專(zhuān)利名稱(chēng)：雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白質(zhì)SpiC的用途。
背景技術(shù)：
雞白痢是由雞白痢沙門(mén)氏菌引起的傳染性疾病，世界各地均有發(fā)生，是危害養(yǎng)雞業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一。其排泄物是重要的傳播媒介，同時(shí)也可通過(guò)雞蛋垂直傳播?；加须u白痢的雛雞表現(xiàn)不吃飼料，怕冷，身體蜷縮，翅膀下垂，精神沉郁或昏睡，排白色粘稠或淡黃、淡綠色稀便，肛門(mén)有時(shí)被硬結(jié)的糞塊封閉，呼吸困難。成年雞無(wú)臨床癥狀，少數(shù)感染嚴(yán)重的病雞表現(xiàn)精神萎靡，排黃綠色或蛋清樣稀便，主要病變可見(jiàn)肝臟、脾臟腫大、脆弱，有壞死點(diǎn)，腎臟暗紅充血或蒼白貧血，常出現(xiàn)腹膜炎變化。產(chǎn)蛋雞可見(jiàn)卵巢萎縮，卵子變性，病雞產(chǎn)蛋停止。玻板凝集實(shí)驗(yàn)在畜牧獸醫(yī)診斷雞白痢沙門(mén)氏菌的相關(guān)工作中有著廣泛的應(yīng)用，鑒于實(shí)驗(yàn)室診斷與臨床病理變化，對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌感染情況的做出相應(yīng)的判斷。但是相對(duì)準(zhǔn)確性，特異性，精密性等方面，玻板凝集實(shí)驗(yàn)不能達(dá)到預(yù)期的效果，不能完全的達(dá)到良好的診斷目的。應(yīng)用不同的單抗標(biāo)記物和檢測(cè)技術(shù)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種方法，如反向被動(dòng)血凝試驗(yàn)(RPH)，酶免疫分析法(EIA)，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISP0T)，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析法等。1971年建立的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked ImmunoSorbentAssay，簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA)技術(shù)具有高度的敏感性、特異性和應(yīng)用廣泛性，已成為近年來(lái)最吸引人的免疫檢測(cè)方法之一，在疫苗的研發(fā)、臨床診斷以及基礎(chǔ)研究等方面得到廣泛應(yīng)用。迄今為止，尚未有針對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌感染的相關(guān)免疫檢測(cè)報(bào)道。SpiC是第一個(gè)被鑒定出沙門(mén)氏菌毒力島2編碼的效應(yīng)蛋白，其全長(zhǎng)為133個(gè)氨基酸，分子量約為14kd，SpiC不含有任何保守的結(jié)構(gòu)域。現(xiàn)有的研究表明，其在沙門(mén)氏菌得以存活于宿主吞噬細(xì)胞內(nèi)起到必要性的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供SpiC的新用途。本發(fā)明首先公開(kāi)了雞白痢沙門(mén)菌(Salmonella pullorum)分泌性蛋白SpiC或帶融合標(biāo)簽的雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC在制備雞白痢免疫檢測(cè)用材料或診斷用材料中的用途。所述雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC可直接用于制備雞白痢免疫檢測(cè)用材料或診斷用材料，或者所述雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC也可以帶融合標(biāo)簽的雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC的形式被用于制備雞白痢免疫檢測(cè)用材料或診斷用材料。所述帶融合標(biāo)簽的雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC含有所述雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC，并能與雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC抗體特異性結(jié)合。