專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種致病菌的快速檢測(cè)方，尤其涉及一種基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
基本原理:單克隆抗體或抗原分子與酶分子通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合，這種結(jié)合不會(huì)改變單克隆抗體、抗原和酶的免疫學(xué)特性及生物活性，特異性的單克隆抗體只會(huì)與特異性的抗原結(jié)合。Fe-Ni合金材料具有鐵磁性，當(dāng)粒子直徑小到一定程度會(huì)出現(xiàn)順磁特性。即沒(méi)有外加磁場(chǎng)時(shí)沒(méi)有磁性，而在有外加磁場(chǎng)時(shí)表現(xiàn)出一定的磁性，可以用于磁分離。同時(shí)，順磁性物質(zhì)對(duì)核磁共振信號(hào)的影響十分顯著，微量的順磁性物質(zhì)就會(huì)使核磁共振信號(hào)表現(xiàn)出變化。因此可以構(gòu)建順磁性的特異性Fe-Ni合金納米探針生物傳感器，從磁共振的角度來(lái)做檢測(cè)。其主要的原理步驟:1.在樣品中加入檢測(cè)目標(biāo)菌的第I抗體，若樣品中存在目標(biāo)菌，則通過(guò)抗體抗原的結(jié)合形成I抗復(fù)合物，此時(shí)I抗起信號(hào)放大作用。2.從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)順磁納米Fe-Ni合金材料,也可以通過(guò)其他方法制備納米級(jí)的Fe-Ni合金。使用娃燒偶聯(lián)齊U，其通式為:Y(CH2)nSiX3。此處，η為0-3 ;X為可水解的基團(tuán)；￥為有機(jī)官能團(tuán)。X通常是氯基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基等，這些基團(tuán)水解時(shí)即生成硅醇(Si (OH) 3)，而與無(wú)機(jī)物質(zhì)結(jié)合，形成娃氧燒。Y是乙稀基、氣基、環(huán)氧基、甲基丙稀酸氧基、疏基。這些反應(yīng)基團(tuán)可與有機(jī)物質(zhì)反應(yīng)而結(jié)合。因此，通過(guò)使用硅烷偶聯(lián)劑，可在無(wú)機(jī)物質(zhì)和有機(jī)物質(zhì)的界面之間架起“分子橋”，把兩種性質(zhì)懸殊的材料連接在一起提高復(fù)合材料的性能和增加粘接強(qiáng)度的作用。通過(guò)修飾抗體可實(shí)現(xiàn)表面功能化，形成特異性免疫探針，再封閉多余的活性位點(diǎn)。由于納米Fe-Ni合金探針具有順磁特性，因此，可以通過(guò)外加磁場(chǎng)分離沒(méi)有聯(lián)上的抗體。納米Fe-Ni合金材料修飾的 是第I抗體的抗體，即2抗。3.將目標(biāo)菌特異性第I抗體采用一定的方法固定在固相載體表面，并將多余活性位點(diǎn)封閉備用。4.在第I步處理過(guò)的樣品，力口入第2步制得的順磁納米Fe-Ni合金探針，充分混合震蕩反應(yīng)一段時(shí)間，抓取目標(biāo)菌后施加外加磁場(chǎng)，由于納米Fe-Ni合金具有順磁特性，F(xiàn)e-Ni合金探針會(huì)聚集到磁場(chǎng)一邊，吸走上清液則可以分離出探針。若待檢樣本中有目標(biāo)菌，則首先會(huì)在第I步時(shí)與I抗形成I抗復(fù)合物，I抗復(fù)合物會(huì)再與探針表面的2抗復(fù)合，通過(guò)外加磁場(chǎng)而被富集、分離。洗滌、磁分離后加少量無(wú)菌的去離子水則形成目標(biāo)菌的順磁納米Fe-Ni合金探針懸濁液。此時(shí)，抓到目標(biāo)菌和未抓到目標(biāo)菌的過(guò)量探針還是混在一起。5.