一種蛋白質(zhì)樣品原位快速預(yù)處理方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)樣品原位快速預(yù)處理方法，于離心超濾裝置內(nèi)原位進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品的整個(gè)預(yù)處理過程，集成了蛋白質(zhì)樣品變性、還原、溶劑置換、烷基化、酶解及雜質(zhì)去除過程，并采用微波輔助加速蛋白質(zhì)樣品的酶解。該方法可顯著提高蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理的通量，同時(shí)，整個(gè)樣品預(yù)處理過程原位進(jìn)行，回收率高。此外，離心超濾裝置的使用可方便、快捷地實(shí)現(xiàn)樣品的純化及溶劑的置換，酶解產(chǎn)物無需額外的純化過程，可直接與后續(xù)的高效液相色譜分離-質(zhì)譜鑒定聯(lián)用。
【專利說明】一種蛋白質(zhì)樣品原位快速預(yù)處理方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)樣品原位快速預(yù)處理方法。

【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)的鑒定與社會人群的健康息息相關(guān)。對于大部分遺傳疾病，如腫瘤和肥胖癥，患者與健康人群的某些特定蛋白存在差異性表達(dá)。為實(shí)現(xiàn)疾病的“早發(fā)現(xiàn)，早治療”，對特定蛋白質(zhì)的快速及高靈敏度的鑒定具有重要意義。作為蛋白質(zhì)分析的首要步驟，蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理可實(shí)現(xiàn)雜質(zhì)的去除及樣品的富集，因此建立高效快捷的蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理方法，在實(shí)現(xiàn)高靈敏度、高準(zhǔn)確度的差異性蛋白質(zhì)的研究過程中發(fā)揮重要作用，進(jìn)而推動疾病的發(fā)現(xiàn)與治療上的深入研究。
[0003]目前，基于凝膠的樣品預(yù)處理和基于自由溶液的樣品預(yù)處理是蛋白質(zhì)組常用的兩大技術(shù)。然而，膠上酶解耗時(shí)長，后續(xù)處理復(fù)雜，且樣品損失嚴(yán)重。此外，酶解效率與肽段的提取效率有待提高；自由溶液酶解具有酶解時(shí)間長(通常需要1h以上)的缺點(diǎn)，無法滿足快速處理的要求。近些年來發(fā)展的酶反應(yīng)器具有酶解時(shí)間短，酶解效率高，可與多維分離平臺聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)自動化等優(yōu)點(diǎn)。然而，酶反應(yīng)器基質(zhì)材料的非特異性吸附問題會造成酶解重現(xiàn)性差，不利于樣品的分析。(Liang, Y; Tao, D.Y.;Ma, J.F.; Sun, L.L.; Liang, Z.; Zhang, L.H.; Zhang, Y.K.J.Chromatogr.A2011, 1218 (20)，2898-2905)
[0004]近年來大量有關(guān)超濾膜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超濾膜的使用具有很好的去噪效果、樣品損失量較小、易實(shí)現(xiàn)溶劑置換的優(yōu)勢。同時(shí)，微波輔助由于其高效性早已被用于樣品預(yù)處理過程中。本發(fā)明結(jié)合了超濾膜的去噪性能和微波水浴輔助酶解的高效性，并提出了樣品在膜上原位進(jìn)行樣品預(yù)處理所有步驟，進(jìn)一步減少樣品的損失量，從而發(fā)展出一種新型樣品預(yù)處理方法，具有高效、快速、回收率高的優(yōu)點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理過程耗時(shí)長，操作繁瑣，損失量大等不足，本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)樣品原位快速預(yù)處理方法，于離心超濾裝置中集成了蛋白質(zhì)的變性、還原、溶劑置換、烷基化、酶解及雜質(zhì)去除整個(gè)樣品預(yù)處理過程。