所述融合標(biāo)簽可選自:多聚組氨酸標(biāo)簽、GST標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽，HA標(biāo)簽，MBP (麥芽糖結(jié)合)標(biāo)簽，c-Myc標(biāo)簽，SNAP標(biāo)簽等。具體的，如實(shí)施例列舉的6His-SpiC，序列為SEQ ID N0:2，其表現(xiàn)出對(duì)雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC抗體靈敏性高、特異性好、與抗體親和力強(qiáng)。所述雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC的氨基酸序列為:MLAVLKGIPLIQDIRAEGNSRSWIMTIDGHPARGEIFSEAFSISLFLNDLESLPKPCLAYV TLLLAAHPDVHDYAIQLTADGGWLNGYYTTSSSSELIAIEIEKHLALTCILKNVIRNHHKLYS GGV (SEQ ID NO:1)所述雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC或帶融合標(biāo)簽的雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC可利用常規(guī)的基因工程的方法制備，如將雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC的編碼基因克隆入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體表達(dá)并分離獲得。如利用原核蛋白表達(dá)載體PET-30表達(dá)融合蛋白6His-SpiC，再采用常規(guī)的Ni親和層析柱純化法分離獲得6His-SpiC。進(jìn)一步的，所述雞白痢免疫檢測(cè)用材料或診斷用材料為ELISA檢測(cè)用材料。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種雞白痢ELISA檢測(cè)用材料，包括以下任一:a)雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC和固相載體；b)包被有雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC的固相載體。所述固相載體可以事先包被有雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC或其融合蛋白，也可以只提供空白固相載體與雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC或其融合蛋白，在檢測(cè)前由操作者自行采用常規(guī)方法在固相載體上包被特異性抗原。所述固相載體可為各種常見(jiàn)規(guī)格的微量滴定板，如96孔式微量滴定板。進(jìn)一步的，所述雞白痢ELISA檢測(cè)用材料，還包括ELISA檢測(cè)通用試劑。所述ELISA檢測(cè)通用試劑可選自下列試劑中的一種或多種: I)碳酸鹽包被緩沖液；2)底物液；3)洗滌液。所述底物液可為ELISA檢測(cè)中常用的通用底物液，如現(xiàn)配TMB底物液，現(xiàn)配OPD底物液。所述洗滌液可為ELISA檢測(cè)中常用的洗滌液，如0.05%吐溫-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液等。進(jìn)一步的，所述材料中還可以有選擇地包括其他ELISA檢測(cè)所需通用試劑，如封閉液、磷酸鹽緩沖液、磷酸鹽吐溫緩沖液等。所述封閉液可為包被固相載體常用的封閉液，如10%小牛血清、BSA或脫脂乳液
坐寸ο通常情況下，本發(fā)明的材料，各試劑分別隔離儲(chǔ)存。ELISA檢測(cè)通用試劑，不受具體檢測(cè)項(xiàng)目的限制，因此即可根據(jù)需要進(jìn)行選擇，可由操作者自行配置或者單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)。所述雞白痢ELISA檢測(cè)用材料還可選擇地包括:陰性對(duì)照和/或陽(yáng)性對(duì)照。所述陰性對(duì)照可選自:無(wú)沙門(mén)菌感染雞的血清或SPF雞的血清。所述陽(yáng)性對(duì)照可選自:雞白痢沙門(mén)菌確定感染的雞血清。本發(fā)明的進(jìn)一步提供了一種雞白痢沙門(mén)氏菌的免疫學(xué)檢測(cè)方法，為利用雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC或其融合蛋白通過(guò)ELISA法檢測(cè)樣本中的SpiC抗體，根據(jù)ELISA檢測(cè)結(jié)果，判斷樣本供體是否感染了雞白痢。