將上述混在一起的探針,加到第3步的固相載體表面，則抓取了目標(biāo)菌的探針將與固相載體表面單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成雙抗夾心，用無(wú)菌的去離子水清洗可以將未發(fā)生結(jié)合的探針洗脫。6.再采用洗脫劑將固定載體上的結(jié)合的特異性納米免疫探針洗下來(lái)，用磁分離的方法清洗掉離子、溶劑。此部分探針如果存在，就是抓取了目標(biāo)菌的探針。由于Fe-Ni合金具有順磁特性，對(duì)于共振儀器非常敏感，相對(duì)于其他分子而言，微量的Fe-Ni合金能夠大幅降低無(wú)菌的去離子水的自旋-晶格馳豫參數(shù)Tl和自旋-自旋弛豫時(shí)間T2，而無(wú)菌的去離子水在一定的均勻場(chǎng)強(qiáng)下，T1/T2是固定的。將洗脫液置于核磁共振儀中，與無(wú)菌的去離子水對(duì)照組進(jìn)行對(duì)照。顯著發(fā)生Tl/T2值降低的說(shuō)明有探針存在，從而間接說(shuō)明食品樣品中有致病菌檢出。探針含量與T1/T2值降低呈正比。通過(guò)加標(biāo)，可以定量檢測(cè)目標(biāo)菌。該方法中Fe-Ni合金探針既是分離富集的手段，同時(shí)Fe-Ni合金具有的順磁特性，又可作為定量檢測(cè)的探針。該方法的主要優(yōu)點(diǎn)就是快速、靈敏度高。相對(duì)于致病菌的微生物培養(yǎng)2-3天甚至幾天的時(shí)間。此方法主要取決于樣品的預(yù)處理時(shí)間，核磁共振檢測(cè)只需幾分鐘。所有的食品標(biāo)準(zhǔn)，致病菌都不得檢出。因此，用該方法可做大規(guī)模待檢樣本的陽(yáng)性篩選，一定程度上可以定量檢測(cè)。目前，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道這種方法。

發(fā)明內(nèi)容
一種基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測(cè)方法，用于對(duì)各種不同的食品樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。該方法是一種客觀有效的檢出食品中有害致病菌的方法，從而在某種程度上大大縮減了食品樣品有害致病菌的篩選時(shí)間。一種基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測(cè)方法，利用核磁共振儀對(duì)順磁物質(zhì)的響應(yīng)敏感性，提出核磁共振弛豫參數(shù)變化與Fe-Ni合金納米粒子順磁免疫探針含量的相關(guān)性指標(biāo)。不同的致病菌檢出下限不同。該方法依賴(lài)于建立的可用于食品樣品中有害致病菌特異性順磁納米Fe-Ni合金探針富集、分離，從核磁共振弛豫信號(hào)參數(shù)變化的角度，檢測(cè)出樣品中的有害致病菌。采用偶聯(lián)了特異性單克隆抗體的順磁納米Fe-Ni合金探針，可以將樣品中的特異性致病菌進(jìn)行富集。由于核磁共振儀自旋-晶格弛豫效率和自旋-自旋弛豫效率對(duì)Fe-Ni合金納米粒子非常敏感，即在去離子水中，存在微量的順磁Fe-Ni合金納米粒子，則水的自旋-晶格弛豫時(shí)間(Tl)和/自旋-自旋弛豫(T2)就會(huì)顯著下降。在一定條件下，順磁免疫探針的順磁特性使核磁共振的弛豫衰減信號(hào)T2/T1產(chǎn)生線性減小。通過(guò)定量檢測(cè)出樣品中的免疫探針含量，從而可以間接定量出食品樣品中的有害致病菌含量。檢測(cè)出的致病菌含量與探針含量線性相關(guān)，擬合度較好。最終以順磁免疫探針與致病菌間的對(duì)應(yīng)關(guān)系為紐帶，確定食品樣本中的致病菌菌落數(shù)。而所有的食品標(biāo)準(zhǔn)，致病菌均不得檢出。因此，該方法可做大規(guī)模待檢樣本的陽(yáng)性篩選，一定程度上可以定量檢測(cè)。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，步驟如下:
