專利名稱：分泌型IgA抗子宮內(nèi)膜抗體檢測試劑盒及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種分泌型IgA抗子宮內(nèi)膜抗體酶免檢測試劑盒及其檢測方法，屬于酶免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
不孕不育，分為不孕癥和不育癥，根據(jù)發(fā)生的原因可分為器質(zhì)性、免疫性、醫(yī)源性、感染性、生理性不孕，根據(jù)是否有過妊娠史可分為原發(fā)性不孕和繼發(fā)性不孕。還有10% 20%的患者原因不明，在此類患者中，免疫因素占據(jù)30 40%起著不可忽視的作用。因此免疫性不孕的臨床診治越來越被人們重視，它將有助于臨床的診斷與治療，為患者帶來福音?？棺訉m內(nèi)膜抗體(AEAb)主要有IgG、IgM、IgA3種類型，受孕是一個很復(fù)雜的生理生殖過程，需要機(jī)體生殖器官、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)功能正常，協(xié)調(diào)一致才能完成。正常位置的子宮內(nèi)膜對機(jī)體無抗原性，但女性生殖道感染使其內(nèi)部環(huán)境發(fā)生改變、生理屏障受到破壞、女性體內(nèi)獨(dú)特型抗體和抗獨(dú)特型抗體的網(wǎng)絡(luò)功能紊亂，同時也可使免疫系統(tǒng)受損及損傷子宮內(nèi)膜，導(dǎo)致機(jī)體將自身內(nèi)膜組織作為抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗子宮內(nèi)膜抗體，以及異位的子宮內(nèi)膜也可作為抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性的抗子宮內(nèi)膜抗體，可以和子宮內(nèi)膜中的抗原結(jié)合，發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，發(fā)生一系列免疫反應(yīng)，導(dǎo)致營養(yǎng)胚胎的糖原分泌不足，同時，抗子宮內(nèi)膜抗體往往與子宮內(nèi)膜異位癥并存，可通過抑制排卵、干擾精子和卵子的運(yùn)送、阻礙精卵結(jié)合、影響早期胚胎的發(fā)育、干擾胚胎著床等環(huán)節(jié)，最終導(dǎo)致孕卵著床失敗而致患者不孕不育。由于反復(fù)刺激而大量產(chǎn)生達(dá)到一定含量時，可與自身靶細(xì)胞一子宮內(nèi)膜組織發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，并激活補(bǔ)體引起損傷性效應(yīng)，造成子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞生化代謝及生理功能損害，從而引起不孕?？棺訉m內(nèi)膜抗體是一種自身抗體，所針對的抗原為子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中的一種孕激素依賴蛋白，正常位置的子宮內(nèi)膜對機(jī)體無抗原性，但異位的子宮內(nèi)膜可作為抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異抗子宮內(nèi)膜抗體不僅和異位子宮內(nèi)膜發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，同時也可與正常位置的子宮膜細(xì)胞中的抗原位點(diǎn)相結(jié)合，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，局部產(chǎn)生免疫病理變化，直接影響子宮內(nèi)膜腺體的功能，從而導(dǎo)致孕卵著床失敗或(和)不育，最終以不顯性的早期流產(chǎn)而告終。因此抗子宮內(nèi)膜抗體檢測對臨床診斷與治療不孕不育患者也有重要意義。分泌型IgA抗體(SIgA抗體)可分為血清型和分泌型，血清型多為IgA單體，分泌型多為IgA 二聚體和多聚體，IgA可以單體、二聚體甚至多聚體的形式存在，聚合體不僅結(jié)合抗原的能力增強(qiáng)，還可使IgA能結(jié)合分泌片，賦于IgA以特殊的活性。局部免疫SIgA是由J鏈連接成的雙聚IgA與SC(分泌片段)結(jié)合后形成的復(fù)合物，多為二聚體或多聚體而不易檢測。SIgA與IgA在免疫功能上具有不同之處，作用的最大特點(diǎn)是將抗原抗體的反應(yīng)控制在膜免疫系統(tǒng)的局部，而且是以非炎癥的方式限制抗原物質(zhì)對粘膜表面的侵入。SIgA的重鏈有一個含額外半胱氨酸的C端結(jié)構(gòu)，可與B細(xì)胞產(chǎn)生的J鏈相結(jié)合，使IgA形成二聚體或多聚體。