán)色，與待測樣本所顯色進(jìn)行對比，初步確定樣本孕酮的范圍；也可再加入終止液后產(chǎn)生的不同深度的黃色與樣本對比來判斷。在本發(fā)明實(shí)施例中，試劑盒的穩(wěn)定性是評(píng)估試劑盒的重要指標(biāo)。關(guān)于ELISA試劑穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，是通過37°C條件下的加速破壞性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的。根據(jù)唐偉國主編的《醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)診斷試劑的制備與應(yīng)用》，生物試劑在37°C條件下24小時(shí)，相當(dāng)于4 10°C保存一個(gè)半月。因此，在相關(guān)試劑中加入適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑可以使試劑的活性在長時(shí)間內(nèi)得保證，而不失效。生物試劑的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)應(yīng)在實(shí)時(shí)、實(shí)溫條件下進(jìn)行，在加速和強(qiáng)化的條件下獲得的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不能作為最終確定有效期的依據(jù)，但是有助于為有效期提供數(shù)據(jù)支持。本發(fā)明實(shí)施例通過對固相物、酶標(biāo)記物、顯色系統(tǒng)底物A液、底物B液等試劑的穩(wěn)定性做了相關(guān)的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，都是在37°C條件下進(jìn)行。根據(jù)資料，在加入相關(guān)的穩(wěn)定劑或采用不同的處理方法，獲得了良好的效果，相關(guān)試劑能在37°C的破壞性實(shí)驗(yàn)中5天內(nèi)保持良好的活性。試劑盒的參數(shù)的確定，要考慮的因素有很多，主要有特異性、靈敏性、重復(fù)性等質(zhì)量控制因素。試劑盒相關(guān)參數(shù)的確定詳述如下:1.試劑盒的特異性試劑盒的特異性是指特定抗體對特定抗原的特異識(shí)別，是試劑盒對類似物抗干擾能力的指標(biāo)，本發(fā)明實(shí)施例選擇了孕酮(Progesterone)、雌二醇(17-β -Oestradiol)、雌三醇(Oestriol)、睪酮(Testosterone)四種物質(zhì)進(jìn)行交叉反應(yīng)測定。應(yīng)用PBS將四種激素稀釋成系列梯度，對其特異性進(jìn)行測定。2.試劑盒的靈敏性靈敏性是指一定的水平上可與零劑量區(qū)別的劑量，其測定取決于分析方法的選擇，還受到了實(shí)驗(yàn)條件的制約。本發(fā)明實(shí)施例選用8個(gè)不同濃度的孕酮乳樣標(biāo)準(zhǔn)品，且每個(gè)做4個(gè)水平重復(fù)，以孕酮濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以各個(gè)濃度的B/B0值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立曲線方程的同時(shí)，計(jì)算無孕酮抑制的BO值均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。以B0-3SD的值再回歸曲線上所對應(yīng)的孕酮濃度為試劑盒的最小檢出量。3.試劑盒的重復(fù)性重復(fù)性是在相同測量條件下，對同一被測量進(jìn)行連續(xù)多次測量所得結(jié)果之間的一致性，主要取決于人員的素質(zhì)、儀器的性能以及對各種影響量的監(jiān)控。(I)試劑盒的批內(nèi)重復(fù)性選取在4°C保存的同一批組裝好的孕酮檢測試劑盒，定在不同的時(shí)間即連續(xù)4天，每天檢測一次三個(gè)水平的孕酮標(biāo)準(zhǔn)品，按試劑盒操作，確定變異系數(shù)。(2)試劑盒的批間重復(fù)性選取保存于4°C的4個(gè)批次的孕酮檢測試劑盒，同時(shí)檢測三個(gè)水平濃度的孕酮乳樣標(biāo)準(zhǔn)品，并設(shè)定3個(gè)重復(fù)。按試劑盒操作，確定變異系數(shù)。4.試劑盒的穩(wěn)定性同一批次的4個(gè)試劑盒至于4°C保存和37°C做加速破壞實(shí)驗(yàn)，在不同的保存期與新制備的試劑盒同時(shí)進(jìn)行測定，確定試劑盒整體的穩(wěn)定效果。5.試劑盒的準(zhǔn)確度準(zhǔn)確性(Accuracy)是指測量值接近真實(shí)值的程度。通常規(guī)定用回收試驗(yàn)來確定準(zhǔn)確性，其指標(biāo)為回收率?；厥章时硎痉椒ㄊ?，測定的結(jié)果與已知理論濃度相比較，根據(jù)資料報(bào)導(dǎo)試劑盒回收率在90% 110%范圍內(nèi)符合要求。回收率按以下公式計(jì)算:
回收率
添加值(6)試劑盒 樣品測定實(shí)驗(yàn)