I)在樣品中加入檢測(cè)目標(biāo)菌的第I抗體，若樣品中存在目標(biāo)菌，則通過(guò)抗體抗原的結(jié)合形成I抗復(fù)合物。2)檢測(cè)目標(biāo)菌的第I抗體的抗體，即2抗包被順磁納米Fe-Ni合金探針的制備；。3)將目標(biāo)菌特異性第I抗體在固相載體上的固定備用。4)富集目標(biāo)菌株，并分離:在第I步處理過(guò)的樣品，加入第2步制得的順磁納米Fe-Ni合金探針，充分混合震蕩反應(yīng)一段時(shí)間，抓取目標(biāo)菌后施加外加磁場(chǎng)，由于納米Fe-Ni合金的順磁特性，則Fe-Ni合金探針就匯集到磁場(chǎng)一邊，吸走上清液則可以分離出探針。若待檢樣本中有目標(biāo)菌，則首先會(huì)在第I步時(shí)與I抗形成I抗復(fù)合物，I抗復(fù)合物會(huì)再與探針表面的2抗復(fù)合，通過(guò)外加磁場(chǎng)而被富集、分離。洗滌、磁分離后加少量無(wú)菌的去離子水則形成目標(biāo)菌的順磁納米Fe-Ni合金探針懸濁液。此時(shí)，抓到目標(biāo)菌和未抓到目標(biāo)菌的過(guò)量探針還是混在一起。5)將富集的探針懸濁液加到第3步制作的固定了單克隆抗體的固相載體上，若存在目標(biāo)菌則形成雙抗夾心；用無(wú)菌的去離子水清洗，則沒(méi)有抓取到目標(biāo)菌的探針就被洗掉，若不存在目標(biāo)菌，則所有探針都被洗掉。6)之后，用洗脫劑將固定板上的雙抗夾心的探針洗下來(lái)，用外加磁場(chǎng)分離探針的方法用無(wú)菌的去離子水清洗掉離子和溶劑，如果還存在探針就是抓到目標(biāo)菌的探針。這部分探針，加入無(wú)菌的去離子水形成探針的懸濁液，進(jìn)行核磁共振的弛豫時(shí)間測(cè)定，以無(wú)菌的去離子水為空白，測(cè)得的懸濁液的弛豫時(shí)間T1/T2相比無(wú)菌的去離子水有顯著降低，則說(shuō)明含有探針，從而間接證明樣本中有目標(biāo)致病菌，探針的量與T1/T2的下降呈正比，可以通過(guò)定量探針在一定程度上間接定量出目標(biāo)菌的量。所述NMR探針為具有順磁特性的納米級(jí)Fe-Ni合金材料，納米粒徑小于1000納米。所述的目標(biāo)菌的最終檢出評(píng)價(jià)方法基于核磁共振技術(shù)的弛豫時(shí)間特性參數(shù)的變化。所述弛豫時(shí)間特性，是指自旋-晶格弛豫時(shí)間(Tl)和自旋-自旋弛豫時(shí)間(T2)。所述弛豫時(shí)間特性，Tl采用180° -τ-90°脈沖方法測(cè)定，Τ2采用CPMG序列方法測(cè)定。所述的I抗為檢測(cè)目標(biāo)菌的特異性抗體，最好是單抗。2抗為第I抗體的抗體。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供一種客觀的快速檢測(cè)出食品中的有害致病菌的方法，其特征是依賴(lài)于建立的可用于檢測(cè)順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的核磁共振檢測(cè)方法。該方法可以客觀有效地對(duì)食品中有害致病菌進(jìn)行檢測(cè)，相比于致病菌的生物培養(yǎng)確認(rèn)，該方法具有快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，可以用于大規(guī)模樣本的快速篩選。
具體實(shí)施例方式實(shí)例I