聚合體不僅結(jié)合抗原的能力增強(qiáng)，J鏈對于SIgA的形成有兩個重要的功能，除了使IgA形成雙聚體，在多聚IgA(多聚免疫球蛋白)與SC/pIgR(多聚免疫球蛋白受體)結(jié)合的親和性方面也起了重要作用，在排除抗原方面發(fā)揮了重要的作用，不僅可以通過聚集潛在入侵的病原體使之易于蠕動和粘液纖毛運(yùn)動將其清除，而且SC能通過其糖類殘基使SIgA能與沿著表皮表面的粘膜抗體錨著于適當(dāng)?shù)慕M織處，破壞抗原的定位，進(jìn)而清除抗原，SC上的N-糖基為抗原粘附和凝集素的結(jié)合提供了很多表位，因此，SIgA抗體在生殖免疫中起到重要作用。N-乙酰-L-半胱氨酸為粘液溶解劑，臨床上用于呼吸病人能增加呼吸道粘膜漿液腺的分泌，從而降低痰液粘度，促進(jìn)肺表面活性物質(zhì)的分泌，增加支氣管纖毛運(yùn)動，使痰液易于咳出。本品的巰基(-SH)結(jié)構(gòu)可使粘蛋白的雙硫(-S-S-)結(jié)構(gòu)斷裂，降低宮腔分泌物粘度，胃蛋白酶具有分解蛋白質(zhì)的作用，使分泌型抗子宮內(nèi)膜抗體的多聚體轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w而易于ELISA法檢測。采用聚苯乙烯反應(yīng)板條固相吸附子宮內(nèi)膜抗原，在反應(yīng)過程中若被檢樣本存在抗子宮內(nèi)膜抗體，則與板條中包被的精子抗原結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，再與酶標(biāo)記的二抗形成抗原-抗體-抗抗體復(fù)合物，并結(jié)合在微孔壁表面，通過底物作用在相應(yīng)檢測孔中出現(xiàn)藍(lán)色，用以特異性的檢測分泌物中的抗子宮內(nèi)膜抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種樣品前處理簡單，提取后可直接測定，簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測分泌型IgA抗子宮內(nèi)膜抗體的方法。本發(fā)明試劑盒主要由盒體(I)，酶標(biāo)板(2)中設(shè)有反應(yīng)孔(3)的板條，A試劑瓶(分泌物前處理液)(4)，B試劑瓶(酶標(biāo)記的抗子宮內(nèi)膜二抗)(5)，C試劑瓶(含吐溫-20的磷酸鹽PBS溶液)(6)，D試劑瓶(鄰苯二胺OPD試劑)(7)，E試劑瓶(H2O2) (8)，F(xiàn)試劑瓶(硫酸溶液)(9)，塑料托架(10)及酶標(biāo)板(2)均放在盒體(I)內(nèi)。本發(fā)明的原理是采用N-乙酰-L-半胱氨酸分解宮腔分泌物分泌型IgA抗體，然后采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測分泌型IgA抗子宮內(nèi)膜抗體。
具體實(shí)施例方式一、抗子宮內(nèi)膜抗體酶標(biāo)板的制備將子宮內(nèi)膜抗原用包被液稀釋成1: 200倍，加入100 μ I包被微孔反應(yīng)板的微孔，加入含1%小牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液350 μ I/每孔，室溫封閉2小時，4°C過夜。甩盡孔內(nèi)液體后，用洗滌液洗3次，每次3分鐘。二、酶標(biāo)記抗體的制備(I)將辣根過氧化物酶5mg溶于0.5ml0.2mol/L pH5.6HAC-NaAc緩沖液中，滴入0.lmol/L NaIO40.25ml,4°C 30 分鐘。(2)加入 2.5% 乙二醇 0.5ml，室溫下 30min。(3)加入抗子宮內(nèi)膜抗體二抗5 IOmg,用1.0mmol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液調(diào)整反應(yīng)液的pH至9.0左右，4°C過夜。(4)加入NaHB40.1ml 混勻，4°C 2 小時后對0.01mol/L ρΗ7.4PBS透析，4°C過夜。力口
入適量中性甘油后小量分裝。三、洗滌緩沖液(PH7.4PBS)配置:0.15M KH2PO40.2 克，Na2HPO4.12Η202.9 克，NaC18.0 克，KC10.2 克，Tween-200.05% 0.5ml 加蒸餾水至 1000ml。
四、前處理液的配置:在IL洗滌液中加入N-乙酰-L-半胱氨酸30mg，30mg胃蛋白酶即為前處理液。


