專(zhuān)利名稱(chēng)：蛋白質(zhì)等電聚焦電泳的方法及其裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是電化學(xué)方法分析材料技術(shù)領(lǐng)域的方法和裝置，具體是基于移動(dòng)反應(yīng)界面(moving reaction boundary, MRB)的蛋白質(zhì)等電聚焦電泳(isoelectricfocusing, IEF)方法及其裝置。
背景技術(shù)：
IEF技術(shù)為蛋白質(zhì)高效分離技術(shù)，其原理是利用兩性電解質(zhì)在凝膠中創(chuàng)造一個(gè)PH梯度，同時(shí)利用蛋白質(zhì)具有兩性解離和等電點(diǎn)的特點(diǎn)，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離分析(P.G.Righttij In:T.S.Work and R.H.Rurdonj Laboraotary Techniques in Biochemistryand Molecular Bioboligy, Elsevier Biomedical Press,Amesterdam New YorkOxford, V II，1983，p.1-86，268-313)。IEF具有分離效率高、分離富集同時(shí)完成、上樣模式多樣等優(yōu)點(diǎn)。IEF技術(shù)應(yīng)用廣泛，它不僅是蛋白質(zhì)pi表征和純度鑒定的標(biāo)準(zhǔn)分析技術(shù)(0.Vesterbergj Acta Chem.Scand.1969，23，2653)；同時(shí)也是復(fù)雜蛋白質(zhì)及其組學(xué)研究中的關(guān)鍵分離技術(shù)(S.Nileshj E.Scott, Nature Protocols, 2006，1，1732)，在雙向凝膠電泳中總是作為第一向分離技術(shù)(P.H.0’ Farrell，J.Biol.Chem.1975，250，4007 ；A.D.Rolland，B.Evrardj N.Guittonj J.Proteome Res.2007，6，683)。基于常規(guī)凝膠電泳的IEF技術(shù)主要二種，包括:(i)、管式凝膠IEF技術(shù)(L.E.M.Miles, G.E.Simmons, A.Chrambachj Anal.Biochem.1972, 49, 109) ； (ιι)λ 薄層凝膠 IEF 技術(shù)(P.G.Righttij In:T.S.Work and R.H.Rurdonj Laboraotary Techniques inBiochemistry and Molecular Bioboligyj Elsevier Biomedical Press, AmesterdamNew York Oxford, v II，1983，p.1-86, 268-313)。但在這兩種凝膠 IEF 電泳技術(shù)中始終存在 pH 梯度漂移(drifting of pH gradient, H.Rilbej In:Electrofocusingand Isotachophoresis(Editors:B.J.Radola and D.Graesl in) , Walter deGruyter&C0., Berlin New York，1977，p35_50)和水平化(plateau of pH gradient, P.Arosioj E.Grana and P.G.Righettij J.Chromatogr.1978，166，55)現(xiàn)象造成的不穩(wěn)定性。并且在雙向凝膠電泳(two dimensional gel electrophoresis, 2DE)中，由于管式和薄層凝膠IEF的凝膠很難取出，取出后也很難完整的進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)移操作；因此，基于常規(guī)凝膠電泳的第一向IEF分離技術(shù)很難與第二向的SDS-PAGE電泳兼容。