檢驗(yàn)食品樣本中測(cè)定其是否含有有害致病菌——單增李斯特菌。1.納米Fe-Ni合金免疫探針制備:第I抗體采用單增李斯特菌的兔抗IgG單克隆抗體，2抗為單增李斯特菌的羊抗兔IgG。Fe-Ni合金納米粒子可以從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)。比如北京德科島金科技股份有限公司或上海超威納米材料公司，20nm,比例1:1，各自純度99.5%。二氧化硅包被納米Fe-Ni合金:取47.5g硅酸鈉，用去離子水溶解于燒杯中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為12-13。取5.0g納米Fe-Ni合金加入到此燒杯中，機(jī)械攪拌(用玻璃棒)5min。將混合液超聲30min，適時(shí)攪拌。升溫到85°C，逐滴加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值6_7，生成沉淀。邊磁分離邊用去離子水洗滌沉淀，洗滌3-4次。然后，將沉淀分散于250mL甲醇中。以上過(guò)程重復(fù)三次，保證硅依附在Fe-Ni合金上。胺基硅烷化Fe-Ni合金納米材料:將制得的二氧化硅包被的納米Fe-Ni合金加入到25mL甲醇中，用ImLH2O和甲醇稀釋到150mL。然后加入150mL甘油混合。超聲30min，轉(zhuǎn)移到有攪拌裝置的500mL三口燒瓶中。加入IOmL氨基硅烷偶聯(lián)劑(AEAPS)，在80-90 V下快速攪拌3h后，轉(zhuǎn)移出產(chǎn)物。產(chǎn)物用去離子水洗滌3次，甲醇洗滌2次(用布氏漏斗抽濾)。真空干燥。需要注意的是，抽濾由于有甘油，所以比較慢，抽一段時(shí)間后可適時(shí)用吸管吸去上層液體，抽濾過(guò)程約需6-8h。最后將得到的胺基硅烷化Fe-Ni合金納米材料真空干燥 12h?？贵w修飾:取一定量氨基化Fe-Ni合金納米粒子,加入過(guò)量的單增李斯特菌的羊抗兔IgG抗體，26 °C孵育、洗滌后，加過(guò)量1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，封閉表面活性空位，洗漆、重懸浮。因納米Fe-Ni合金具有順磁特性,外加磁場(chǎng)分離,納米Fe-Ni合金就會(huì)匯集到磁場(chǎng)一邊，吸走上清液，洗滌，則將多余的抗體、BSA洗去。制備的順磁納米免疫探針保存在4 C待用。2.單克隆抗體固定:可以采用常規(guī)的酶標(biāo)板固定方法，也可以采用以下方法。用干凈的蓋玻片5X5mm2正方形,鍍膜機(jī)先噴一層Cr (2 - 4 nm)用以幫助固定金。再用在表面濺射噴上一層納米金，再采用200微升2 mmol 二硫基-琥珀酰亞胺-丙酸酯(DSP)對(duì)納米金進(jìn)行修飾(DMS0, 二甲基亞砜稀釋DSP)。加入單增李斯特菌第一抗體，兔抗IgG單克隆抗體，即將100μ L100 μ g/mL單克隆抗體通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)法固定在玻璃板上并37 °C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，I小時(shí)，將板上剩余的活性位點(diǎn)進(jìn)行封閉并干燥。3.將食品樣本進(jìn)行預(yù)處理，必要時(shí)采用FDA增菌法，對(duì)樣品進(jìn)行過(guò)濾、增菌活化等預(yù)處理，得到待檢樣本。將待檢樣本中加入第I抗體，單增李斯特菌的兔抗IgG。若待檢樣本中存在單增李斯特菌，將與I抗形成I抗復(fù)合物。將第I步制得的第2抗體單增李斯特菌的羊抗兔IgG探針加入后進(jìn)行充分震蕩。上磁力架分離探針，加少量無(wú)菌的去離子水得到探針的懸濁液。此時(shí)，如果待檢樣本中有目標(biāo)單增李斯特菌，則通過(guò)第2抗體與第I抗體的相互作用，從而捕獲該 復(fù)合物，達(dá)到了目標(biāo)菌富集的目的。此時(shí)，結(jié)合了目標(biāo)菌的I抗復(fù)合物和沒(méi)有結(jié)合目標(biāo)菌的過(guò)量I抗都會(huì)與探針表面的2抗結(jié)合，還是混在一起。將此富集的探針懸濁液加到第2步所制備的I抗固定板上，則探針懸濁液中結(jié)合了單增李斯特菌的探針會(huì)進(jìn)一步與固定板上的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成雙抗夾心結(jié)構(gòu)。此時(shí)用無(wú)菌的去離子水清洗，就可以將沒(méi)有結(jié)合單增李斯特菌的探針洗去。在固定板上剩下的就只有結(jié)合了單增李斯特菌的探針。
