專利名稱：一種干式免疫檢測(cè)試紙條及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，具體涉及一種干式免疫檢測(cè)檢測(cè)試紙條及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)如今干式免疫定量檢測(cè)一般由體外免疫層析試劑條進(jìn)行檢測(cè)，試紙條主要是將親和技術(shù)、印記技術(shù)、免疫標(biāo)記和層析技術(shù)的組合，一般包括樣品墊、濾血膜、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊等四層到五層(四層一般將濾血功能與樣品墊組合)，示蹤粒子(膠體金、熒光等)標(biāo)記的抗體包被在結(jié)合墊上。專利CN102192983A對(duì)傳統(tǒng)的免疫層析膜的結(jié)合方式進(jìn)行了改變，變成三膜系統(tǒng)一GE公司旗下Whatman開發(fā)的膜Fusion5、硝酸纖維素膜、吸水紙，有效地提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性。然而，膜Fusion5孔徑較大，抗體難以固定需要制備特殊的STONE用以固定抗體，工藝較為復(fù)雜，同時(shí)通過專利CN102192983A制備的試紙條層析的時(shí)間需要十分鐘，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種操作簡(jiǎn)單、層析迅速、特異性強(qiáng)、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性強(qiáng)的干式免疫檢測(cè)試紙條及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種干式免疫檢測(cè)試紙條，在塑料底襯上從左到右依次粘有樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，硝酸纖維素膜右端設(shè)有相互平行的質(zhì)控線和檢測(cè)線；硝酸纖維素膜左端設(shè)有示蹤粒子標(biāo)記抗體/抗原包被線和封閉蛋白線I，封閉蛋白線I為封閉蛋白液I包被硝酸纖維素膜形成的線，抗體/抗原包被線為示蹤粒子標(biāo)記抗體/抗原噴到封閉蛋白線II上形成的線，其中，封閉蛋白線II為封閉蛋白液II包被硝酸纖維素膜形成的線。所述的檢測(cè)線上包被有抗體或抗原，檢測(cè)線上包被有抗體為針對(duì)待測(cè)抗原的單抗或多抗，或者為針對(duì)待測(cè)抗體的抗原的單抗或多抗；檢測(cè)線上包被抗原為待測(cè)抗原的競(jìng)爭(zhēng)性抗原。所述的示蹤粒子為膠體金顆粒、熒光顆粒、膠乳顆粒、磁性顆粒中的任意一種。所述的熒光顆粒可以是熒光素(cy5、cy7)、羧基熒光素、2-甲氧基熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、量子點(diǎn)中的一種。所述封閉蛋白液I與封閉蛋白液II均包含酪蛋白與BSA。所述的封閉蛋白液I的制備方法:用三蒸水溶解質(zhì)量比為1:5-2:1的酪蛋白與BSA，然后配置成濃度不高于15%的溶液。所述的封閉蛋白液II的制備方法:用三蒸水溶解質(zhì)量比為1:5-1:1的酪蛋白與BSA，然后配置成濃度不高于15%的溶液。本發(fā)明公開了一種干式免疫檢測(cè)試紙條的制備方法，包括以下步驟:(I)樣品墊的制備:將樣品墊用lOOmmol/L pH7.2 PBS緩沖液浸泡2 4小時(shí)，取出后25°C干燥8小時(shí)。(2)硝酸纖維素膜的處理:
A、檢測(cè)線的制備:將待測(cè)物質(zhì)相對(duì)應(yīng)的抗原/抗體用20mmol/LpH7.2的PB緩沖液稀釋到2.0mg/ml的濃度，0.8ul/cm在離硝酸纖維素膜右端4.0cm處劃線得到檢測(cè)線；
B、質(zhì)控線的制備:將兔抗鼠IgG抗體按4mg/ml的濃度,0.8ul/cm在硝酸纖維素膜右端
3.5cm處劃質(zhì)控線，該線與檢測(cè)線平行，與檢測(cè)線間隔5_，然后在干燥箱內(nèi)20°C鼓風(fēng)干燥12h ；