為了克服常規(guī)凝膠IEF技術(shù)穩(wěn)定性問(wèn)題以及與SDS-PAGE電泳兼容性問(wèn)題，Rightti等于上世紀(jì)八十年代發(fā)明了固定化pH梯度(immobilized pH gradient, IPG)膠條以及基于 IPG 膠條的 IEF 技術(shù)((A Cor,., W.Postelj R.Westermeierj B.Bjellqvistj K.Ekj E.Gianazzaj P.G.Righettij Prot.Biol.Fluidsl983，30，607 ;Α.Gorg,W.Postelj R.Westermeierj B.Bjellqvistj K.Ekj E.Gianazzaj P.G.Righettij Prot.Biol.Fluidsl983, 30，607)。由于較好地解決了傳統(tǒng)凝膠IEF技術(shù)穩(wěn)定性和兼容性等問(wèn)題，基于IPG膠條的IEF是目前應(yīng)用最廣泛的聚焦電泳技術(shù)，已經(jīng)成為2DE的第一向標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)(S.Nileshj E.ScottjNature Protocols，2006，1，1732)。相關(guān)的 IEF 技術(shù)體系、IPG 膠條以及配套儀器等主要有美國(guó)GE公司通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部(http://gehealthcare.bioon.com.cn/)和 Bio-Rad 公司(http://www.bio-rad.com/)提供。但I(xiàn)PG技術(shù)帶來(lái)一些新的問(wèn)題。第一、由于IPG膠條是直接放在正負(fù)電極上，膠條兩端沒(méi)有電極液，所以無(wú)法有效控制pH梯度的形成，進(jìn)而對(duì)pH梯度進(jìn)行調(diào)控，這特別不利于酸性和/或堿性蛋白的分離分析；第二、在IPG電泳技術(shù)中，由于兩性電解質(zhì)的固化導(dǎo)致不同Pl的蛋白質(zhì)非同步聚焦，造成IEF分辨率的明顯下降。第三、IPG技術(shù)消耗了 IEF體系中大量的活性極性基團(tuán)，增加了 PH梯度形成后IEF體系的疏水性，導(dǎo)致聚焦電泳時(shí)蛋白質(zhì)很容易沉淀，嚴(yán)重影響IEF和2DE穩(wěn)定性以及后續(xù)定量分析的不確定性。因此，亟待發(fā)明一種新的IEF技術(shù)，該IEF技術(shù)能夠較好解決上述IEF時(shí)的蛋白質(zhì)沉淀、非同步聚焦和pH梯度的調(diào)控等問(wèn)題。在新近的研究中，我國(guó)學(xué)者Cao等提出了系統(tǒng)的移動(dòng)反應(yīng)界面(moving reaction boundary, MRB)概念和理論(C.-X.Ca。，Acta Phys.-Chim.Sin.1997，13，827 ; C.-X.Cao, Acta Chem.Scand.1998，52，709 ; C.X.Cao, L.Y.Fan, W.Zhang, Analyst2008, 133，1139)，并且基于 MRB 概念 Cao 和 Liang 等建立了較系統(tǒng)的 IEF動(dòng)力學(xué)理論(C.X.Cao, J.Chromatogr.A1998，813, 153 ；C.-X.Cao, J.-H.Zhu, H.Liu, ff.-Η.Fang, ff.-Z.Tang, L.-H.Song, ff.-K.Chen, Acta Chem.Scand.1999, 53, 955.C.X.Cao, L.Y.Fan, ff.Zhang, Analyst2008, 133, 1139; H.Liang, Y.Chen, L.J.Tian, L.Zhang, Electrophoresis2009, 30，3134)。