4.用洗脫液(甲醇等)將固定板上的結(jié)合了單增李斯特菌的探針洗脫下來(lái)。上磁力架，分離探針并清洗1-2次，將離子洗去。得到的溶液，用核磁共振儀(NMR20，紐邁公司)測(cè)定溶液的Tl和T2。以無(wú)菌的去離子水為空白，溶液測(cè)得的T1/T2與空白相比較，有顯著差異，說(shuō)明溶液中有探針存在，從而說(shuō)明樣本中有單增李斯特菌。探針的量與T1/T2的下降值呈正比。下降的越多說(shuō)明探針越多，從而間接說(shuō)明單增李斯特菌越多，通過(guò)加標(biāo)驗(yàn)證可以定量檢測(cè)樣本中目標(biāo)菌的數(shù)目。所有食品標(biāo)準(zhǔn)均不得檢出單增李斯特菌，此方法可以快速檢測(cè)出樣品中是否含有單增李斯特菌。
具體實(shí)施例方式實(shí)例2測(cè)定食品樣品是否含有有害致病菌——大腸桿菌0157:H7。1.納米Fe-Ni合金免疫探針制備:I抗采用0157:H7的兔抗IgG單克隆抗體，2抗為0157:H7的羊抗兔IgG，可以是單抗也可以是多抗。Fe-Ni合金納米粒子可以從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)。比如北京德科島金科技股份有限公司或上海超威納米材料公司，20nm，比例1: 1，各自純度 99.5%。二氧化硅包被納米Fe-Ni合金:取47.5g硅酸鈉，用去離子水溶解于燒杯中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為12-13。取5.0g納米Fe-Ni合金加入到此燒杯中，機(jī)械攪拌(用玻璃棒)5min。將混合液超聲30min，適時(shí)攪拌。升溫到85°C，逐滴加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值6_7，生成沉淀。邊磁分離邊用去離子水洗滌沉淀，洗滌3-4次。然后，將沉淀分散于250mL甲醇中。以上過(guò)程重復(fù)三次，保證硅依附在Fe-Ni合金上。胺基硅烷化Fe-Ni合金納米材料:將制得的二氧化硅包被的納米Fe-Ni合金加入到25mL甲醇中，用ImLH2O和甲醇稀釋至IJ 150mL。然后加入150mL甘油混合。超聲30min,轉(zhuǎn)移到有攪拌裝置的500mL三口燒瓶中。加入IOmL氨基硅烷偶聯(lián)劑(AEAPS)，在80-90 V下快速攪拌3h后，轉(zhuǎn)移出產(chǎn)物。產(chǎn)物用去離子水洗滌3次，甲醇洗滌2次(用布氏漏斗抽濾)。真空干燥。需要注意的是，抽濾由于有甘油，所以比較慢，抽一段時(shí)間后可適時(shí)用吸管吸去上層液體，抽濾過(guò)程約需6-8h。最后將得到的胺基硅烷化Fe-Ni合金納米材料真空干燥 12h。抗體修飾:取一定量氨基化Fe-Ni合金納米粒子，加入過(guò)量的2抗，即大腸桿菌0157:H7的羊抗兔IgG抗體，26 °C孵育、洗滌后，加過(guò)量1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，封閉表面活性空位，洗滌、重懸浮。因納米Fe-Ni合金具有順磁特性，外加磁場(chǎng)分離，納米Fe-Ni合金就會(huì)匯集到磁場(chǎng)一邊，吸走上清液，洗滌，則將多余的抗體、BSA洗去。制備的順磁納米免疫探針保存在4 C待用。