同時(shí)，采用微波水浴輔助酶解，可有效降低酶解時(shí)間，提高酶解效率。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007](I)蛋白質(zhì)樣品的原位富集:采用pH為1-6.5的酸性溶液或pH為7.5-14的溶有體積濃度為1%_30%的表面活性劑(十二烷基磺酸鈉、脫氧膽酸鈉、TritonX-100, chaps、Rapigest SF或NP_40d)或去垢劑(尿素、硫脲或鹽酸胍)的堿性溶液溶解蛋白質(zhì)樣品，將蛋白質(zhì)樣品溶液加入至超濾管中實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的原位富集；
[0008](2)溶劑的置換:蛋白質(zhì)樣品溶液經(jīng)步驟(I)處理后，若蛋白質(zhì)樣品后續(xù)還原過程所需溶液體系環(huán)境與蛋白質(zhì)樣品溶解液體系環(huán)境所需酸堿環(huán)境不同，則需進(jìn)行PH置換，即若蛋白質(zhì)溶解液體系為PH為1-6.5的酸性溶液(甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液)，而后續(xù)還原過程所需溶液體系為堿性環(huán)境，則在蛋白質(zhì)原位富集后將離心超濾裝置離心，待超濾管內(nèi)溶劑全部離心至收集管后，向超濾管中加入體積為1-20倍蛋白質(zhì)溶解液體積的PH為7.5-14的堿性緩沖溶液(碳酸氫銨緩沖鹽溶液、磷酸緩沖鹽溶液、或三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液)；若蛋白質(zhì)溶解液體系為PH為7.5-14的堿性緩沖溶液，而后續(xù)還原過程所需溶液體系為酸性環(huán)境，則在蛋白質(zhì)原位富集后將離心超濾裝置離心，待超濾管內(nèi)溶劑全部離心至收集管后，向超濾管中加入體積為1-20倍蛋白質(zhì)溶解液體積的pH為1-6.5的酸性溶液；若后續(xù)蛋白質(zhì)樣品還原過程所需溶液體系環(huán)境與蛋白質(zhì)樣品溶解液體系環(huán)境所需酸堿環(huán)境相同，則不需要進(jìn)行PH置換；
[0009](3)蛋白質(zhì)樣品的變性及還原:向步驟(2)中處理的樣品溶液中加入還原劑(二硫蘇糖醇(DTT)、磷酸三氯乙酯(TCEP)或β-巰基乙醇)，在高溫水浴下，同時(shí)進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品的變性及還原過程；
[0010](4)雜質(zhì)的去除:將步驟(3)中處理的樣品溶液經(jīng)離心后，向超濾管中加入體積為蛋白質(zhì)樣品還原體系溶液體積的1-20倍的pH為7.5-14的堿性緩沖溶液(碳酸氫銨緩沖鹽溶液、磷酸緩沖鹽溶液、或三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液)或水溶液并離心，去除蛋白質(zhì)溶液中的小分子雜質(zhì)；
[0011](5)蛋白質(zhì)樣品的烷基化及酶解:向步驟(4)中離心后的超濾管中加入以pH為
7.5-9的堿性緩沖溶液為溶劑配制的烷基化溶液(碘代乙酸或碘乙酰胺)及胰蛋白酶溶液后，將樣品轉(zhuǎn)入至盛有水的微波盒，并將微波盒轉(zhuǎn)入至微波爐中，采用微波水浴輔助方法同時(shí)進(jìn)行烷基化及酶解過程；
[0012](6)酶解肽段的收集:微波水浴結(jié)束后，將離心超濾裝置進(jìn)行離心，保留收集管中所得溶液，向超濾管中加入蒸餾水后，再次進(jìn)行離心，保留收集管中所得溶液，將兩次收集管中所得溶液混合，即為所需的蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物。
[0013]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0014]1、樣品損失小。整個(gè)蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理過程包括蛋白質(zhì)樣品的變性、還原、烷基化、酶解及除鹽過程皆在離心超濾裝置中原位進(jìn)行，有效減少樣品轉(zhuǎn)移造成的損失。
[0015]2、可實(shí)現(xiàn)溶劑的置換及雜質(zhì)的去除。離心超濾裝置的引入，可以通過離心去除溶齊U，從而實(shí)現(xiàn)酸堿溶劑的置換；同時(shí)，由于離心超濾裝置中的超濾膜具有截留大分子的功能，可實(shí)現(xiàn)小分子雜質(zhì)的去除。