這些前期研究結(jié)果為上述問(wèn)題的解決創(chuàng)造了重要條件，并且為較穩(wěn)定IEF技術(shù)的設(shè)計(jì)等提供了關(guān)鍵基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種蛋白質(zhì)等電聚焦電泳的方法及其裝置，發(fā)展了蛋白質(zhì)等電聚焦電泳的方法與器件，目的在于提高在IEF中的pH梯度可調(diào)控性，解決現(xiàn)有IPG-1EF的蛋 白質(zhì)沉淀和非同步聚焦問(wèn)題，提高IEF的穩(wěn)定性和分辨率。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:制備含有電極液的多孔親水材料作為酸性墊和堿性墊，然后將酸性墊置于電泳槽內(nèi)的陽(yáng)極，并與經(jīng)過(guò)水化上樣的固化或非固化PH梯度膠條的一端接觸；將堿性墊置于電泳槽內(nèi)的陰極，并與膠條的另一端接觸，陰極和陽(yáng)極端再經(jīng)輕壓固定確保實(shí)現(xiàn)電連接，最后滴加硅油覆蓋整個(gè)電泳槽內(nèi)的膠條與酸性電極液墊和堿性電極液墊，并施加直流電壓，通過(guò)逐步增加電壓實(shí)現(xiàn)等電聚焦電泳測(cè)試。在基于MRB的穩(wěn)定pH梯度控制時(shí)，所述的酸性墊為酸性電極液墊，其中所含的電極液為:H2S04、HC1、HBr, H1、HNO3> CH3COOH, H3PO4、或者上述混合溶液的除HF外的酸性電解質(zhì)，酸性電極液濃度為5mM 200mM ;所述的堿性墊為堿性電極液墊，其中的電極液為:NaOH, NH4OH, H2NCH2CH2NH2、或者上述混合溶液的除KOH外的堿性電解質(zhì)，堿性性電極液濃度為 5mM 200mM。在基于MRB和擴(kuò)散技術(shù)設(shè)計(jì)非線性pH梯度調(diào)控時(shí)，所述的酸性墊為酸性擴(kuò)散調(diào)控墊，其中所含的電極液為:H2S04、HCUHBr, HI, HNO3> CH3COOH, H3PO4、或者上述混合溶液的酸性電解質(zhì)，濃度為200mM 2000mM ;所述的堿性墊為堿性電極液墊，其中的電極液為:Na0H、NH40H、H2NCH2CH2NH2、或者上述混合溶液的除KOH外的堿性電解質(zhì)，濃度為200mM 2000mM。所述的酸性墊和堿性墊的基材為:濾紙、脫脂棉、海綿或無(wú)紡布，其長(zhǎng)度是與所在的電泳槽兩端電極到電泳槽道端部之間的距離相適應(yīng)，為4.5_ 12_ ;其寬度與所在的電泳槽的槽道寬度匹配，為2.5 6.5mm,其厚度為0.6mm 4mm。本發(fā)明涉及一種實(shí)現(xiàn)pH梯度調(diào)控、避免蛋白質(zhì)沉淀和非同步聚焦的非固化pH梯度膠條，即non-1PG膠條，包括:包含具有親水面并直接與聚丙烯酰胺凝膠聚合的凝膠支持膜、承載蛋白質(zhì)樣品并與支持膜鍵合的抗對(duì)流介質(zhì)、形成PH梯度并增加親水性的兩性載體電解質(zhì)和儲(chǔ)存保護(hù)non-1PG-1EF的保護(hù)膜。所述的凝膠支持膜的其中一面是具有乙烯基團(tuán)的聚酯材料的薄膜，以便與聚丙烯酰胺凝膠牢固鍵合。所述的凝膠支持膜的寬度為2.5 4.5mm;長(zhǎng)度為3.5cm 24cm ;其厚度為
0.15mm 0.35mm。

所述的抗對(duì)流介質(zhì)材料由聚丙烯酰胺凝膠，其濃度T為2 10% (質(zhì)量百分比濃度)，交聯(lián)度C為2 6%。所述的抗對(duì)流介質(zhì)的長(zhǎng)度為3.5cm 24cm,厚度為0.45mm 0.65mm,寬度為2.5 4.Smnin所述的保護(hù)膜的材料為聚乙烯膜或聚酯膜或腈綸膜或尼龍膜；其長(zhǎng)度和寬度均與凝膠支持膜相匹配，寬度為2.5 4.5mm ;長(zhǎng)度為3.5cm 24cm ;厚度為40 μ m 100 μ m。