專利名稱：一種在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離和檢測蛋白質(zhì)的技術(shù)，尤其涉及一種在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的裝置和方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是藥物靶點(diǎn)發(fā)掘的一個重要方法。通過比較健康狀態(tài)/疾病狀態(tài)，經(jīng)藥處理/未經(jīng)處理?xiàng)l件下，細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)表達(dá)譜圖的差異，并分離出表達(dá)異常的蛋白質(zhì)加以鑒定，從而找出與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)和藥物治療的可能靶點(diǎn)。二維凝膠電泳(2-DE)和質(zhì)譜(MS)聯(lián)合應(yīng)用是蛋白質(zhì)組學(xué)中分離鑒別蛋白質(zhì)的最常用方法。2-DE可以實(shí)現(xiàn)數(shù)千種蛋白質(zhì)的同時分離，并通過染色得到蛋白質(zhì)的表達(dá)圖譜。MS可以精確測定由蛋白酶(通常為胰蛋白酶)水解得到的多肽片斷的質(zhì)量，通過肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定每一個蛋白質(zhì)。經(jīng)二維凝膠分離后在進(jìn)行染色方能跟蹤蛋白質(zhì)的分離情況。常用的染色方法有考馬斯亮藍(lán)染色、硝酸銀染色(銀染)、熒光標(biāo)記染色、負(fù)染等，這些方法的靈敏度和特點(diǎn)各不相同，其中考馬斯亮藍(lán)染色(coomassie brilliant blue, CBB)和銀染最為常用。考馬斯亮藍(lán)染色的原理是CBB分子上的芳香苯環(huán)與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合，以及其亞硫酸基團(tuán)(_S03_)與蛋白質(zhì)的正電荷結(jié)合，將蛋白質(zhì)染成藍(lán)色條帶。CBB有G250和R250兩種，G250為二甲花青亮藍(lán)，與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)迅速，兩分鐘左右即可達(dá)到平衡，染色后為藍(lán)綠色，常用來測定蛋白質(zhì)含量，也可用來對電泳條帶染色，但是染色后背景較深不易脫色。R250為三苯基甲烷，結(jié)構(gòu)上比G250少兩個甲基，染色后為紅藍(lán)色，R250與蛋白質(zhì)反應(yīng)速度較慢，但染料可以穿透凝膠，而且可以被洗脫下去，因此可用來對電泳條帶進(jìn)行染色?？捡R斯亮藍(lán)染色方法簡單，無毒性，染色后背景及對比度良好，但是靈敏度較低，對于表達(dá)豐度低的蛋白質(zhì)，難以顯色。銀染是一種靈敏度非常高的染色方法，是差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的顯色方式。原理是銀離子與蛋白質(zhì)分子上的羧基(-coo_)結(jié)合生成穩(wěn)定的復(fù)合物，銀離子經(jīng)甲醛還原后成為金屬銀，銀顆粒沉積在蛋白質(zhì)上，使蛋白條帶呈深棕至黑色。銀染的優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高，但是操作較為繁瑣，染色時間長，接觸有毒試劑甲醛，核酸、脂多糖、脂類等化合物易弓I起干擾，參見:Miller I, Crawford J, Gianazza E, Protein stains for proteomicapplications:which, when, why J Proteomics, 2006，6:5385 5408。以電噴霧電離(electrospray ionization, ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(matrix-assisted laser desoption/ionization, MALDI)兩項(xiàng)軟電離技術(shù)為基礎(chǔ)的生物質(zhì)譜，具有自動化程度高、靈敏度高、準(zhǔn)確性好的特點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確測定多肽和蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量、氨基酸的序列及翻譯后修飾。生物質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)使得蛋白質(zhì)快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測成為可能，無可爭議的成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)，推動著蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展。