2.單克隆抗體固定:可以采用常規(guī)的酶標(biāo)板固定方法，也可以采用以下方法。用干凈的蓋玻片5X5mm2正方形,鍍膜機(jī)先噴一層Cr (2 - 4 nm)用以幫助固定金。再用在表面濺射噴上一層納米金，再采用200微升2 mmol 二硫基-琥珀酰亞胺-丙酸酯(DSP)對(duì)納米金進(jìn)行修飾(DMS0，二甲基亞砜稀釋DSP)。加入第I抗體，即兔抗IgG單克隆抗體，即將100 μ LlOO μ g/mL單克隆抗體通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)法固定在玻璃板上并37 °C孵育45 min。加入牛血清蛋白將板上剩余的活性位點(diǎn)進(jìn)行封閉并干燥。3.將食品樣本進(jìn)行預(yù)處理，必要時(shí)采用FDA增菌法，對(duì)樣品進(jìn)行過(guò)濾、增菌活化等預(yù)處理,得到待檢樣本。將待檢樣本中加入第I抗體，0157:H7的兔抗IgG。若待檢樣本中存在0157:H7，將與I抗形成I抗復(fù)合物。將第I步制得的第2抗體，0157:H7的羊抗兔IgG探針加入后進(jìn)行充分震蕩。上磁力架分離探針，加少量無(wú)菌的去離子水得到探針的懸濁液。此時(shí)，如果待檢樣本中有目標(biāo)單增李斯特菌，則通過(guò)第2抗體與第I抗體的相互作用，從而捕獲該復(fù)合物，達(dá)到了目標(biāo)菌富集的目的。此時(shí)，結(jié)合了目標(biāo)菌的I抗復(fù)合物和沒(méi)有結(jié)合目標(biāo)菌的過(guò)量I抗都會(huì)與探針表面的2抗結(jié)合,還是混在一起。將此富集的探針懸池液加到第2步所制備的I抗固定板上，則探針懸濁液中結(jié)合了 0157:H7的探針會(huì)進(jìn)一步與固定板上的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成雙抗夾心結(jié)構(gòu)。此時(shí)用無(wú)菌的去離子水清洗，就可以將沒(méi)有結(jié)合0157:H7的探針洗去。在固定板上剩下的就只有結(jié)合了 0157:H7的探針。用洗脫液(甲醇等)將固定板上的結(jié)合了大腸桿菌0157:H7的探針洗脫下來(lái)。上磁力架，分離探針并用無(wú)菌的去離子水清洗1-2次，將離子、溶劑洗去。得到的溶液，用核磁共振儀(NMR20，紐邁公司或miFe-Ni合金NMR華東師范大學(xué))測(cè)定溶液的Tl和T2，以去離子水為空白，溶液測(cè)得的T1/T2與空白比較，有顯著差異，說(shuō)明溶液中有探針存在，從而說(shuō)明樣本中有大腸桿菌0157:H7，探針的量與T1/T2的下降值呈正比。下降的越多說(shuō)明探針越多，從而間接說(shuō)明大腸桿菌0157:H7越多，通過(guò)加標(biāo)驗(yàn)證可以定量檢測(cè)樣本中目標(biāo)菌的數(shù)目。
權(quán)利要求
1.一種基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測(cè)方法，其特征步驟如下: 1)在樣品中加入檢測(cè)目標(biāo)菌的特異性第I抗體，若樣品中存在目標(biāo)菌，則通過(guò)抗體抗原的結(jié)合形成I抗復(fù)合物； 2)檢測(cè)目標(biāo)菌的第I抗體的抗體，即2抗包被順磁納米Fe-Ni合金探針的制備； 3)將目標(biāo)菌特異性第I抗體在固相載體上的固定備用； 4)富集目標(biāo)菌株，并分離:在第I步處理過(guò)的樣品，加入第2步制得的順磁納米Fe-Ni合金探針，充分混合震蕩反應(yīng)一段時(shí)間，抓取目標(biāo)菌后施加外加磁場(chǎng)，由于納米Fe-Ni合金具有順磁特性，F(xiàn)e-Ni合金探針會(huì)聚集到磁場(chǎng)一邊，吸走上清液則可以分離出探針，若待檢樣本中有目標(biāo)菌，則首先會(huì)在第I步時(shí)與I抗形成I抗復(fù)合物，I抗復(fù)合物會(huì)再與探針表面的2抗復(fù)合，通過(guò)外加磁場(chǎng)而被富集、分離、洗滌、磁分離后加少量無(wú)菌的去離子水則形成目標(biāo)菌的順磁納米Fe-Ni合金探針懸池液,此時(shí),捕到和未捕到I抗復(fù)合物的Fe-Ni合金探針還是混在一起； 