利用試劑盒對樣品進(jìn)行初步應(yīng)用實(shí)驗(yàn)，采集三頭奶牛的新鮮乳樣進(jìn)行測定，并同時(shí)對其中一個(gè)樣品做孕酮添加實(shí)驗(yàn)，同時(shí)做PBS稀釋的對照試驗(yàn)。本發(fā)明實(shí)施例經(jīng)過上述測定實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性篩選結(jié)果如下:1.酶標(biāo)板穩(wěn)定性篩選經(jīng)過處理后的固相抗體酶標(biāo)板，置于37°C加速進(jìn)行破壞性實(shí)驗(yàn)，每隔24小時(shí)取出一組按照直接ELISA法檢測固相抗體的活性(0D450nm值)，并做4°C條件及新鮮的對比實(shí)驗(yàn)。2.酶標(biāo)記物穩(wěn)定性篩選加入穩(wěn)定劑后的酶標(biāo)抗原工作液，置于37°C加速進(jìn)行破壞性實(shí)驗(yàn)，每隔24小時(shí)取出一組按照直接ELISA法檢測酶標(biāo)抗原的活性(0D450nm值)，并做4°C條件及新鮮的對比實(shí)驗(yàn)。確定穩(wěn)定劑I對酶標(biāo)抗原的穩(wěn)定性較好，起到了對酶標(biāo)抗原工作液活性穩(wěn)定的效果。酶標(biāo)板穩(wěn)定性及酶標(biāo)抗原穩(wěn)定性示意圖分別如圖1、圖2所示。3.顯色系統(tǒng)穩(wěn)定劑的篩選(I) TMB工作液(底物A液)穩(wěn)定性篩選濃縮的底物A液， 在37°C條件下9天沒有改變活性。底物A液穩(wěn)定性示意圖如圖3所示。⑵H2O2工作液(底物B液)穩(wěn)定性篩選配制的不同濃度底物B液，其中B2溶液，在37°C條件下保存13d后，其活性與新配制的液體的活性，無明顯變化。圖4示出了本發(fā)明實(shí)施例提供的底物B液工作液穩(wěn)定性示意圖。4.試劑盒的特異性按試劑盒操作，測定稀釋后孕酮、睪酮、雌二醇、雌三醇的系列梯度濃度的0D450nm值，繪制競爭抑制曲線。競爭抑制曲線除孕酮隨抑制濃度的增加而逐步下降，其余三種類似激素則趨于平坦，表明試劑盒的特異性較好。圖5示出了本發(fā)明實(shí)施例提供的試劑盒抑制曲線示意圖。5.試劑盒的靈敏性按照試劑盒操作,測定10個(gè)去激素乳樣，并建立Lg[P(ng/mL)]對Β/Β0的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)測定結(jié)果，求出樣本的平均數(shù)(XO)和標(biāo)準(zhǔn)差(S)，計(jì)算X0-3S的0D450nm值，換算成Β/Β0后，再將此值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出試劑盒的靈敏度。試劑盒的靈敏度為0.14ng/mL。試劑盒測定曲線示意圖如圖6所示。試劑盒靈敏性的確定如下表所示:
權(quán)利要求
1.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的組成包括:96孔酶標(biāo)板一塊，孕酮標(biāo)準(zhǔn)品ImL及去激素乳8mL，酶標(biāo)記物5mL，底物A液150 μ L和底物B液10mL，終止液5mL及洗滌液 20mL。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述孕酮標(biāo)準(zhǔn)品濃度為40ng/mL。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述底物A液為100倍濃縮液。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述終止液為2MH2S04。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述洗滌液為10倍濃縮液。
6.一種試劑盒操作方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟: 利用蒸餾水配制洗滌工作液； 取出酶標(biāo)板，利用所述洗漆液洗漆3min/次,洗2次； 用去激素乳將孕酮標(biāo)準(zhǔn)品配制成不同梯度的孕酮濃度，各濃度孕酮標(biāo)準(zhǔn)濃度及待檢樣本分別等比例與酶標(biāo)記物混勻后，以100 μ L/孔加入酶標(biāo)板各孔，在37°C濕盒反應(yīng)50min ；取出酶標(biāo)板，倒掉孔內(nèi)液體，洗滌酶標(biāo)板3min/次，洗3次； 利用底物B液將底物A稀釋液成工作液，以100 μ L/孔加入酶標(biāo)板，避光反應(yīng)15min ； 在酶標(biāo)板中加入終止液50 μ L/孔,終止反應(yīng)； 利用酶標(biāo)儀測定0D450nm值。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述不同梯度的孕酮濃度為:40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL>1.25ng/mL、0.625ng/mL、0ng/mLo
全文摘要
本發(fā)明適用于免疫測定技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種試劑盒及操作方法，所述試劑盒的組成包括96孔酶標(biāo)板一塊，孕酮標(biāo)準(zhǔn)品1mL及去激素乳8mL，酶標(biāo)記物5mL，底物A液150μL和底物B液10mL，終止液5mL及洗滌液20mL。本發(fā)明通過對ELISA試劑盒相關(guān)試劑穩(wěn)定性的篩選，確定了不同的穩(wěn)定劑及相關(guān)的處理方法，從而保證了試劑盒的保存時(shí)間。
文檔編號(hào)G01N33/535GK103163291SQ201310089340
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月9日
發(fā)明者張洪友, 鄭家三, 夏成, 吳凌, 杜曉燕, 徐闖, 高維明 申請人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)