本發(fā)明涉及一種實(shí)現(xiàn)上述方法的電泳槽，包括:設(shè)有若干個(gè)槽道的聚焦槽框架、散熱底板、用于壓制酸性墊或堿性墊的蓋板和電極部件，其中:聚焦槽框架和散熱底板相互契合，電極部件固定于聚焦槽框架和散熱底板之間，蓋板與散熱底板相互配合。所述的聚焦槽框架有楔形頭且與散熱底板上的楔形孔相配合。所述的聚焦槽框架有定位孔且與蓋板上的定位片相配合。所述的電極部件包括:相互接觸的電極絲和電極片，其中:電極絲的電極絲環(huán)貼在環(huán)聚焦槽框架上所開(kāi)的電極螺絲孔上。所述的聚焦槽框架的槽道個(gè)數(shù)為6 12個(gè)，聚焦槽框架沿槽道方向的長(zhǎng)度為7cm 24cm。
技術(shù)效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用移動(dòng)反應(yīng)界面MRB通過(guò)設(shè)計(jì)穩(wěn)定pH梯度控制方法和器件，提高IEF的可調(diào)控性；基于MRB和擴(kuò)散技術(shù)設(shè)計(jì)非線性pH梯度調(diào)控方法和器件，進(jìn)一步提高PH梯度調(diào)控范圍和分辨率；基于MRB和親水相互作用設(shè)計(jì)非固化pH梯度膠條(non-1PG膠條)，解決IPG-1EF的蛋白質(zhì)非同步聚焦和沉淀問(wèn)題，提高分辨率和穩(wěn)定性。


圖1為基于MRB的穩(wěn)定pH梯度控制的電泳槽的縱向橫截面圖；圖2為基于MRB的穩(wěn)定pH梯度控制的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖3為基于MRB和擴(kuò)散技術(shù)設(shè)計(jì)非線性pH梯度的電泳槽的縱向橫截面圖；圖4為基于MRB和擴(kuò)散技術(shù)設(shè)計(jì)非線性pH梯度調(diào)控的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖5為實(shí)施例1和實(shí)施例3使用的非固化pH梯度膠條(non-1PG膠條)示意圖；圖6為電泳槽的結(jié)構(gòu)分解圖。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1如圖1所示，本實(shí)施例是基于MRB的穩(wěn)定pH梯度控制的實(shí)例，實(shí)施方法具體如下:I)對(duì)IPG或non-1PG膠條I進(jìn)行水化上樣；2)制備IEF酸性電極液墊2和堿性電極液墊3 ；
3)將水化后的IPG或non-1PG膠條放入IEF電泳槽4 ;4)將酸性電極液墊2和堿性電極液墊3分別放置于電泳槽4的陽(yáng)極5和陰極6，并使其接觸良好；5)將所述蓋板7輕壓酸性電極液墊2和堿性電極液墊3，之后滴加硅油覆蓋整個(gè)膠條I ;6)通直流電，并程序性升壓，進(jìn)行等電聚焦電泳實(shí)驗(yàn)。圖1顯示所述的電泳槽4，其中，電泳槽4是導(dǎo)熱系數(shù)較高的材料制作，如導(dǎo)熱塑料(2 IOff HT1K-1)或?qū)崽沾?5 150W HT1K-1)或它們的混合材料(2 30W mH有良好的散熱效果，所述膠條I放置在電泳槽4的上面，其在等點(diǎn)聚焦過(guò)程中產(chǎn)生的熱量會(huì)通過(guò)所述電泳槽4散去。所述膠條I放置在電泳槽4槽道內(nèi)，其長(zhǎng)度比正電極絲和負(fù)電極絲之間的間距要略微短些，其兩端離陽(yáng)極5和陰極6有適當(dāng)?shù)目臻g，酸性電極液墊2和堿性電極液墊3各自一端放在膠條I上，另一端放置在陽(yáng)極5或者陰極6上面，起到一個(gè)連接橋的作用，并且酸性電極液墊2和堿性電極液墊3分別浸泡正極電極液和負(fù)極電極液。等電聚焦電泳時(shí)，蓋板7適當(dāng)落入電泳槽4中，其作用是適當(dāng)壓緊酸性電極液墊2和堿性電極液墊3與膠條I接觸，使其導(dǎo) 電良好。接通直流電源即可進(jìn)行等電聚焦實(shí)驗(yàn)。