[0016]3、通量高。蛋白質(zhì)樣品的變性及還原過程同時(shí)進(jìn)行，烷基化及酶解過程微波輔助下同時(shí)進(jìn)行，整個(gè)樣品預(yù)處理過程可在Ih內(nèi)完成。
[0017]4、處理全蛋白質(zhì)組。使用蛋白質(zhì)原位預(yù)處理方法可處理可溶性蛋白質(zhì)及膜蛋白質(zhì)。
[0018]5、酶解效率高。酶解過程在微波水浴輔助下進(jìn)行，酶解時(shí)間縮短至lmin，酶量提聞，從而提聞酶解效率。
[0019]6、處理微量樣品。蛋白質(zhì)樣品酶解后加水進(jìn)行沖洗，可有效增加酶解產(chǎn)物含量，同時(shí)降低樣品中鹽的濃度，減少了除鹽步驟，進(jìn)一步減少樣品損失，利于微量樣品的處理。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為離心超濾裝置示意圖；
[0021]圖2為蛋白質(zhì)原位樣品預(yù)處理流程圖。
[0022]圖中1:超濾管2:收集管3:蛋白質(zhì)的變性及還原4:雜質(zhì)的去除5:蛋白質(zhì)的烷基化及酶解6:樣品的沖洗7:酶解產(chǎn)物的收集。

【具體實(shí)施方式】
[0023]本發(fā)明采用的離心超濾裝置為商品化(購自Millipore，Billerica, MA)的由超濾管及收集管組成的純化裝置；超濾管為底部置有熱密封超濾膜(超濾膜為再生纖維素膜)的圓柱體結(jié)構(gòu)；
[0024]使用時(shí),超濾管置于收集管內(nèi)。
[0025]1.蛋白溶液的配制
[0026]將大腸桿菌蛋白質(zhì)樣品(購自Sigma, St.Louis, MO)溶解于1mM碳酸氫銨緩沖溶液(ABC)中(pH8.7)，BCA法測定其濃度后，以1mM ABC為溶劑配制蛋白質(zhì)樣品濃度為Img/
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[0027]2.蛋白溶液的變性及還原
[0028]取步驟I中制備的大腸桿菌蛋白溶液30 μ L(即30 μ g樣品)置于超濾管中，并加Λ 1mM ABC補(bǔ)齊至60 μ L溶液，加入IM 二硫蘇糖醇(DTT)(溶解于1mMABC) 6 μ L (終濃度為10mM)，在95°C水浴下反應(yīng)5min。
[0029]3.雜質(zhì)的去除
[0030]步驟2中處理的樣品在HOOOXg轉(zhuǎn)速下離心lOmin，棄去收集管中廢液。向超濾管中加入200 μ LlOmM ABC，在14000 Xg轉(zhuǎn)速下離心15min，棄去收集管中廢液。
[0031]4.蛋白溶液的烷基化及酶解
[0032]向步驟3中離心后的超濾管中加入SOyLlOmM碘代乙酰胺(IAA)(溶解于1mMABC)溶解的30 μ g胰蛋白酶溶液，將離心超濾裝置轉(zhuǎn)入盛有水的微波盒中并將微波盒放入微波爐中，選擇開2秒停I秒的加熱時(shí)間間隔模式，微波水浴下酶解30s。
[0033]5.肽段的收集
[0034]步驟4中處理的樣品在14000 Xg轉(zhuǎn)速下離心lOmin，保留收集管中所得溶液。向超濾管中加入100 μ L蒸餾水進(jìn)行沖洗，14000 Xg轉(zhuǎn)速下離心lOmin，保留收集管中所得溶液，并將兩次收集管中所得溶液混合。
[0035]6.LTQ-Orbitrap Velos 檢測
[0036]步驟5中處理得到的大腸桿菌酶解產(chǎn)物14000 Xg轉(zhuǎn)速下離心1min,取其上清溶液，使用LTQ-Orbitrap Velos進(jìn)行檢測。質(zhì)譜儀分析在正離子模式下進(jìn)行。噴霧電壓為
2.0kV，加熱毛細(xì)管溫度為200°C。采用Xcalibur軟件記錄總離子流圖與MS譜圖；質(zhì)荷比范圍為300到1800。MS/MS譜圖采用數(shù)據(jù)依賴模式進(jìn)行采集。從一張MS全掃描中，選擇15個(gè)最強(qiáng)的母離子進(jìn)行MS/MS的分析。MS/MS掃描的碰撞能量為35%。
[0037]7.數(shù)據(jù)分析