2-DE (二維凝膠電泳)和MS (質(zhì)譜)是目前最流行、最可靠的蛋白質(zhì)分析平臺，但是蛋白質(zhì)從二維凝膠到質(zhì)譜的樣品處理過程卻非常的繁瑣，難以對膠中所分離的蛋白進(jìn)行后續(xù)的氨基酸組成和序列分析、質(zhì)譜測定等結(jié)構(gòu)鑒定工作或在線定性定量分析。聚丙烯酰胺凝膠是由單體和交聯(lián)劑發(fā)生聚合反應(yīng)生成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，由于遭受到物理障礙，以及固定和染色的影響，生物高聚物(蛋白質(zhì)，核酸等)從凝膠中轉(zhuǎn)移較為困難，只有采用強(qiáng)烈的手段才能使包埋于凝膠內(nèi)的蛋白質(zhì)取出來。目前報(bào)道的可以轉(zhuǎn)移凝膠中蛋白質(zhì)方法包括直接洗脫、電洗脫、膜轉(zhuǎn)印等，具有耗時長、操作繁瑣、重復(fù)性差、容易造成樣品損失和分析物稀釋等缺點(diǎn)，難以滿足蛋白質(zhì)組學(xué)研究的自動化需要。本發(fā)明第一發(fā)明人于1999年首次提出利用毛細(xì)管電泳技術(shù)轉(zhuǎn)移凝膠中蛋白質(zhì)的思想，并于 2004年獲得美國專利 Liu Y D, Bao J J, Methods and apparatus for automaticon-line mult1-dimensional electrophoresis,U.S.Patent, 6676819，2004-01-1。2002年，Lee等開發(fā)了兩電極毛細(xì)管電泳轉(zhuǎn)移法，以細(xì)胞色素C、卵清蛋白、￠-半乳糖苷酶為模型蛋白質(zhì)，成功的從聚丙烯酰胺凝膠中轉(zhuǎn)移出SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，并發(fā)表文章Cooper JW，Gao J, Lee C S，Gel protein capillary extraction apparatus.Electronic proteintransfer, Anal Chem, 2002, 374:1182 118
發(fā)明內(nèi)容
·差異蛋白質(zhì)組學(xué)是發(fā)現(xiàn)藥物作用靶點(diǎn)的重要方法，二維凝膠電泳和質(zhì)譜是分離和鑒定蛋白質(zhì)的核心技術(shù)。經(jīng)二維凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)，在進(jìn)入質(zhì)譜之前需要長時間、繁瑣的樣品處理過程，難以滿足自動化的需要。針對該問題，本發(fā)明提供一種在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的方法，其在線轉(zhuǎn)移凝膠中蛋白質(zhì)采用三電極的轉(zhuǎn)移模式，將蛋白質(zhì)高效、快速的從凝膠中轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管中，通過毛細(xì)管電泳，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)移出來蛋白質(zhì)的再一次分離和檢測。該技術(shù)的開發(fā)大大提高了蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移和進(jìn)一步分離的效率，為二維凝膠電泳和質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)提供了一個有效的方法。本發(fā)明針對目前聚丙烯酰胺凝膠電泳后蛋白質(zhì)點(diǎn)處理繁瑣、時間長、樣品易被稀釋和損失的問題，在本發(fā)明第一發(fā)明人在美國申報(bào)的發(fā)明基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)展和優(yōu)化了基于毛細(xì)管電泳的凝膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移方法。該方法根據(jù)蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移特性，以及毛細(xì)管電泳的電進(jìn)樣原理，將凝膠中的蛋白質(zhì)直接轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管中。轉(zhuǎn)移裝置的核心技術(shù)是毛細(xì)管進(jìn)樣端口和凝膠表面的有效接觸，以及三電極的使用。在毛細(xì)管外面套著的金屬針管上連接零極，在毛細(xì)管的出口端和凝膠的下端分別連接正極和負(fù)極，接通三電極電源后，三個電極的使用產(chǎn)生一個貫穿凝膠和毛細(xì)管的高壓電場，凝膠中蛋白質(zhì)在該電場和毛細(xì)管電滲流泵的驅(qū)動下，很快進(jìn)入毛細(xì)管中。