上述雞白痢沙門(mén)氏菌的免疫學(xué)檢測(cè)是在特異性抗SpiC的基礎(chǔ)上建立的用于對(duì)樣本中的SpiC抗體進(jìn)行定性分析的實(shí)驗(yàn)方法。本發(fā)明的技術(shù)效果:本發(fā)明首次公開(kāi)了可將雞白痢沙門(mén)菌蛋白質(zhì)SpiC作為沙門(mén)菌感染宿主時(shí)的生物學(xué)標(biāo)志。并利用該蛋白建立了檢測(cè)宿主體內(nèi)產(chǎn)生的SpiC抗體ELISA方法及其在免疫檢測(cè)和診斷領(lǐng)域的應(yīng)用。與傳統(tǒng)的玻板凝集實(shí)驗(yàn)相比，建立在免疫反應(yīng)基礎(chǔ)上的SpiC檢測(cè)方法的靈敏度和特異性更高，可更好更快的診斷雞白痢沙門(mén)氏菌?；诒景l(fā)明建立的ELISA檢測(cè)方法，在檢測(cè)沙門(mén)氏菌感染雞血清樣品時(shí)，陽(yáng)性樣品/陰性樣品OD值3 2.1，陰性樣品OD值=0.2.陽(yáng)性樣品OD值明顯高于陰性樣品值，表明該方法可以有效檢測(cè)出雞白痢沙門(mén)氏菌感染的雞血清中分泌SpiC抗體，具有較好的靈敏度和特異性。另外，本方法通過(guò)對(duì)禽傷寒沙門(mén)氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌感染雞血清進(jìn)行直接檢測(cè)，結(jié)果顯示同樣可以檢測(cè)出陽(yáng)性孔中分泌SpiC抗體。而大腸桿菌、巴氏桿菌等非沙門(mén)氏菌細(xì)菌感染雞血清進(jìn)行直接檢測(cè)，結(jié)果顯示檢測(cè)不到SpiC抗體 。采用本發(fā)明的試驗(yàn)方法特異強(qiáng)，靈敏度高，極大提高了檢測(cè)樣品的準(zhǔn)確率，可以為早期疾病預(yù)防與治療提供依據(jù)，可以廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)研究，用作雞機(jī)體免疫狀態(tài)的評(píng)價(jià)及感染性疾病診斷相關(guān)的研究。


圖1:PET30a-S06004-SpiC重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果。M: λ T14 MarkerI:PCR 擴(kuò)增2:PET30a-S06004-SpiC 質(zhì)粒3:PET30a-S06004-SpiC 質(zhì)粒 Xho I 單酶切4:PET30a-S06004-SpiC 質(zhì)粒 BamH I 單酶切5:PET30a-S06004_SpiC 質(zhì)粒 Xho I, BamH I 雙酶切圖2:雞白痢沙門(mén)菌S06004SpiC基因的原核表達(dá)1:蛋白 Marker2:DE3(PET30a-SpiC)誘導(dǎo)組上清；3:DE3(PET30a-SpiC)誘導(dǎo)組沉淀；4:DE3(PET30a-SpiC)未誘導(dǎo)組上清；5:DE3 (PET30a_SpiC)未誘導(dǎo)組沉淀.
注:箭頭指示為目的蛋白圖3:Western blot 檢測(cè)結(jié)果1:預(yù)染 Marker2:重組蛋白注:箭頭指示為目的蛋白圖4重組蛋白的最佳包被濃度一方陣ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖5:雞白痢沙門(mén)氏菌感染雞血清ELISA檢測(cè)結(jié)果1-7為雞白痢陽(yáng)性血清樣品空白:為健康對(duì)照
圖6 =ELISA鑒別檢測(cè)野生株與突變株結(jié)果圖1 =ELISA鑒別診斷大腸桿菌等其他沙門(mén)氏菌結(jié)果1:大腸桿菌感染I號(hào)血清2:大腸桿菌感染2號(hào)血清3:巴氏桿菌感染血清4:金黃色葡萄球菌感染血清圖8 =ELISA檢測(cè)采集樣品結(jié)果1:1-8為114樣品中隨機(jī)抽取樣品
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書(shū)所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的具體實(shí)施方式
加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書(shū)中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改 變。實(shí)施例1一、試驗(yàn)方法1.重組質(zhì)粒的構(gòu)建及原核表達(dá)1.1目的基因spiC的擴(kuò)增根據(jù)NCBI檢索，確定spiC的基因序列。使用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物 Pl: 5’ -TA lGGATCCl.ATGCTGGCAGTTTTAAAAGGCATT-3，(SEQ ID NO: 3)P2:5 -TA fTCGAGl TTATACCCCACCCGAATAAAGTTTATG-3，(SEQ ID NO:4)，酶切位