[0038]對采集的譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索和數(shù)據(jù)分析，采用Mascot進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索。數(shù)據(jù)庫為ncb1.Ecol1.REVERSE。半胱氨酸殘基設(shè)為固定化修飾+57.0215Da,甲硫氨酸殘基設(shè)為可變修飾+15.9949Da。肽段檢索采用胰蛋白酶完全酶切，最多允許兩個(gè)漏切位點(diǎn)。肽段和MS/MS質(zhì)量允許偏差分別為1ppm和0.5Da0調(diào)節(jié)Xcorr值以控制肽段鑒定的假陽性率FDR〈1%(FDR定義為采用正庫與反庫鑒定到的肽段數(shù)量)。共鑒定到3371個(gè)蛋白group，對應(yīng)22854條非冗余肽段。
[0039]該方法可顯著提高蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理的通量，同時(shí)，整個(gè)樣品預(yù)處理過程原位進(jìn)行，回收率高。此外，離心超濾裝置的使用可方便、快捷地實(shí)現(xiàn)樣品的純化及溶劑的置換，酶解產(chǎn)物無需額外的純化過程，可直接與后續(xù)的高效液相色譜分離-質(zhì)譜鑒定聯(lián)用。
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白質(zhì)樣品原位快速預(yù)處理方法，其特征在于:整個(gè)蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理過程，包括蛋白質(zhì)樣品的變性、還原、溶劑置換、烷基化、酶解及雜質(zhì)去除過程，皆在離心超濾裝置中原位進(jìn)行，具體包括: (1)采用pH為1-6.5的酸性溶液或pH為7.5-14的溶有體積濃度為1%_30%的表面活性劑或去垢劑的堿性溶液溶解蛋白質(zhì)樣品，將樣品溶液加入至離心超濾裝置的超濾管中實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的原位富集； (2)蛋白質(zhì)樣品溶液經(jīng)步驟(1)處理后，若蛋白質(zhì)樣品后續(xù)還原過程所需溶液體系環(huán)境與蛋白質(zhì)樣品溶解液體系環(huán)境所需酸堿環(huán)境不同，則需進(jìn)行PH置換，即將離心超濾裝置離心后向超濾管中加入pH為蛋白質(zhì)樣品還原過程所需pH沮圍的溶液；若后續(xù)蛋白質(zhì)樣品還原過程所需溶液體 系環(huán)境與蛋白質(zhì)樣品溶解液體系環(huán)境所需酸堿環(huán)境相同，則不需要進(jìn)行pH置換。 (3)向步驟(2)中處理的樣品溶液中加入還原劑，同時(shí)進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品的變性及還原過程; (4)將步驟(3)中處理的樣品溶液經(jīng)離心后，向超濾管中加入pH為7.5-14的堿性緩沖溶液或水溶液并離心，實(shí)現(xiàn)雜質(zhì)的去除； (5)向步驟(4)中離心后的超濾管中加入以pH為7.5-9的堿性緩沖溶液為溶劑配制的烷基化溶液及胰蛋白酶溶液后，將樣品轉(zhuǎn)入至盛有水的微波盒，并將微波盒轉(zhuǎn)入至微波爐中，采用微波水浴輔助方法同時(shí)進(jìn)行烷基化及酶解過程； (6)酶解完成后，將離心超濾裝置進(jìn)行離心，保留離心超濾裝置的收集管內(nèi)所得溶液；向超濾管中加入蒸餾水，將離心超濾裝置進(jìn)行離心，保留收集管內(nèi)所得溶液，將兩次收集管中所得溶液混合，即為所需的蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物。
2.按照權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)樣品原位快速預(yù)處理方法，其特征在于:所述的蛋白質(zhì)樣品溶劑，PH為1-6.5的酸性溶液，可為甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液；pH為7.5-14的堿性緩沖溶液，可為碳酸氫銨緩沖鹽溶液、磷酸緩沖鹽溶液或三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液； 所述的表面活性劑為十二烷基磺酸鈉、脫氧膽酸鈉、Triton X-100、chaps、RapigestSF或NP-40d ;去垢劑為尿素、硫脲或鹽酸胍。
3.按照權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)樣品原位快速預(yù)處理方法，其特征在于:所述的離心超濾裝置為商品化的由超濾管及收集管組成的純化裝置；超濾管為底部置有熱密封超濾膜的圓柱體結(jié)構(gòu)。