轉(zhuǎn)移結(jié)束后轉(zhuǎn)換裝置，使得蛋白質(zhì)在毛細(xì)管內(nèi)繼續(xù)電泳，實(shí)現(xiàn)分離和檢測。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明用于在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的裝置予以實(shí)現(xiàn)的技術(shù)方案是:包括三電極電源、毛細(xì)管、第一緩沖液槽、第二緩沖液槽、正電極、負(fù)電極、零極，所述毛細(xì)管的柱上設(shè)有檢測器；還包括有一金屬針管。當(dāng)用于在線轉(zhuǎn)移凝膠中的蛋白質(zhì)時，所述金屬針管套在所述毛細(xì)管的進(jìn)樣端上，所述毛細(xì)管的出口端設(shè)置在第一緩沖液槽中，并通過第一緩沖液槽中的正電極與三電極電源的正極相連，所述金屬針管的上端與三電極電源零極相連，所述毛細(xì)管的進(jìn)樣端與凝膠的上面接觸，所述負(fù)電極設(shè)置在所述凝膠的下面，所述負(fù)電極與三電極電源的負(fù)極相連；當(dāng)用于在線分析凝膠中的蛋白質(zhì)時，撤下負(fù)電極、凝膠和金屬針管，直接將零極和毛細(xì)管進(jìn)樣端放入第二緩沖液槽中，所述毛細(xì)管的出口端通過第一緩沖液槽中的正電極與三電極電源的正極相連，所述毛細(xì)管的進(jìn)樣端通過第二緩沖液槽中的零電極與三電極電源的零極相連。本發(fā)明一種在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的方法，采用上述用于在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的裝置，并包括以下步驟:步驟一、利用平板凝膠電泳裝置進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)處理，并將上述處理好的聚丙烯酰胺凝膠用保鮮膜包好，4°C保存；步驟二、取一段熔融石英毛細(xì)管，對該毛細(xì)管進(jìn)行預(yù)處理后備用；步驟三、聚丙烯酰胺凝膠中蛋白質(zhì)的毛細(xì)管電轉(zhuǎn)移:向經(jīng)過預(yù)處理后的毛細(xì)管中充滿pH4-9、10_50mM的運(yùn)行緩沖液，其中，包括添加濃度為0.1到1.2mM的CTAB ;從上述步驟一處理好的聚丙烯酰胺凝膠上切下需要轉(zhuǎn)移的聚丙烯酰胺凝膠，用二甲基亞砜褪色后，根據(jù)膠塊的大小用緩沖液和蒸餾水或用蒸餾水浸泡15 25min后,放在負(fù)電極上,并排除所述負(fù)電極周圍的氣泡；調(diào)整毛細(xì)管的位置,使得毛細(xì)管進(jìn)樣端與聚丙烯酰胺凝膠的表面接觸；轉(zhuǎn)移時，毛細(xì)管的出口端位于第一緩沖液槽中，對所述正電極、零極及負(fù)電極同時施加電壓，并使零極和第一負(fù)電極之間的電壓為-3.0 -6.0V,毛細(xì)管的兩端施加I 12kV高電壓，并根據(jù)轉(zhuǎn)移目的和凝膠中蛋白質(zhì)含量的不同確定轉(zhuǎn)移時間的長短，記錄轉(zhuǎn)移時間和電流變化；步驟四、檢測被轉(zhuǎn)移出來的蛋白質(zhì):轉(zhuǎn)移后，將聚丙烯酰胺凝膠和負(fù)電極、金屬針管撤下，然后將零電極放入到第二緩沖液槽中，將毛細(xì)管的進(jìn)樣端從金屬針管中拿出后插入第二緩沖液槽中，零電極與三電極電源的零極相連，進(jìn)行毛細(xì)管電泳，紫外在線檢測被轉(zhuǎn)移出來的蛋白質(zhì)；上述步驟一至步驟四均在室溫下進(jìn)行。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明開發(fā)了新型三電極的轉(zhuǎn)移方法和垂直方向上電提取和電排出轉(zhuǎn)移技術(shù)，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳的樣品遷移原理，以及毛細(xì)管電泳的電進(jìn)樣原理，建立了一種新型三電極毛細(xì)管電泳方式，通過將小尺寸的毛細(xì)管端口與蛋白質(zhì)凝膠條帶的物理接觸，使得高電壓施加后在接觸面上產(chǎn)生一個強(qiáng)的電場強(qiáng)度，迫使凝膠中帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物電泳遷移至毛細(xì)管內(nèi)，利用毛細(xì)管電泳場放大進(jìn)樣原理，在電場作用下，使凝膠中的蛋白質(zhì)以高濃度的樣品區(qū)帶形式轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管中。該技術(shù)與傳統(tǒng)的電洗脫和膜轉(zhuǎn)印方法相t匕，具有簡單、快速、高效、可在線轉(zhuǎn)移檢測的的巨大優(yōu)勢，經(jīng)過SDS-PAGE分離過的蛋白質(zhì)條帶無論是否經(jīng)過染色處理，均可以進(jìn)行轉(zhuǎn)移，在凝膠蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移中具有重要的理論和實(shí)際價(jià)值，具有很廣泛的實(shí)際應(yīng)用前景。