所述的酸性電極液墊2，其中所含的電極液為:H2S04、HCUHBr, HI, HNO3> CH3COOH,H3PO4、或者上述混合溶液的酸性電解質(zhì)，但HF除外，酸性電極液濃度為5mM 200mM ;所述的堿性電極液墊3，其中的電極液為:Na0H、NH40H、H2NCH2CH2NH2、或者上述混合溶液的堿性電解質(zhì)，但KOH除外,堿性電極液濃度為5mM 200mM。所述的酸性電極液墊2和堿性電極液墊3的基材為:濾紙、脫脂棉、海綿或無(wú)紡布，其長(zhǎng)度是與所在的電泳槽兩端電極到電泳槽道端部之間的距離相適應(yīng)，為4.5mm 12mm ；其寬度與所在的電泳槽的槽道寬度匹配，為2.5 6.5mm,其厚度為0.6mm 3mm。
實(shí)施例2如圖2所示，本實(shí)施例為基于MRB的穩(wěn)定pH梯度控制的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在此描述的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)有酸性和堿性電極液墊控制的IEF實(shí)驗(yàn)(圖2A)和沒(méi)有酸性和堿性電極液墊控制的IEF實(shí)驗(yàn)(圖2B)進(jìn)行比較。在圖2A中，所述的酸性電極液墊中使用的酸性電極液為H3PO4溶液，濃度為150mM，所述的堿性電極液墊中使用的堿性電極液為H2NCH2CH2NH2,濃度為200mM。而在圖2B中，不使用酸性和堿性電極液墊。實(shí)驗(yàn)中可見(jiàn)的幾種蛋白質(zhì)樣品分別為藻藍(lán)蛋白(p1:4.45)、肌紅蛋白(pi:6.8和7.0)、血紅蛋白(p1:7.1和7.5)、細(xì)胞色素C (pi:9.6)。圖2A中使用的方法可以很好的控制pH梯度的漂移。與下面的圖2B對(duì)比后可以看出，藻藍(lán)蛋白的相對(duì)位置聚焦在4.3附近，肌紅蛋白和血紅蛋白相對(duì)位置分別聚焦在6.7 6.85和7.1 7.3，細(xì)胞色素C相對(duì)位置設(shè)定在9.6，這些相對(duì)位置基本與各自的pi值接近。而在圖2B中，藻藍(lán)蛋白相對(duì)位置在pH4.55 4.7，肌紅蛋白和血紅蛋白相對(duì)位置分別聚焦在7.95 8.1和8.55，細(xì)胞色素C相對(duì)位置設(shè)定在9.6，說(shuō)明pH梯度有明顯的陰極漂移現(xiàn)象。圖2A和2B的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明在此描述的pH梯度可以很好的控制蛋白質(zhì)的漂移。
實(shí)施例3如圖3所示，本實(shí)施例是基于MRB和擴(kuò)散技術(shù)設(shè)計(jì)非線性pH梯度調(diào)控實(shí)例，其具體方法是:I)對(duì)IPG或non-1PG膠條I進(jìn)行水化上樣；2)制備IEF酸性擴(kuò)散調(diào)控墊8和堿性擴(kuò)散調(diào)控墊9 ；3)將酸性擴(kuò)散調(diào)控墊8和堿性擴(kuò)散調(diào)控墊9分別放置于電泳槽4的陽(yáng)極5和陰極6，并使其接觸良好；4)將水化后的IPG或non-1PG膠條I放入IEF電泳槽4，并使膠面與電泳槽底部接觸；5)將所述蓋板7輕壓膠條的陽(yáng)極端和陰極端，并分別于酸性調(diào)控墊8和堿性調(diào)控墊9電連接，之后滴加硅油覆蓋整個(gè)膠條I ;6)通直流電，并程序性升壓，進(jìn)行等電聚焦電泳實(shí)驗(yàn)。所述的酸性擴(kuò)散調(diào)控墊，其中所含的電極液為:H2S04、HC1、HBr、H1、HN03、CH3COOH,H3PO4、或者上述混合溶液的酸性電解質(zhì)，濃度為150mM 2000mM ;所述的堿性擴(kuò)散調(diào)控墊，其中的電極液為:NaOH 、NH4OH, H2NCH2CH2NH2、或者上述混合溶液的除KOH以外的堿性電解質(zhì)，濃度為150mM 2000mM。所述的酸性擴(kuò)散調(diào)控墊和堿性擴(kuò)散調(diào)控墊的基材為:濾紙、脫脂棉、海綿或無(wú)紡布，其長(zhǎng)度是與所在的電泳槽兩端電極到電泳槽道端部之間的距離相適應(yīng)，為4.5mm 12mm ;其寬度與所在的電泳槽的槽道寬度匹配,為2.5 6.5mm,其厚度為0.6mm 3mm。