5)將富集的Fe-Ni合金探針懸濁液加到第2步固定了單克隆抗體的固相載體上，若存在目標(biāo)菌則形成雙抗夾心，用無(wú)菌的去離子水清洗，則沒(méi)有抓取到目標(biāo)菌的探針就被洗掉，若不存在目標(biāo)菌，則所有探針都被洗掉； 6)之后，用洗脫劑將固定板上的雙抗夾心的探針洗下來(lái)，用外加磁場(chǎng)分離探針的方法用無(wú)菌的去離子水清洗掉離子和溶劑，如果還存在探針就是抓到目標(biāo)菌的探針； 7)這部分探針，加入無(wú)菌的去離子水形成探針的懸濁液，進(jìn)行核磁共振的弛豫時(shí)間測(cè)定，在固定場(chǎng)強(qiáng)下，無(wú)菌的去離子水的T1/T2是一個(gè)恒定值，以無(wú)菌的去離子水為空白，測(cè)得的懸濁液的弛豫時(shí)間T1/T 2相比無(wú)菌的去離子水有顯著降低，則說(shuō)明含有探針，從而間接證明樣本中有目標(biāo)致病菌，探針的量與T1/T2的下降呈正比，可以通過(guò)加標(biāo)定量探針而間接定量出目標(biāo)菌的量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測(cè)方法，其特征是所述NMR納米探針為具有順磁特性的納米Fe-Ni合金材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測(cè)方法，其特征是所述的目標(biāo)菌的最終檢出評(píng)價(jià)方法基于核磁共振技術(shù)的弛豫時(shí)間特性參數(shù)的變化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測(cè)方法，其特征是所述NMR弛豫時(shí)間特性，是指自旋-晶格弛豫時(shí)間(Tl)和自旋-自旋弛豫時(shí)間(T2)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測(cè)方法，其特征是所述弛豫時(shí)間特性，Tl采用180° - τ -90°脈沖方法測(cè)定，Τ2采用CPMG序列方法測(cè)定。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測(cè)方法，其特征是所述的I抗為檢測(cè)目標(biāo)菌的特異性抗體，最好是單抗，2抗為第I抗體的抗體。
全文摘要
一種基于順磁納米Fe-Ni合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測(cè)方法，屬于食品安全致病菌快速檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明依賴(lài)于建立的可以用于食品液體樣本中致病菌的核磁共振檢測(cè)方法，利用第1抗體捕獲目標(biāo)菌，利用第1抗體的抗體即2抗包被制備的順磁納米Fe-Ni合金探針對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行富集、分離，利用納米Fe-Ni合金的順磁特性對(duì)核磁共振衰減信號(hào)的弛豫時(shí)間的影響，檢測(cè)出樣本中是否含有目標(biāo)致病菌。不同的具體的對(duì)應(yīng)關(guān)系為順磁納米Fe-Ni合金探針，在一定條件下顯示出線性關(guān)系，即納米Fe-Ni合金含量大，樣品的T2/T1值越小，在一定范圍能夠定量檢測(cè)目標(biāo)菌。該方法可以用于食品樣本中有害致病菌的快速檢測(cè)，從而可以作為大批待檢樣品的快速篩選。
文檔編號(hào)G01N24/08GK103217449SQ20131009763
公開(kāi)日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月26日
發(fā)明者張錦勝, 唐群, 賴(lài)衛(wèi)華 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)