圖1是凝I父中蛋白質(zhì)遷移不意圖,其中(a)為水平方向遷移,(b)為垂直方向遷移；圖2是本發(fā)明用于在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的裝置的連接示意圖；其中，1-毛細(xì)管；21_第一緩沖液槽，22-第二緩沖液槽；31_正電極，32-負(fù)電極，33為零極；4-金屬針管；5-聚丙烯酰胺凝膠；圖3 Ca)是含BSA樣品的PAGE膠轉(zhuǎn)移結(jié)果示意圖3 (b)是空白PAGE膠轉(zhuǎn)移結(jié)果示意圖；圖3 (a)和圖3 (b)對應(yīng)的轉(zhuǎn)移條件是:毛細(xì)管總長37cm，有效長度30cm，30mM硼砂緩沖液(PH9.2，含0.3mM CTAB),凝膠濃度為10%，含BSA濃度為0.5mg/mL,負(fù)模式進(jìn)樣，毛細(xì)管兩端電勢差為IlkV,轉(zhuǎn)移時間為60s ；圖4是凝膠兩端電壓對蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率的影響示意圖，其對應(yīng)的轉(zhuǎn)移條件是:毛細(xì)管總長32cm，有效長度25cm，20mM硼砂緩沖液(pH9.0，含0.3mM CTAB)，凝膠濃度為10%，含BSA濃度為0.05mg/mL，負(fù)模式進(jìn)樣，毛細(xì)管兩端電勢差為8kV，轉(zhuǎn)移時間為120s ；圖5是凝膠濃度對蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率的影響示意圖，其對應(yīng)的轉(zhuǎn)移條件是:毛細(xì)管總長37cm，有效長度30cm，20mM磷酸鹽緩沖液(ρΗ8.0，含0.3mM CTAB),含BSA濃度為
0.5mg/mL,膠間電壓4.5V,負(fù)模式進(jìn)樣,毛細(xì)管兩端電勢差為IlkV,轉(zhuǎn)移時間為60s ；圖6是毛細(xì)管兩端轉(zhuǎn)移電壓對轉(zhuǎn)移效率的影響示意圖；其對應(yīng)的轉(zhuǎn)移條件是:毛細(xì)管總長37cm，有效長度30cm，20mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0,含0.3mM CTAB),凝膠濃度為10%，含BSA濃度為1.25mg/mL,膠間電壓4.5V，轉(zhuǎn)移時間為60s ；圖7是轉(zhuǎn)移時間對蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率的影響示意圖，其對應(yīng)的轉(zhuǎn)移條件是:毛細(xì)管總長37cm，有效長度30cm，20mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0，含0.3mM CTAB)，凝膠濃度為10%，含BSA濃度為1.25mg/mL，膠間電壓4.5V，負(fù)模式進(jìn)樣，毛細(xì)管兩端電勢差為IlkV ；圖8是緩沖液pH值對蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率的影響示意圖，其對應(yīng)的轉(zhuǎn)移條件是:毛細(xì)管總長37cm，有效長度30cm，凝膠濃度為10%，含BSA濃度為1.25mg/mL,膠間電壓4.5V，負(fù)模式進(jìn)樣，毛細(xì)管兩端電勢差為IlkV,轉(zhuǎn)移時間為60s ；圖9是緩沖液pH值對電滲流的影響示意圖，轉(zhuǎn)移條件與圖8相同；圖10是緩沖液濃度對蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率的影響示意圖，轉(zhuǎn)移條件與圖8相同；圖11是緩沖液中CTAB濃度對電滲流的影響示意圖，轉(zhuǎn)移條件與圖8相同；圖12是緩沖液中CTAB濃度對蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率的影響示意圖，，轉(zhuǎn)移條件與圖8相同；圖13是DMSO褪色對蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的影響示意圖，其中，曲線I未經(jīng)過DMSO退色，曲線2經(jīng)過DMSO退色；圖14是SDS-PAGE染色結(jié)果的照片；圖15是SDS-PAGE中BSA條帶的轉(zhuǎn)移電泳圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)地描述。本發(fā)明(I)提出三電極的轉(zhuǎn)移方法和垂直方向上電提取和電排出蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移技術(shù)；(2)轉(zhuǎn)移凝膠中蛋白質(zhì)的毛細(xì)管電泳裝置；(3)考察影響三電極轉(zhuǎn)移SDS-PAGE中蛋白質(zhì)的各種因素。