實(shí)施例4如圖4所示，本實(shí)施例為基于MRB和擴(kuò)散技術(shù)設(shè)計(jì)非線性pH梯度調(diào)控的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在此描述的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)有高濃度酸性和堿性電極液墊控制的IEF實(shí)驗(yàn)(圖4A)和只有酸性和堿性電極液墊控制的IEF實(shí)驗(yàn)(圖4B)進(jìn)行比較。在圖4A中，所述的高濃度酸性電極液墊中使用的酸性電極液為H3PO4溶液，濃度為150mM，所述的高濃度堿性電極液墊中使用的堿性電極液為H2NCH2CH2NH2，濃度為lOOOrnM。而在圖4B中，使用的是實(shí)施例2A中所述的酸性和堿性電極液墊，即酸性電極液為H3PO4溶液，濃度為150mM，堿性電極液為H2NCH2CH2NH2,濃度為200mM。實(shí)驗(yàn)中可見(jiàn)的幾種蛋白質(zhì)樣品分別為操監(jiān)蛋白(pi:4.45)、肌紅蛋白(p1:
6.8和7.0)、血紅蛋白(pi:7.1和7.5)、細(xì)胞色素C (p1:9.6)。在圖4A中，藻藍(lán)蛋白相對(duì)聚焦位置在3.6，肌紅蛋白和血紅蛋白相對(duì)聚焦位置分別在4.4 4.85和5.05 5.4，細(xì)胞色素C相對(duì)聚焦位置設(shè)定在9.6，明顯的拉大了陰極端的pH梯度范圍，并且可以看出幾條褐色的條帶分辨率提高了，說(shuō)明拉大陰極端PH梯度范圍可以很好的用于陰極端堿性蛋白樣品的分離，這對(duì)于堿性蛋白質(zhì)樣品的重點(diǎn)分析有重要意義。而在圖4B中，藻藍(lán)蛋白聚焦位置在4.3，肌紅蛋白和血紅蛋白位置分別在pH6.65 6.85和7.1 7.3，細(xì)胞色素C聚焦位置設(shè)定在PH9.6，進(jìn)一步對(duì)比分析可以看出褐色蛋白的分辨率沒(méi)有圖4A中好，當(dāng)需要對(duì)堿性Pl值樣品進(jìn)行重點(diǎn)分析時(shí)就會(huì)有困難。綜上所述分析，使用本技術(shù)所述的高濃度酸性和堿性擴(kuò)散調(diào)控墊有很好的調(diào)節(jié)PH梯度線性和范圍的作用。
實(shí)施例5如圖5所示，本實(shí)施例是非固化pH梯度膠條(non-1PG膠條)的實(shí)例，包括:包含能與聚丙烯酰胺凝膠聚合的親水面的凝膠支持膜10、承載蛋白質(zhì)樣品并與支持膜鍵合的抗對(duì)流介質(zhì)11、形成PH梯度和親水性的兩性載體電解質(zhì)12和儲(chǔ)存保護(hù)膠條的保護(hù)膜13。
所述的凝膠支持膜10的其中一面是具有乙烯基團(tuán)的材質(zhì)，以便與聚丙烯酰胺凝膠牢固鍵合。所述的凝膠支持膜10的寬度為2.5 4.5mm,長(zhǎng)度為3.5cm 24cm，其厚度為
0.15mm 0.35mm0所述的抗對(duì)流介質(zhì)11的材料由聚丙烯酰胺凝膠,介質(zhì)濃度T為2 10% (質(zhì)量百分百)，交聯(lián)度C為2 6%。所述的抗對(duì)流介質(zhì)11的長(zhǎng)度為3.5cm 24cm,厚度為0.45mm 0.65mm,寬度為
