專利名稱：分泌型IgA抗心磷脂抗體檢測(cè)試劑盒及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種分泌型IgA抗心磷脂抗體酶免檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于酶免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
抗磷脂抗體是針對(duì)一組含有磷脂結(jié)構(gòu)抗原物質(zhì)的自身抗體，這些抗體主要包括抗心磷脂抗體，抗磷脂酸抗體和抗磷脂酰絲氨酸抗體等?？剐牧字贵w(ACL)陽(yáng)性者在孕婦中發(fā)生反復(fù)自然流產(chǎn)的多于ACL抗體陰性者，在ACL抗體陽(yáng)性的孕婦中，發(fā)生胎兒生長(zhǎng)遲緩的幾率約為15.0%左右，而在ACL抗體陰性孕婦中，胎兒生長(zhǎng)遲緩的發(fā)生率僅為1.7%左右，ACL抗體與反復(fù)自然流產(chǎn)和胎兒發(fā)育遲緩有一定相關(guān)性?？剐牧字贵w主要有IgG、IgM、IgA3種類型，血栓形成、習(xí)慣性流產(chǎn)和血小板減少主要與抗心磷脂抗體相關(guān)，抗心磷脂抗體為抗磷脂抗體中的一類，是一種累及多系統(tǒng)、多臟器，呈現(xiàn)在細(xì)胞膜上的自身抗體。抗心磷脂抗體與卵巢細(xì)胞表面的磷脂結(jié)合蛋白相互作用，干擾卵子形成、排卵，以及抗心磷脂抗體與精子或卵子表面結(jié)合，干擾受精過(guò)程?？剐牧字贵w結(jié)合到血管內(nèi)皮細(xì)胞膜磷脂上，可改變細(xì)胞膜的穩(wěn)定性；結(jié)合到血小板上，可增加血小板的粘附和聚集能力。分泌型IgA抗體(SIgA抗體)可分為血清型和分泌型，血清型多為IgA單體，分泌型多為IgA 二聚體和多聚體，IgA可以單體、二聚體甚至多聚體的形式存在，聚合體不僅結(jié)合抗原的能力增強(qiáng)，還可使IgA能結(jié)合分泌片，賦于IgA以特殊的活性。IgA型抗體也與習(xí)慣性流產(chǎn)密切相關(guān)，分泌型IgA抗心磷脂抗體當(dāng)累及胎盤微循環(huán)時(shí)，胎盤血管內(nèi)血栓形成，影響胎盤血液循環(huán)，胚胎供血不足，便導(dǎo)致反復(fù)自然流產(chǎn)或死胎。局部免疫SIgA是由J鏈連接成的雙聚IgA與SC(分泌片段)結(jié)合后形成的復(fù)合物，多為二聚體或多聚體而不易檢測(cè)。SIgA與IgA在免疫功能上具有不同之處，作用的最大特點(diǎn)是將抗原抗體的反應(yīng)控制在膜免疫系統(tǒng)的局部，而且是以非炎癥的方式限制抗原物質(zhì)對(duì)粘膜表面的侵入。SIgA的重鏈有一個(gè)含額外半胱氨酸的C端結(jié)構(gòu)，可與B細(xì)胞產(chǎn)生的J鏈相結(jié)合，使IgA形成二聚體或多聚體。聚合體不僅結(jié)合抗原的能力增強(qiáng)，J鏈對(duì)于SIgA的形成有兩個(gè)重要的功能，除了使IgA形成雙聚體，在多聚IgA(多聚免疫球蛋白)與SC/pIgR(多聚免疫球蛋白受體)結(jié)合的親和性方面也起了重要作用，在排除抗原方面發(fā)揮了重要的作用，不僅可以通過(guò)聚集潛在入侵的病原體使之易于蠕動(dòng)和粘液纖毛運(yùn)動(dòng)將其清除，而且SC能通過(guò)其糖類殘基使SIgA能與沿著表皮表面的粘膜抗體錨著于適當(dāng)?shù)慕M織處，破壞抗原的定位，進(jìn)而清除抗原，SC上的N-糖基為抗原粘附和凝集素的結(jié)合提供了很多表位，因此，SIgA抗體在生殖免疫中起到重要作用。鹽酸氨溴索為粘液溶解劑，臨床上用于呼吸病人能增加呼吸道粘膜漿液腺的分泌，從而降低痰液粘度，促進(jìn)肺表面活性物質(zhì)的分泌，增加支氣管纖毛運(yùn)動(dòng)，使痰液易于咳出。本品的巰基(-SH)結(jié)構(gòu)可使粘蛋白的雙硫(-S-S-)結(jié)構(gòu)斷裂，降低宮腔分泌物粘度，胃蛋白酶具有分解蛋白質(zhì)的作用，使分泌型抗心磷脂抗體的多聚體轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w而易于ELISA法檢測(cè)。