本發(fā)明旨在建立凝膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的毛細(xì)管電泳裝置和方法。本發(fā)明所涉及到的凝膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移原理是:聚丙烯酰胺凝膠是由單體和交聯(lián)劑，在引發(fā)劑和增速劑的存在下聚合而形成的交叉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)在凝膠中的遷移方向由自身所帶電情況，以及電場方向決定。在SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝膠)中，蛋白質(zhì)被SDS (十二烷基硫酸鈉)包裹，帶有大量的負(fù)電荷，因此會向著正極方向遷移。當(dāng)電壓加在凝膠兩端時，如圖1 (a)中所示，蛋白質(zhì)在水平方向遷移，這是聚丙烯酰胺凝膠電泳的常規(guī)方法；當(dāng)電壓加在凝膠上下兩面時，如圖1 (b)所示，蛋白質(zhì)在垂直方向遷移，由于遷移距離很短，一般為0-1.5mm，蛋白質(zhì)在電場作用下將很快從凝膠中遷移出來，這是本發(fā)明設(shè)計(jì)方法轉(zhuǎn)移凝膠中蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)。毛細(xì)管電泳也是一種以電場為驅(qū)動力的技術(shù)手段，樣品分子根據(jù)分子量和所帶電荷的不同在毛細(xì)管中實(shí)現(xiàn)分離。毛細(xì)管電泳的遷移通道為一根小內(nèi)徑、大比表面積的中空毛細(xì)管。由于沒有凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)阻礙，因而遷移速度快。電進(jìn)樣是毛細(xì)管電泳的一種常用的進(jìn)樣方式，在外加電場下，樣品分子依靠電滲流和電泳流的作用，由進(jìn)樣端進(jìn)入到毛細(xì)管內(nèi)部。本發(fā)明利用聚丙烯酰胺凝膠電泳的樣品遷移原理，以及毛細(xì)管電泳的電進(jìn)樣原理，建立一種毛細(xì)管電轉(zhuǎn)移方式，在電場作用下凝膠中的蛋白質(zhì)被直接轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管中。轉(zhuǎn)移的實(shí)現(xiàn)主要取決于毛細(xì)管和聚丙烯酰胺凝膠的有效連接，將毛細(xì)管進(jìn)樣端橫截面內(nèi)的微小面積與聚丙烯酰胺凝膠中已分離得到的蛋白條帶近距離接觸，由凝膠表面的水溶液將二者有效的連接起來。如圖2所示，本發(fā)明一種用于在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的裝置，包括三電極電源、毛細(xì)管1、第一緩沖液槽21、第二緩沖液槽22、正電極31、負(fù)電極32和零極33，所述毛細(xì)管的柱上設(shè)有檢測器6，其中，還包括有一金屬針管4，本發(fā)明中所述三電極電源為12kv的三電極三電極電源，所述檢測器為紫外檢測器，采用哪種具體的檢測器在本發(fā)明中不受限制，只要是能夠檢測蛋白質(zhì)的檢測器均可采用。上述各部件的連接關(guān)系是:當(dāng)用于在線轉(zhuǎn)移凝膠中的蛋白質(zhì)時，如圖2中的實(shí)線部分所示，所述金屬針管4套在所述毛細(xì)管I的進(jìn)樣端上，所述毛細(xì)管I的出口端設(shè)置在第一緩沖液槽21中，并通過第一緩沖液槽21中的正電極31與三電極電源的正極相連，所述金屬針管4的上端與三電極電源零極33相連，所述毛細(xì)管I的進(jìn)樣端與凝膠的上面接觸，所述負(fù)電極32設(shè)置在所述凝膠的下面，所述負(fù)電極32與三電極電源的負(fù)極相連；當(dāng)用于在線分析凝膠中的蛋白質(zhì)時，撤出凝膠、負(fù)電極和金屬針管，將零電極和毛細(xì)管進(jìn)樣端放入第二緩沖液槽22中，如圖2中的虛線部分所示，所述毛細(xì)管的出口端通過第一緩沖液槽21中的正電極31與三電極電源的正極相連，所述毛細(xì)管的進(jìn)樣端通過第二緩沖液槽22中的零電極33與三電極電源的零極相連。