點(diǎn)XhoI和BamHI。用引物Pl和引物P2進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，以雞白痢沙門(mén)氏菌野生株基因組DNA為DNA模板，模板可通過(guò)培養(yǎng)分離的雞白痢沙門(mén)氏菌野生株，常規(guī)方法抽提其基因組DNA獲得，所述雞白痢沙門(mén)氏菌野生株可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)從沙門(mén)菌感染的雞肉食品或雞糞便中分離獲得或直接從中國(guó)微生物菌種資源庫(kù)購(gòu)買(mǎi)。反應(yīng)體系:10Xbuffer2.5μ L、dNTP2 μ L,引物 Pl (10 μ Μ)和 Ρ2(10μΜ)各 0.5 μ L、rTag 酶 I μ L、DNA 模板 0.5μ L 加去離子水補(bǔ)充總體積至25 μ L。PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng):94°C，5min;94°C 45s, 58 °C 45s，72°C lmin30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存。PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)與回收。1.2原核表達(dá)載體的構(gòu)建PET30a原核表達(dá)載體的構(gòu)建spiC基因PCR產(chǎn)物膠回收后與PMD20-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，藍(lán)白斑篩選；LB培養(yǎng)白色菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)XhoI和BamHI單酶切和雙酶切鑒定，重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測(cè)序鑒定正確，命名為PMD20-T-S06004-SpiC ;質(zhì)粒XhoI和BamHI雙酶切，回收SpiC目的基因，連接入同樣經(jīng)XhoI和BamHI雙酶切的PET30a質(zhì)粒。按10 μ I 反應(yīng)體系:Τ4 連接酶 I μ 1，T4Bufferl μ 1，PET30a3 μ 1，SpiC 片段 5 μ 1，16°C連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21 (DE3)，使用含終濃度為50 μ g/ml卡那霉素的LB平板進(jìn)行篩選。對(duì)平板上生長(zhǎng)的單菌落進(jìn)行PCR鑒定，挑選PCR陽(yáng)性菌送金瑞斯生物科技有限公司測(cè)序，并將正確的克隆命名為PET30a-S06004-SpiC。pGEX-6p-l原核表達(dá)載體的構(gòu)建:采用前述方法獲得PMD20-T-S06004_SpiC質(zhì)粒，經(jīng)XhoI和BamHI酶酶切后，回收SpiC目的基因，連接入同樣經(jīng)XhoI和BamHI酶酶切的pGEX-6p-l質(zhì)粒。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化表達(dá)菌DE3，使用含氨芐霉素的LB平板進(jìn)行篩選。對(duì)平板上生長(zhǎng)的單菌落進(jìn)行PCR鑒定，挑選PCR陽(yáng)性菌測(cè)序，并將正確的克隆命名為PGEX-6P-l-SpiC。1.3重組蛋白的優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定挑取篩選出的表達(dá)陽(yáng)性BL21 (DE3) (PET30a-S06004_SpiC)單克隆菌株，于含卡那霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)后，重新接種小量誘導(dǎo)，獲得最佳誘導(dǎo)條件(IPTG濃度，誘導(dǎo)溫度，誘導(dǎo)時(shí)間)。1.4 一抗制備挑取篩選出的表達(dá)陽(yáng)性DE3 (PGEX-6P-l_SpiC)單克隆菌株，于氨芐霉素抗性的LB內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)，次日，按1:100擴(kuò)大培養(yǎng)于含有氨芐霉素的新鮮LB培養(yǎng)基的燒瓶中，.