2.5 4.5mm。凝膠支持膜10長(zhǎng)度和寬度可隨需要裁切?？箤?duì)流介質(zhì)11與凝膠支持膜10牢固結(jié)合，在抗對(duì)流介質(zhì)11中添加的兩性載體電解質(zhì)12與抗對(duì)流介質(zhì)11沒(méi)有化學(xué)鍵的結(jié)合，在電場(chǎng)作用下，兩性載體電解質(zhì)12沿正極到負(fù)極方向形成從低到高的pH梯度。兩性電解質(zhì)質(zhì)量百分濃度優(yōu)選在1.5%至5%，而現(xiàn)有IPG-1EF中所有兩性電解質(zhì)質(zhì)量濃度為0.5%至1%，兩性電解質(zhì)濃度的提聞?dòng)兄谔崧効箤?duì)流介質(zhì)中的水溶性基團(tuán)，使其更好的穩(wěn)定pH梯度。所述的保護(hù)膜13覆蓋于抗對(duì)流介質(zhì)11之上，材料為聚乙烯膜或聚酯膜或腈綸膜或尼龍膜；其長(zhǎng)度和寬度均與凝膠支持膜10相匹配，寬度為2.5 4.5mm,長(zhǎng)度為3.5cm 24cm，厚度為40 μ m 100 μ m。可以有效地防止膠條受到污染，方便non-1PG膠條的長(zhǎng)期保存。
實(shí)施例6
如圖6所示，本實(shí)施例為電泳槽的實(shí)例，包括:設(shè)有若干個(gè)槽道的聚焦槽框架14、散熱底板16、用于壓制酸性電極液墊或堿性電極液墊的蓋板7和電極部件，其中:聚焦槽框架14和散熱底板16相互契合，電極部件固定于聚焦槽框架14和散熱底板16之間，蓋板7與散熱底板16相互配合。所述的聚焦槽框架14有楔形頭15且與散熱底板16上的楔形孔17相配合。所述的聚焦槽框架14有定位孔22且與蓋板7上的定位片23相配合。所述的電極部件包括:相互接觸的電極絲和電極片20，其中:電極絲的電極絲環(huán)19貼在環(huán)聚焦槽框架14上所開(kāi)的電極螺絲孔18上，電極固定螺絲21穿過(guò)所述電極絲環(huán)19和電極片20固定于所述聚焦槽框架14上的所述電極螺絲孔18。所述的聚焦槽框架14的槽道個(gè)數(shù)為6 12個(gè)，聚焦槽框架14沿槽道方向的長(zhǎng)度為 7cm 24cm。等電聚焦電泳時(shí)，蓋板7落于電泳盤(pán)內(nèi)，優(yōu)選所述蓋板材料為PMMA，其作用是適當(dāng)壓緊所述酸性墊或堿性墊，使其與所述等電聚焦電泳盤(pán)兩端的電極絲接觸良好。在此描述的電泳槽能很好的與實(shí)施例1至6所述的穩(wěn)定pH梯度的控制技術(shù)和調(diào)節(jié)PH梯度線性的技術(shù)相兼容。具體包括:1)電泳槽4是導(dǎo)熱系數(shù)較高的材料制作，如導(dǎo)熱塑料(2 IOW HT1K-1)或?qū)崽沾?5 150W nrt1)或它們的混合材料(2-30W mH，有良好的散熱效果，而現(xiàn)有通用的電泳槽散熱效果較差，導(dǎo)熱系數(shù)一般在3W HT1ITi以下。2)電泳槽槽道寬度與所述non-1PG-1EF膠條的寬度匹配，寬度在2.5mm至4.5mm之間。3)所述的電極使用內(nèi)嵌設(shè)計(jì)，與現(xiàn)有等點(diǎn)聚焦設(shè)備完全兼容，且有更方便操作的優(yōu)勢(shì)。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)等電聚焦電泳的pH梯度控制方法，其特征在于，首先制備含有電極液的多孔親水材料作為酸性墊和堿性墊，然后將酸性墊置于電泳槽內(nèi)的陽(yáng)極與經(jīng)過(guò)水化上樣的固化或非固化PH梯度膠條的一端之間，將堿性墊置于陰極與膠條的另一端之間，且并輕壓固定以實(shí)現(xiàn)電連接，最后滴加硅油覆蓋整個(gè)電泳槽內(nèi)并施加直流電壓，通過(guò)逐步增加電壓實(shí)現(xiàn)等電聚焦電泳測(cè)試。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，在基于MRB的穩(wěn)定pH梯度控制時(shí)，所述的酸性墊為酸性電極液墊，其中所含的電極液為:H2S04、HCUHBr, HI, HNO3> CH3COOH, H3PO4、或者上述混合溶液的酸性電解質(zhì)，但HF除外，酸性電極液濃度為5mM 200mM ;所述的堿性墊為堿性電極液墊，其中的電極液為:NaOH、NH4OH, H2NCH2CH2NH2、或者上述混合溶液的堿性電解質(zhì),但KOH除外,堿性性電極液濃度為5mM 200mM ； 在基于MRB和擴(kuò)散技術(shù)設(shè)計(jì)非線性pH梯度調(diào)控時(shí)，所述的酸性墊為酸性擴(kuò)散調(diào)控墊，其中所含的電極液為:H2S04、HC1、HBr, H1、HNO3> CH3COOH, H3PO4、或者上述混合溶液的酸性電解質(zhì)，濃度為150mM 2000mM;所述的堿性墊為堿性電極液墊，其中的電極液為:NaOH、NH40H、H2NCH2CH2NH2、或者上述混合溶液的堿性電解質(zhì)，濃度為150mM 2000mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是，所述的酸性墊和堿性墊以及的基材為:濾紙、脫脂棉、海綿或無(wú)紡布，其長(zhǎng)度是與所在的電泳槽兩端電極到電泳槽道端部之間的距離相適應(yīng)。
4.一種實(shí)現(xiàn)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法的非固化pH梯度膠條，其特征在于，包括:包含具有親水面的能與聚丙烯酰胺凝膠聚合的凝膠支持膜、具有承載蛋白質(zhì)樣品并與支持膜鍵合的抗對(duì)流介質(zhì)、具有形成PH梯度的兩性載體電解質(zhì)和用于儲(chǔ)存保護(hù)等膠條的保護(hù)膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的非固化pH梯度膠條，其特征是，所述的凝膠支持膜的其中一面是具有乙烯基團(tuán)，以便與聚丙烯酰胺凝膠牢固鍵合。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的非固化pH梯度膠條，其特征是，所述的抗對(duì)流介質(zhì)材料由聚丙烯酰胺凝膠，其濃度T為2%至10，交聯(lián)度C為2%至6%。
7.一種實(shí)現(xiàn)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的電泳槽，其特征在于，包括:設(shè)有若干個(gè)槽道的聚焦槽框架、散熱底板、用于壓制酸性墊或堿性墊的蓋板和電極部件，其中:聚焦槽框架和散熱底板相互契合，電極部件固定于聚焦槽框架和散熱底板之間，蓋板與散熱底板相互配合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，其特征是，所述的聚焦槽框架有楔形頭且與散熱底板上的楔形孔相配合。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的裝置，其特征是，所述的聚焦槽框架有定位孔且與蓋板上的定位片相配合。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，其特征是，所述的電極部件包括:相互接觸的電極絲和電極片，其中:電極絲的電極絲環(huán)貼在環(huán)聚焦槽框架上所開(kāi)的電極螺絲孔上。
全文摘要
一種基于移動(dòng)反應(yīng)界面和擴(kuò)散技術(shù)的蛋白質(zhì)等電聚焦電泳方法及其裝置，首先制備含有電極液的多孔親水材料作為酸性墊和堿性墊，然后將酸性墊置于電泳槽內(nèi)的陽(yáng)極與經(jīng)過(guò)水化上樣的固化或非固化pH梯度膠條的一端之間，將堿性墊置于陰極與膠條的另一端之間且并輕壓固定以實(shí)現(xiàn)電連接，最后滴加硅油覆蓋整個(gè)電泳槽內(nèi)并施加直流電壓，通過(guò)逐步增加電壓實(shí)現(xiàn)等電聚焦電泳測(cè)試。本發(fā)明的目的在于提高pH梯度可調(diào)控性和分辨率。
文檔編號(hào)G01N27/447GK103235026SQ20131011385
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月2日
發(fā)明者曹成喜, 郭陳剛, 劉小平, 李思, 王后禹 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)