利用如圖2中所示的本發(fā)明用于在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的裝置進(jìn)行在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的方法，包括以下步驟:步驟一、利用平板凝膠電泳裝置進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)處理，并將上述處理好的聚丙烯酰胺凝膠用保鮮膜包好，4°C保存；具體操作過程是:在凝膠濃度為5-17.5%的聚丙烯酰胺凝膠板材上設(shè)置15個上樣孔，每個孔中用微量移液器進(jìn)行上樣，即向上樣孔中上樣牛血清白蛋白BSAlO yL，將平板凝膠電泳裝置的上槽與電源零極相連，將平板凝膠電泳裝置的下槽與電源正極相連，然后通電,施加60V電壓，電泳45min后；施加80V電壓，電泳2h，此時牛血清白蛋白BSA中的溴酚藍(lán)指示劑沿聚丙烯酰胺凝膠板材的垂直方向遷移，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到聚丙烯酰胺凝膠板材的1/2厚度處，切斷電源，停止電泳；目前，主要可以采用三種方式進(jìn)行轉(zhuǎn)移，一是未染色進(jìn)行轉(zhuǎn)移，這樣無法確定凝膠電泳中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到什么位置；二是部分染色脫色后進(jìn)行轉(zhuǎn)移，部分染色是指凝膠板一半染色，一半不染色，部分染色脫色后進(jìn)行轉(zhuǎn)移對凝膠中蛋白質(zhì)位置的確定存在偏差；三是染色脫色后用DMSO褪色后進(jìn)行轉(zhuǎn)移，若染色脫色后未經(jīng)褪色的蛋白質(zhì)是無法轉(zhuǎn)移出來的。本發(fā)明中對凝膠板的染色步驟是:將上述已經(jīng)電泳好的聚丙烯酰胺凝膠從平板凝膠電泳裝置的玻璃板中剝離下來，放入考馬斯亮藍(lán)染色液中，染色15min ;染色完畢,傾出考馬斯亮藍(lán)染色液，加入脫色液，每隔半小時更換一次脫色液，直到聚丙烯酰胺凝膠的藍(lán)色背景完全褪去，蛋白質(zhì)的電泳條帶清晰為止；將上述處理好的聚丙烯酰胺凝膠用保鮮膜包好，4°C保存；步驟二、取一段熔融石英毛細(xì)管，對該毛細(xì)管進(jìn)行預(yù)處理后備用；具體操作過程是:將一段熔融石英毛細(xì)管裝入用于安裝固定毛細(xì)管的檢測卡盒中，對于新的毛細(xì)管，分別依次用IM NaOH溶液、去離子水、緩沖液各沖洗Ih;每日開機(jī)毛細(xì)管電泳后，依次用0.1M NaOH溶液、去離子水、緩沖液各沖洗5min，施加電壓，電泳平衡20min ;兩次進(jìn)樣之間，依次用0.1M NaOH溶液和緩沖液各沖洗毛細(xì)管5min。步驟三、聚丙烯酰胺凝膠中蛋白質(zhì)的毛細(xì)管電轉(zhuǎn)移:按照圖2的實(shí)線部分搭建轉(zhuǎn)移裝置，向經(jīng)過預(yù)處理后的毛細(xì)管中充滿PH4-9、10-50mM的運(yùn)行緩沖液，其中，包括添加濃度為0.1-1.2mM的CTAB，所述緩沖液可以是醋酸-醋酸鈉、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉、硼酸-硼砂和三羥甲基氨基甲烷(Tris) -HCl中的任何一種；從上述步驟一處理好的聚丙烯酰胺凝膠上切下需要轉(zhuǎn)移的聚丙烯酰胺凝膠，用二甲基亞砜褪色后，根據(jù)膠塊的大小用緩沖液和蒸餾水或用蒸餾水浸泡15 25min后，將膠塊放在負(fù)電極上，并排除所述負(fù)電極周圍的氣泡(盡量不留氣泡在電極周圍)；調(diào)整毛細(xì)管的位置，使得毛細(xì)管進(jìn)樣端與聚丙烯酰胺凝膠的表面有效接觸；轉(zhuǎn)移時，毛細(xì)管的出口端位于第一緩沖液槽中，對于毛細(xì)管出口端的正電極、凝膠上端的零極及凝膠下端的負(fù)電極同時施加電壓，給予凝膠上下兩端的零極和負(fù)電極3.0-6.0V的電壓，在毛細(xì)管的兩端施加I 12kV的高電壓，并根據(jù)轉(zhuǎn)移目的和凝膠中蛋白質(zhì)含量的不同確定轉(zhuǎn)移時間的長短，記錄轉(zhuǎn)移時間和電流變化；本發(fā)明凝膠中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移過程是，在毛細(xì)管和凝膠的交界面處，通過毛細(xì)管外面套著的金屬針管連接零極，以及在接通三電極的三電極電源后，產(chǎn)生一個貫穿凝膠和毛細(xì)管的高強(qiáng)度電場，該電場作用協(xié)同電滲流的拉動作用，迫使聚丙烯酰胺凝膠中蛋白質(zhì)由凝膠內(nèi)部遷移到毛細(xì)管柱內(nèi)，完成凝膠中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移。步驟四、檢測被轉(zhuǎn)移出來的蛋白質(zhì):轉(zhuǎn)移后，將聚丙烯酰胺凝膠、負(fù)電極和金屬針管撤下，然后將零電極放入到第二緩沖液槽中，將毛細(xì)管的進(jìn)樣端從金屬針管中拿出后插入第二緩沖液槽中，零電極與三電極電源的零極相連，進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，從而在最佳波長下，由毛細(xì)管柱上的檢測器檢測被轉(zhuǎn)移出來的蛋白質(zhì)，并完成定性和定量分析。本發(fā)明在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的所有步驟均在室溫下進(jìn)行。