培養(yǎng)3h(至細(xì)菌OD達(dá)到0.4-0.6之間)，加入IPTG誘導(dǎo)(終濃度0.5mM)，誘導(dǎo)5h之后收集菌體，用變復(fù)性溶液BufTerA進(jìn)行重懸(10ml/g),在冰浴條件下，進(jìn)行超聲波裂解，于4°C，8000rpm, IOmin收集沉淀,此時(shí)的沉淀即為粗制包涵體。將包涵體溶解于5ml變性緩沖液中，置37°C、250rpm，4hr。然后于12000rpm，25min收集上清液，將上清按1:30比例用復(fù)性溶液BufTerB稀釋?zhuān)糜?V 24h。用復(fù)性緩沖液BufferC進(jìn)行透析，3次/12h，最后采用PEG8000進(jìn)行濃縮，即時(shí)得到GST-SpiC蛋白。目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量檢測(cè)、N端測(cè)序均符合預(yù)期。根據(jù)重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果，推測(cè)該融合蛋白的氨基酸序列符合預(yù)期。用原核表達(dá)質(zhì)粒DE3(PGEX-6P-l-SpiC)表達(dá)的GST-SpiC蛋白免疫小鼠，免疫3次，每隔2周，采集免疫小鼠血清作為一抗。1.5ELISA鑒定重組蛋白的免疫原性按1:100擴(kuò)大培養(yǎng)于含卡那霉素的新鮮LB培養(yǎng)基的燒瓶中，置于搖床內(nèi)37°C、180rpm, 2hr后加入IPTG誘導(dǎo)(終濃度0.5mM) 30°C，持續(xù)5hr,菌液離心后取菌體進(jìn)行SDS-PAGE ；ELISA鑒定重組質(zhì)粒PET30a-S06004_SpiC表達(dá)的6HiS-SpiC蛋白的免疫原性，以DE3(PET30a-S06004-SpiC)原核表達(dá)的SpiC蛋白包被96板，用原核表達(dá)質(zhì)粒DE3 (PGEX-6P-l-SpiC)表達(dá)的GST-SpiC蛋白免疫小鼠制備抗體血清作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，ELISA鑒定重組蛋白的免疫原性。2以SpiC蛋白為雞白痢沙門(mén)菌感染檢測(cè)抗原的ELISA方法的建立2.1大量誘導(dǎo)目的蛋白并純化方法同實(shí)施例1的1.4，2.2最佳包被濃度一方陣試驗(yàn)2.3檢測(cè)雞白痢沙門(mén)菌ELISA方法的建立以SpiC蛋白包被，4°C過(guò)夜，次日用PBST清洗3遍，每次5min，用10%小牛血清封閉，37°C孵育2h，PBST清洗3遍，每次5min，待檢雞白痢沙門(mén)菌陽(yáng)性菌株血清按一定稀釋度加入，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照(無(wú)沙門(mén)菌感染或SPF雞的血清)和空白對(duì)照(PBS緩沖液)，37°C孵育2h后，PBST清洗4次；加入HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG (工作濃度1:10，000)，37°C作用Ih后，PBST清洗5遍；加入底物OPD顯色，37°C避光顯色lOmin，用2M濃H2SO4終止反應(yīng)后測(cè)0D492值。3ELISA方法的應(yīng)用3.1ELISA鑒別檢測(cè)野生株S06004與突變株(由野生株敲除spiC基因獲得，可參考文獻(xiàn)(劉男男碩士論文，中國(guó)期刊網(wǎng)CNKI)記載的方法制備)方法同實(shí)施例2的2.2，分別以攻毒組血清(以野生株感染雞所獲得的血清)和免疫組血清(spiC基因缺失株感染雞所獲得的血清)為一抗，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照(無(wú)沙門(mén)菌感染或SPF雞的血清)和空白對(duì)照(PBS緩沖液劑)，測(cè)定0D492值。3.2ELISA鑒別檢測(cè)大腸桿菌及沙門(mén)菌等致病菌方法同2.2，分別以大腸桿菌攻毒組血清(以大腸桿菌感染雞所獲得的血清)及其他沙門(mén)菌攻毒組血清為一抗，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照(無(wú)沙門(mén)菌感染或SPF雞的血清)和空白對(duì)照(PBS緩沖液)，測(cè)定0D492值。3.3待檢血清檢測(cè)將采集144株雞血清樣品，進(jìn)行玻板凝集實(shí)驗(yàn)，鑒定雞白痢陽(yáng)性菌株；應(yīng)用所建立的ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，并將兩者進(jìn)行比較分析。二.結(jié)果1.SpiC蛋白原核表達(dá)載體構(gòu)建及其免疫原性的鑒定。