4.按照權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)樣品原位快速預(yù)處理方法，其特征在于:步驟(1)中所述的蛋白質(zhì)樣品溶液在超濾管中體積范圍為50 μ L-1mL,對應(yīng)蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量范圍為1ng-1mg0
5.按照權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)樣品原位快速預(yù)處理方法，其特征在于:步驟(2)中所述的溶劑PH置換方法具體如下，若蛋白質(zhì)溶解液體系為權(quán)利要求2中所述的pH為1-6.5的酸性溶液，而后續(xù)還原過程所需溶液體系為堿性環(huán)境，則在蛋白質(zhì)原位富集后將離心超濾裝置離心，待超濾管內(nèi)溶劑全部離心至收集管后，向超濾管中加入體積為1-20倍蛋白質(zhì)溶解液體積的權(quán)利要求2中所述的pH為7.5-14的堿性緩沖溶液；若蛋白質(zhì)溶解液體系為權(quán)利要求2中所述的pH為7.5-14的堿性緩沖溶液，而后續(xù)還原過程所需溶液體系為酸性環(huán)境，則在蛋白質(zhì)原位富集后將離心超濾裝置離心，待超濾管內(nèi)溶劑全部離心至收集管后，向超濾管中加入體積為1-20倍蛋白質(zhì)溶解液體積的權(quán)利要求2中所述的pH為1-6.5的酸性溶液。
6.按照權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)樣品原位快速預(yù)處理方法，其特征在于:步驟(3)中所述的還原劑為二硫蘇糖醇(DTT)、磷酸三氯乙酯(TCEP)或β-巰基乙醇；終濃度為l-200mM; 所述的蛋白質(zhì)變性及還原條件為80-100°C水浴下進(jìn)行，時(shí)間為l-20min。
7.按照權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)樣品原位快速預(yù)處理方法，其特征在于:步驟(5)中所述的向超濾管中加入的烷基化溶液及胰蛋白酶溶液的溶劑為權(quán)利要求2中所述的pH為7.5-14的堿性緩沖溶液，但其pH范圍需調(diào)節(jié)至7.5-9 ； 所述的烷基化試劑為碘代乙酸或碘乙酰胺，終濃度為l-200mM ； 所述的樣品酶解過程中使用胰蛋白酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比例為1:10 - 10:1。
8.按照權(quán)利要求1或7所述蛋白質(zhì)樣品原位快速預(yù)處理方法，其特征在于: 所述的蛋白質(zhì)樣品包括可溶性蛋白質(zhì)和/或不可溶膜蛋白質(zhì)； 步驟(5)中所述的樣品烷基化及酶解過程在微波水浴輔助下同時(shí)進(jìn)行，具體條件及過程為將離心超濾裝置放入至盛水的微波盒中，并將微波盒放入在微波爐內(nèi)，購買的微波爐功率為800W，選擇 加熱時(shí)間間隔為開2秒停I秒或開I秒停I秒，樣品的微波水浴輔助酶解時(shí)間控制在1s - 600s完成。
9.按照權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)樣品原位快速預(yù)處理方法，其特征在于:步驟(4)中所述的向超濾管中加入的堿性緩沖溶液為權(quán)利要求2中所述的pH為7.5-14的堿性緩沖溶液； 加入的堿性緩沖溶液或水溶液的體積為蛋白質(zhì)樣品還原體系溶液體積的1-20倍。
10.按照權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)樣品原位快速預(yù)處理方法，其特征在于: 所述的樣品預(yù)處理方法中，蛋白質(zhì)樣品變性及還原過程同時(shí)進(jìn)行，烷基化及酶解過程同時(shí)進(jìn)行； 該方法可用于提取自細(xì)胞、組織及血漿中的可溶性蛋白質(zhì)及膜蛋白質(zhì)樣品的分析中。
【文檔編號】G01N1/34GK104075931SQ201310105940
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月29日
【發(fā)明者】張麗華, 方菲, 趙群, 楊開廣, 張玉奎 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所