實(shí)施例1:對三電極毛細(xì)管電泳法轉(zhuǎn)移凝膠中蛋白質(zhì)的可行性驗(yàn)證采用本發(fā)明的在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的方法從含有0.5mg/mL BSA的樣品模擬膠和相應(yīng)的空白模擬膠中進(jìn)行轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。其中，空白模擬膠的作用是與樣品模擬膠作對照，通過比較二者的轉(zhuǎn)移電泳圖譜，排除樣品模擬膠轉(zhuǎn)移圖譜中的背景干擾，確定蛋白質(zhì)的峰位，結(jié)果見圖3。從圖3中可以明顯看出，出峰時間小于5min的峰來自于凝膠本身的干擾，確認(rèn)9min處的峰為BSA峰。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了三電極毛細(xì)管電泳轉(zhuǎn)移凝膠中蛋白質(zhì)的方法是可行性的。
蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移過程中，發(fā)現(xiàn)電流值是連續(xù)下降的。這由兩方面原因造成:一是轉(zhuǎn)移過程中施加高電壓，毛細(xì)管進(jìn)樣端附近有限的電解質(zhì)溶液遭受損耗；二是凝膠經(jīng)蒸餾水浸泡后，表面存在的水在電滲流作用下不斷進(jìn)入毛細(xì)管中，造成電滲流減小。當(dāng)轉(zhuǎn)移完畢開始電泳分離時，電流值會緩慢回升到初始值。實(shí)施例2:兩電極轉(zhuǎn)移法和三電極轉(zhuǎn)移法自凝膠中轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)的效果對比Lee于2002年提出了毛細(xì)管兩電極轉(zhuǎn)移凝膠中蛋白質(zhì)方法，即在毛細(xì)管的出口端連接正極，在凝膠的下端連接負(fù)極。為了驗(yàn)證本發(fā)明提出的三電極轉(zhuǎn)移法的優(yōu)勢，對二者進(jìn)行了對比研究，采用相同的模型樣品PAGE膠、轉(zhuǎn)移電壓、轉(zhuǎn)移時間以及毛細(xì)管和緩沖液條件，對比了這兩種方法的轉(zhuǎn)移結(jié)果，三電極轉(zhuǎn)移時凝膠兩端的電壓為4.5V。由于重現(xiàn)性問題，對峰面積進(jìn)行時間校正，用峰面積和出峰時間的比值作為判斷蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移量的依據(jù)。四次平行實(shí)驗(yàn)所得平均峰面積/出峰時間結(jié)果為(I)兩電極法:21288.2；(2)三電極法:412737.0，這一結(jié)果表明三電極法的轉(zhuǎn)移效率遠(yuǎn)高于兩電極法，相同條件下轉(zhuǎn)移出來的BSA量是兩電極法的近20倍。這是因?yàn)槿姌O法轉(zhuǎn)移時，在毛細(xì)管和樣品凝膠交界面處提供了一個穿過樣品凝膠的強(qiáng)電場，有助于凝膠中包埋的蛋白質(zhì)大分子克服其所受到的物理障礙獲得自由。而兩電極法轉(zhuǎn)移時，這個電場受到毛細(xì)管和凝膠空間距離的影響，電場強(qiáng)度較弱且不穩(wěn)定，因此轉(zhuǎn)移效率較低。通過對比得出結(jié)論:本發(fā)明研發(fā)的毛細(xì)管電泳三電極轉(zhuǎn)移法是一種更有效的轉(zhuǎn)移凝膠中蛋白質(zhì)的方法。實(shí)施例3:凝膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移條件的優(yōu)化蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管中包括兩個過程，一個是蛋白質(zhì)從凝膠內(nèi)部遷移到凝膠表面，一個是蛋白質(zhì)從凝膠表面進(jìn)入到毛細(xì)管中。在第一個過程中，影響蛋白質(zhì)遷移快慢的因素有在凝膠上下所加電壓的大小和凝膠孔徑的大小。一個提供蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的動力，一個決定了蛋白質(zhì)穿過凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)時的阻力大小。第二個過程實(shí)際是一個借助外加電場的電動進(jìn)樣過程。樣品分子在EOF和電泳的共同作用下進(jìn)入毛細(xì)管。由電動進(jìn)樣方法中的 進(jìn)樣量計(jì)算公式
權(quán)利要求