采用聚苯乙烯反應(yīng)板條固相吸附心磷脂抗原，在反應(yīng)過(guò)程中若被檢樣本存在抗心磷脂抗體，則與板條中包被的心磷脂抗原結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，再與酶標(biāo)記的二抗形成抗原-抗體-抗抗體復(fù)合物，并結(jié)合在微孔壁表面，通過(guò)底物作用在相應(yīng)檢測(cè)孔中出現(xiàn)藍(lán)色，用以特異性的檢測(cè)分泌物中的抗心磷脂抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種樣品前處理簡(jiǎn)單，提取后可直接測(cè)定，簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)分泌型IgA抗心磷脂抗體的方法。本發(fā)明試劑盒主要由盒體(I)，酶標(biāo)板⑵中設(shè)有反應(yīng)孔⑶的板條，A試劑瓶(分泌物前處理液)(4)，B試劑瓶(酶標(biāo)記的抗心磷脂二抗)(5)，C試劑瓶(含吐溫-20的磷酸鹽PBS溶液)(6)，D試劑瓶(鄰苯二胺OPD試劑)(7)，E試劑瓶(H2O2) (8)，F(xiàn)試劑瓶(硫酸溶液)(9)，塑料托架(10)及酶標(biāo)板(2)均放在盒體(I)內(nèi)。本發(fā)明的原理是采用鹽酸氨溴索分解宮腔分泌物分泌型IgA抗心磷脂抗體，然后采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)分泌型抗心磷脂抗體。
具體實(shí)施例方式一、抗心磷脂抗體酶標(biāo)板的制備將心磷脂抗原用包被液稀釋成1: 200倍，加入IOOiU包被微孔反應(yīng)板的微孔，加入含1%小牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液350 Ul/每孔，室溫封閉2小時(shí)，4°C過(guò)夜。甩盡孔內(nèi)液體后，用洗滌液洗3次，每次3分鐘。二、酶標(biāo)記抗體的制備(I)將辣根過(guò)氧化物酶5mg溶于0.5ml0.2mol/L pH5.6HAC-NaAc緩沖液中，滴入
0.lmol/L NaIO40.25ml,4°C 30 分鐘。(2)加入 2.5% 乙二醇 0.5ml，室溫下 30min。(3)加入抗心磷脂二抗5 IOmg,用1.0mmol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液調(diào)整反應(yīng)液的pH至9.0左右，4°C過(guò)夜。(4)加入NaHB40.1ml 混勻，4°C 2 小時(shí)后對(duì)0.01mol/L pH7.4PBS透析，4°C過(guò)夜。力口
入適量中性甘油后小量分裝。三、洗滌緩沖液(PH7.4PBS)配置:0.15M KH2PO40.2 克，Na2HPO4 12H202.9 克，NaC18.0 克，KC10.2 克，Tween-200.05% 0.5ml 加蒸餾水至 1000ml。四、前處理液的配置:在IL洗滌液中加入鹽酸氨溴索30g，30mg胃蛋白酶即為前處理液。


圖1分泌型IgA抗心磷脂抗體試劑盒示意圖。圖2酶標(biāo)板示意圖。圖3酶標(biāo)板條與反應(yīng)孔示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
1.樣品處理取待檢患者宮頸分泌物拭子，加入到2ml前處理液中劇烈震蕩，靜至60min，待用。2.檢測(cè)方法使用前，將分泌型IgA抗心磷脂抗體試劑盒平衡至室溫，取100 μ I經(jīng)鹽酸氨溴索溶解劑處理的分泌物溶液、陰陽(yáng)性對(duì)照加入到酶標(biāo)板孔中，震蕩混勻后，至37°C水浴箱水浴20min，應(yīng)用洗滌液洗滌5次，拍干，每孔加入酶標(biāo)液50 μ 1，至37°C水浴箱水浴20min，應(yīng)用洗滌液洗滌5次，拍干，加入試劑D、試劑E各50 μ 1，至37°C水浴箱水浴lOmin，加I滴終止液，酶標(biāo)儀讀取結(jié)果。3.結(jié)果判定:可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺。也可測(cè)OD值:在ELISA檢測(cè)儀上，于490nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。