圖1分泌型IgA抗子宮內(nèi)膜抗體試劑盒示意圖。圖2酶標(biāo)板示意圖。圖3酶標(biāo)板條與反應(yīng)孔示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11.樣品處理取待檢患者宮頸分泌物拭子，加入到2ml前處理液中劇烈震蕩，靜至60min，待用。2.檢測方法使用前，將分泌型抗子宮內(nèi)膜抗體試劑盒平衡至室溫，取IOOiU經(jīng)N-乙酰-L-半胱氨酸溶解劑處理的分泌物溶液、陰陽性對照加入到酶標(biāo)板孔中，震蕩混勻后，至37°C水浴箱水浴20min，應(yīng)用洗滌液洗滌5次，拍干，每孔加入酶標(biāo)液50 yl，至37°C水浴箱水浴20min，應(yīng)用洗滌液洗滌5次，拍干，加入試劑D、試劑E各50 yl，至37°C水浴箱水浴IOminjP I滴終止液，酶標(biāo)儀讀取結(jié)果。3.結(jié)果判定:可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺。也可測OD值:在ELISA檢測儀上，于490nm處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
權(quán)利要求
1.一種分泌型IgA抗子宮內(nèi)膜抗體酶免疫檢測試劑盒，其特征在于由盒體(1)，酶標(biāo)板(2)中設(shè)有反應(yīng)孔(3)的板條，A試劑瓶(分泌物前處理液)(4)，B試劑瓶(酶標(biāo)記的抗子宮內(nèi)膜二抗)(5)，C試劑瓶(含吐溫-20的磷酸鹽PBS溶液)(6)，D試劑瓶(鄰苯二胺OPD試劑)(7)，E試劑瓶(H2O2) (8)，F(xiàn)試劑瓶(硫酸溶液)(9)，塑料托架(10)及酶標(biāo)板(2)均安放在盒體(I)內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分泌型IgA抗子宮內(nèi)膜抗體酶免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的塑料托架(10)上制有孔和凹槽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分泌型抗子宮內(nèi)膜抗體酶免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)板(2)有塑料支架和各自分開的帶孔穴的塑料條組成均放在盒體(I)內(nèi)。
4.一種分泌型IgA抗子宮內(nèi)膜抗體檢測方法，其特征在于取待檢患者宮頸分泌物拭子，加入到2ml含有30g/L N-乙酰-L-半胱氨酸-PBS緩沖液中劇烈震蕩，靜至60min，分別取100 μ I經(jīng)N-乙酰-L-半胱氨酸-PBS緩沖液液處理的分泌物溶液、陰陽性對照加入抗子宮內(nèi)膜抗體ELISA反應(yīng)孔中，震蕩混勻后，至37°C水浴箱水浴20min，應(yīng)用洗滌液洗滌5次，拍干，每孔加入酶標(biāo)液50 μ I，至37°C水浴箱水浴20min，應(yīng)用洗滌液洗滌5次，拍干，加入試劑D、E各50 μ 1，至37°C水浴箱水浴lOmin，加I滴終止液酶標(biāo)儀測定A49tol值。
5.按照權(quán)利要求4所述的分泌型IgA抗子宮內(nèi)膜抗體檢測方法，其特征在于所述的A試劑瓶(分泌物前處理液)為含有30mg/L N-乙酰-L-半胱氨酸、30mg/L胃蛋白酶的PBS-Tween 緩沖液。
6.按照權(quán)利要求4所述的分泌型IgA抗子宮內(nèi)膜抗體檢測方法，其特征在于所述的B試劑瓶，為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗子宮內(nèi)膜二抗。
7.按照權(quán)利要求4所述的分泌型IgA抗子宮內(nèi)膜抗體檢測方法，其特征在于所述的酶底物液，D試劑瓶為鄰苯二胺(OPD)試劑，E試劑瓶為H202。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分泌型IgA抗子宮內(nèi)膜抗體酶免疫檢測試劑盒及其檢測方法，屬于酶免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明配制的試劑盒，通過N-乙酰-L-半胱氨酸使宮頸分泌物中分泌型IgA抗子宮內(nèi)膜抗體多聚體的雙硫鍵(-S-S-)結(jié)構(gòu)斷裂轉(zhuǎn)變成可溶性單體，加入到抗子宮內(nèi)膜抗體檢測酶標(biāo)板上，采用酶免疫吸附(ELISA)法檢測分泌型IgA抗子宮內(nèi)膜抗體，經(jīng)溫浴、洗滌、加酶標(biāo)二抗，使兩者進(jìn)行反應(yīng)、洗滌、加入酶底物顯色。本發(fā)明前處理簡單，快速、靈敏、準(zhǔn)確、廉價的檢測方法，適用于宮腔分泌物分泌型抗子宮內(nèi)膜抗體檢測，可以作為不孕不育的重要檢查指標(biāo)。
文檔編號G01N33/543GK103197057SQ201310102069
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月28日
發(fā)明者李立和, 王彥平, 李錚 申請人:天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院