1.一種用于在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的裝置，包括三電極電源、毛細(xì)管(I)、第一緩沖液槽(21)、第二緩沖液槽(22 )、正電極(31)、負(fù)電極(32 )和零極(33 )，所述毛細(xì)管的柱上設(shè)有檢測器(6);其特征在于，還包括有一金屬針管(4);當(dāng)用于在線轉(zhuǎn)移凝膠中的蛋白質(zhì)時，所述金屬針管(4)套在所述毛細(xì)管(I)的進(jìn)樣端上，所述毛細(xì)管(I)的出口端設(shè)置在第一緩沖液槽(21)中，并通過第一緩沖液槽(21)中的正電極(31)與三電極電源的正極相連，所述金屬針管(4)的上端與零極(33)相連，所述毛細(xì)管(I)的進(jìn)樣端與凝膠的上面接觸，所述負(fù)電極(32)設(shè)置在所述凝膠的下面，所述負(fù)電極(32)與三電極電源的負(fù)極相連； 當(dāng)用于在線分析凝膠中的蛋白質(zhì)時，將零極(33)放入第二緩沖液槽(22)中，同時將所述毛細(xì)管(I)的進(jìn)樣端從金屬針管內(nèi)拿出后放入第二緩沖液槽(22)中，所述毛細(xì)管的出口端通過第一緩沖液槽(21)中的正電極(31)與三電極電源的正極相連，所述毛細(xì)管的進(jìn)樣端通過第二緩沖液槽(22)中的零電極(33)與零極相連。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的裝置，其特征在于，所述檢測器為紫外檢測器，但是采用哪種具體的檢測器在本發(fā)明中不受限制，只要是能夠檢測蛋白質(zhì)的檢測器均可采用。
3.—種在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，采用如權(quán)利要求1或2所述用于在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的裝置，并包括以下步驟: 步驟一、利用平板凝膠電泳裝置進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)處理，并將上述處理好的聚丙烯酰胺凝膠用保鮮膜包好，4°C保存； 步驟二、取一段熔融石英毛細(xì)管，對該毛細(xì)管進(jìn)行預(yù)處理后備用； 步驟三、聚丙烯酰胺凝膠中蛋白質(zhì)的毛細(xì)管電轉(zhuǎn)移: 向經(jīng)過預(yù)處理后的毛細(xì)管中充滿pH4-9、10-50mM的運(yùn)行緩沖液，其中，包括添加濃度為0.1到1.2mM的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB);從上述步驟一處理好的聚丙烯酰胺凝膠上切下需要轉(zhuǎn)移的聚丙烯酰胺凝膠，用二甲基亞砜褪色后，根據(jù)膠塊的大小用緩沖液和蒸餾水或用蒸餾水浸泡15 25min后，放在負(fù)電極上，并排除所述負(fù)電極周圍的氣泡；調(diào)整毛細(xì)管的位置，使得毛細(xì)管進(jìn)樣端與聚丙烯酰胺凝膠的表面接觸；轉(zhuǎn)移時，毛細(xì)管的出口端位于第一緩沖液槽中，對所述正電極、零極及負(fù)電極同時施加電壓，并使零極和負(fù)電極之間的電壓為-3.0 -6.0V，毛細(xì)管的兩端施加I 12kV高電壓，并根據(jù)轉(zhuǎn)移目的和凝膠中蛋白質(zhì)含量的不同確定轉(zhuǎn)移時間的長短，記錄轉(zhuǎn)移時間和電流變化； 步驟四、檢測被轉(zhuǎn)移出來的蛋白質(zhì): 轉(zhuǎn)移后，將聚丙烯酰胺凝膠和負(fù)電極、金屬針管撤下，然后將零電極放入到第二緩沖液槽中，將毛細(xì)管的進(jìn)樣端從金屬針管中拿出后插入第二緩沖液槽中，零電極與三電極電源的零極相連，進(jìn)行毛細(xì)管電泳，紫外在線檢測被轉(zhuǎn)移出來的蛋白質(zhì)； 上述步驟一至步驟四均在室溫下進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述緩沖液種類包括醋酸-醋酸鈉、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉、硼酸-硼砂、三羥甲基氨基甲烷(Tris) -HCl。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于在線轉(zhuǎn)移和分析凝膠中蛋白質(zhì)的裝置，包括三電極三電極電源、毛細(xì)管、第一緩沖液槽、第二緩沖液槽、檢測器、金屬針管；轉(zhuǎn)移時，金屬針管與零極相連套在毛細(xì)管的進(jìn)樣端上，放在凝膠上表面，毛細(xì)管的出口端、三電極電源正電極放在第一緩沖液槽中，三電極電源負(fù)電極連在所述凝膠的下面；分析時，將三電極電源零電極與毛細(xì)管進(jìn)樣端放入第二緩沖液槽中，毛細(xì)管的出口端與三電極電源正電極仍放在第一緩沖液槽中。本發(fā)明與其他蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移方法相比，簡單、快速、高效、可在線轉(zhuǎn)移檢測，染色與否并不影響SDS-PAGE中蛋白質(zhì)條帶的轉(zhuǎn)移，在凝膠蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移中具有重要的理論和實(shí)際價(jià)值，具有很廣泛的實(shí)際應(yīng)用前景。
文檔編號G01N27/26GK103163194SQ20131009497
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月22日
發(fā)明者包建民, 李優(yōu)鑫, 張勃, 高赫男 申請人:天津大學(xué)