1.1SpiC蛋白原核表達(dá)載體成功構(gòu)建將鑒定正確的PMD20-T_SpiC重組質(zhì)粒中SpiC基因亞克隆入PET30a載體中，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21 (DE3)后，其重組子PET30a-S06004-SpiC經(jīng)PCR、酶切鑒定(如圖1)和測(cè)序結(jié)果都正確。測(cè)序鑒定插入的SpiC編碼基因序列為:ATGCTGGCAGTTTTAAAAGGCATTCCATTAATTCAGGATATCAGGGCCGAAGGTAAT AGCCGATCCTGGATAATGACTATTGATGGGCATCCTGCCAGAGGAGAAATTTTCTCAGAA GCATTTTCTATTTCTTTGTTCTTAAATGACCTGGAAAGCTTACCTAAGCCTTGTCTTGCCT ATGTGACACTACTGCTTGCAGCACACCCGGACGTCCATGACTATGCTATACAGCTCACAG CGGATGGGGGATGGTTAAACGGTTATTATACCACAAGTAGTAGCTCTGAGCTTATTGCTAT TGAGATAGAAAAACACCTGGCTTTAACTTGCATTTTAAAAAATGTAATACGCAATCACCATAAACTTTATTCGGGTGGGGTATAA (SEQ ID NO:5)在本發(fā)明記載了質(zhì)粒中插入的SpiC編碼基因序列后，本領(lǐng)域技術(shù)人員除了可以采用從野生株基因組DNA中PCR獲得該基因片段外，也可通過(guò)合成或者利用如拼接PCR等的方法來(lái)獲得該基因片段。1.2IPTG 誘導(dǎo)表達(dá) BL21 (DE3)菌株產(chǎn)物的 SDS-PAGE 檢測(cè) PET30a-S06004_SpiC 菌株在不同IPTG濃度，在不同的溫度和不同的誘導(dǎo)時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)條件下，收集菌液離心后，取菌體進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，確定IPTG濃度0.5mM,最佳溫度30°C，最佳時(shí)間5hr。如圖2所示，目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為20kd，去除質(zhì)粒PET30a表達(dá)的His標(biāo)簽蛋白為6kd后，與SpiC蛋白理論值(約14kd)相一致。融合蛋白經(jīng)N端測(cè)序符合預(yù)期。根據(jù)重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果，推測(cè)該融合蛋白的氨基酸序列為:MHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSEFELRR QACGRTRAPPPPPLRSGCMLAVLKGIPLIQDIRAEGNSRSWIMTIDGHPARGEIFSEAFSISLF LNDLESLPKPCLAYVTLLLAAHPDVHDYAIQLTADGGWLNGYYTTSSSSELIAIEIEKHLALT CILKNVIRNHHKLYSGGV (SEQ ID NO:2)1.3重組蛋白的免疫原性的鑒定表達(dá)菌DE3 (PGEX-6P-l-SpiC)原核表達(dá)的GST-SpiC蛋白免疫7日齡SPF雞(80 μ g/p、), 一周之后進(jìn)行二免(100 μ g/Λ), 二免之后心臟采血,置于4°C 2_3h,收集血清；以原核表達(dá)的DE3 (PET30a-S06004-SpiC) 6His_SpiC蛋白作為抗原，二免SPF雞血清作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG為二抗，結(jié)果如圖3所示，western blot鑒定重組蛋白有良好的免疫原性。2以SpiC蛋白為抗原建立ELISA方法及其初步應(yīng)用。
2.1重組蛋白的最佳包被濃度一方陣實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，結(jié)果顯示重組蛋白的最佳包被濃度5ug/ml。2.2檢測(cè)雞白痢沙門(mén)菌ELISA方法的建立以SpiC蛋白包被，運(yùn)用ELISA方法檢測(cè)判定為雞白痢陽(yáng)性的血清，結(jié)果如圖5所示。2.3ELISA 鑒別檢測(cè)野生株與突變株(S06004、S06004ASpiC)結(jié)果如圖6所示2.4ELISA鑒別檢測(cè)大腸桿菌及沙門(mén)菌等致病菌結(jié)果如圖7所示2.1玻板凝集檢測(cè)結(jié)果144株待檢血清樣品，122株為確診為雞白痢陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為84.7%。而運(yùn)用ELISA檢測(cè)方法，陽(yáng)性率高于玻板凝集實(shí)驗(yàn)診斷結(jié)果。兩種診斷方法的比較圖:
權(quán)利要求
1.雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC或帶融合標(biāo)簽的雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC在制備雞白痢免疫檢測(cè)用材料或診斷用材料中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC或帶融合標(biāo)簽的雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC的用途，其特征在于，所述帶融合標(biāo)簽的雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC中，所述融合標(biāo)簽選自多聚組氨酸標(biāo)簽或GST標(biāo)簽。
3.如權(quán)利要求1所述雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC或帶融合標(biāo)簽的雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC的用途，其特征在于，所述雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
4.如權(quán)利要求1所述雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC或帶融合標(biāo)簽的雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC的用途，其特征在于，所述帶融合標(biāo)簽的雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。
5.如權(quán)利要求1所述雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC或帶融合標(biāo)簽的雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC的用途，其特征在于，所述雞白痢免疫檢測(cè)用材料或診斷用材料為ELISA檢測(cè)用材料。
6.—種雞白痢ELISA檢測(cè)用材料,包括以下任一: a)雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC和固相載體； b)包被有雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC的固相載體。
7.如權(quán)利要求6所述雞白痢ELISA檢測(cè)用材料，其特征在于，所述固相載體為微量滴定板。
8.如權(quán)利要求6所述雞白痢ELISA檢測(cè)用材料，其特征在于,所雞白痢ELISA檢測(cè)用材料還包括ELISA檢測(cè)通用試劑。
9.如權(quán)利要求8所述雞白痢ELISA檢測(cè)用材料，其特征在于，所述ELISA檢測(cè)通用試劑包括列試劑中的一種或多種: 1)碳酸鹽包被緩沖液； 2)底物液； 3)洗滌液； 4)封閉液； 5)磷酸鹽緩沖液； 6)磷酸鹽吐溫緩沖液。
10.如權(quán)利要求6所述雞白痢ELISA檢測(cè)用材料，其特征在于，所雞白痢ELISA檢測(cè)用材料選擇性包括:陰 性對(duì)照和/或陽(yáng)性對(duì)照。
11.如權(quán)利要求10所述雞白痢ELISA檢測(cè)用材料，其特征在于，所述陰性對(duì)照選自■ 無(wú)沙門(mén)菌感染雞的血清或SPF雞的血清；所述陽(yáng)性對(duì)照為雞白痢沙門(mén)菌確定感染的雞血清。
全文摘要
本發(fā)明提供了雞白痢沙門(mén)菌分泌性蛋白SpiC的用途，它能夠作為沙門(mén)菌感染宿主時(shí)的診斷生物學(xué)標(biāo)志物，用于制備雞白痢免疫檢測(cè)用材料或診斷用材料。本發(fā)明進(jìn)一步利用該蛋白建立了檢測(cè)宿主體內(nèi)產(chǎn)生的SpiC抗體的雞白痢ELISA檢測(cè)用材料，并給出了對(duì)應(yīng)的雞白痢ELISA檢測(cè)方法?；谠摰鞍捉⒘藱z測(cè)宿主體內(nèi)產(chǎn)生的SpiC抗體ELISA方法特異性好，靈敏度高，可作機(jī)體免疫狀態(tài)的評(píng)價(jià)及感染性疾病診斷相關(guān)的研究。
文檔編號(hào)G01N33/68GK103197078SQ20131010462
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月28日
發(fā)明者焦新安, 耿士忠, 潘志明, 劉歡, 孫林 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)