權(quán)利要求
1.一種分泌型IgA抗心磷脂抗體酶免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于由盒體(1)，酶標(biāo)板(2)中設(shè)有反應(yīng)孔(3)的板條，A試劑瓶(分泌物前處理液)(4)，B試劑瓶(酶標(biāo)記的抗心磷脂二抗)(5)，C試劑瓶(含吐溫-20的磷酸鹽PBS溶液)(6)，D試劑瓶(鄰苯二胺OPD試劑)(7)，E試劑瓶(H2O2) (8)，F(xiàn)試劑瓶(硫酸溶液)(9)，塑料托架(10)及酶標(biāo)板(2)均安放在盒體(I)內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分泌型抗心磷脂抗體酶免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的塑料托架(10)上制有孔和凹槽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分泌型IgA抗心磷脂抗體酶免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)板(2)有塑料支架和各自分開的帶孔穴的塑料條組成均放在盒體(I)內(nèi)。
4.一種分泌型IgA抗心磷脂抗體檢測(cè)方法，其特征在于取待檢患者宮頸分泌物拭子，加入到2ml含有30g/L鹽酸氨溴索-PBS緩沖液中劇烈震蕩，靜至60min，分別取100 μ I經(jīng)鹽酸氨溴索-PBS緩沖液液處理的分泌物溶液、陰陽(yáng)性對(duì)照加入抗心磷脂抗體ELISA反應(yīng)孔中，震蕩混勻后，至37°C水浴箱水浴20min，應(yīng)用洗滌液洗滌5次，拍干，每孔加入酶標(biāo)液50μ 1，至37°C水浴箱水浴20min，應(yīng)用洗滌液洗滌5次，拍干，加入試劑D、E各50μ 1，至37°C水浴箱水浴IOminjP I滴終止液酶標(biāo)儀測(cè)定A49tlnm值。
5.按照權(quán)利要求4所述的分泌型IgA抗心磷脂抗體檢測(cè)方法，其特征在于所述的A試劑瓶(分泌物前處理液)為含有30mg/L鹽酸氨溴索、30mg/L胃蛋白酶的PBS-Tween緩沖液。
6.按照權(quán)利要求4所述的分泌型IgA抗心磷脂抗體檢測(cè)方法，其特征在于所述的B試劑瓶，為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗心磷脂二抗。
7.按照權(quán)利要求4所述的分泌型IgA抗心磷脂抗體檢測(cè)方法，其特征在于所述的酶底物液，D試劑瓶為鄰苯二胺(OPD)試劑，E試劑瓶為H202。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分泌型抗心磷脂抗體酶免疫檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于酶免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明配制的試劑盒，通過(guò)鹽酸氨溴索使宮頸分泌物中分泌型IgA抗心磷脂抗體多聚體的雙硫鍵(-S-S-)結(jié)構(gòu)斷裂轉(zhuǎn)變成可溶性單體，加入到抗心磷脂抗體檢測(cè)酶標(biāo)板上，采用酶免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)分泌型IgA抗心磷脂抗體，經(jīng)溫浴、洗滌、加酶標(biāo)二抗，使兩者進(jìn)行反應(yīng)、洗滌、加入酶底物顯色。本發(fā)明前處理簡(jiǎn)單，快速、靈敏、準(zhǔn)確、廉價(jià)的檢測(cè)方法，適用于宮腔分泌物分泌型IgA抗心磷脂抗體檢測(cè)，可以作為不孕不育的重要檢查指標(biāo)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK103163292SQ201310102068
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月28日
發(fā)明者李立和, 常玉芝, 張超 申請(qǐng)人:天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院