C、封閉蛋白線的制備:將封閉蛋白液I包被于硝酸纖維素膜左端6mm處，包被量為1.5ul/cm ；
D、示蹤粒子標(biāo)記抗體/抗原包被線的制備:采用封閉蛋白液II劃線于硝酸纖維素膜左端1.5mm處,包被量為1.3ul/cm,置于25°C干燥2h,然后用示蹤粒子標(biāo)記的抗體/抗原在封閉蛋白II的位置劃線置于25°C干燥4h，密封干燥保存。(3)吸水墊的制備:吸水紙裁剪成30*2.7cm每條。(4)組裝:塑料底襯，樣品墊和吸水 紙為本領(lǐng)域通用的部件。將上述硝酸纖維素膜、吸水墊、樣品墊粘貼在塑料底襯上，將貼好的中間物用斬切機(jī)切成一定寬度的試紙條。本發(fā)明公開了一種干式免疫檢測(cè)試紙條的應(yīng)用，所述的干式免疫檢測(cè)試紙條通過雙抗夾心法或者競(jìng)爭(zhēng)法原理定量測(cè)定待測(cè)物質(zhì)，適用于所有的采用雙抗夾心或競(jìng)爭(zhēng)法模式的心肌類、腎臟類、腫瘤類、傳染病類等疾病的診斷。本發(fā)明通過采用包被于硝酸纖維素膜上的示蹤粒子標(biāo)記抗體包被線，且采用封閉蛋白線的方式取代常用的包被示蹤粒子標(biāo)記抗體的結(jié)合墊，一方面層析時(shí)間只需45s-60s，檢測(cè)時(shí)間大大縮短、特異性與穩(wěn)定性加強(qiáng)、檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，另一方面，還大大節(jié)約了材料，節(jié)省了成本。


圖1:本發(fā)明干式免疫檢測(cè)試紙條結(jié)構(gòu)示意 圖2:C反應(yīng)蛋白膠體金檢測(cè)試紙條的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖3:胱抑素C熒光檢測(cè)試紙的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖4:甲胎蛋白熒光檢測(cè)試紙的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
其中，圖1:1、樣品墊；2、吸水墊；3、硝酸纖維素膜；4、檢測(cè)線；5、質(zhì)控線；6、包被線；7、封閉蛋白線I。
具體實(shí)施例方式通過以下具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，以下實(shí)施例僅用于說明，而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1 C反應(yīng)蛋白膠體金檢測(cè)試紙的制備與使用 1、C反應(yīng)蛋白膠體金檢測(cè)試紙的制備
(I)膠體金一抗體復(fù)合物的制備
a、制備生物素化C反應(yīng)蛋白(CRP)單克隆抗體復(fù)合物:先用6-氨基己糖與生物素連接制得長(zhǎng)臂生物素，按照每毫升鼠抗人CRP單克隆抗體加80 μ g生物素加入進(jìn)行反應(yīng)lh，生成長(zhǎng)臂生物素N-羥基丁二酰胺酯，即為生物素化CRP單克隆抗體復(fù)合物，通過1% BSA pH7.5透析出去游離生物素；
b、制備膠體金標(biāo)記親和素:用1%碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金pH值至7.5，按照IOyg鏈親和素/ml膠體金的量加入鏈親和素溶液充分混勻，置于25°C水浴反應(yīng)30分鐘后再加入5%BSA，封閉20分鐘后，離心取沉淀，用BSA恢復(fù)其終濃度為1%，4°C保存?zhèn)溆茫?br> C、膠體金一抗體復(fù)合物的制備:按50yg CRP單抗-生物素/ml膠體金的量將抗體-生物素加入膠體金中，37°C攪拌反應(yīng)40分鐘，加入5%BSA，封閉攪拌20分鐘，6000r/min離心20分鐘，棄上清，沉淀以金標(biāo)抗體保存液恢復(fù)體積，4°C保存。(2)封閉蛋白液的制備
封閉蛋白液I的制備方法:用三蒸水溶解質(zhì)量比為1:5的酪蛋白與BSA，然后配置成濃度3%的溶液。封閉蛋白液II的制備方法:用三蒸水溶解質(zhì)量比為1:1的酪蛋白與BSA，然后配置成濃度5%的溶液。(3)免疫層析試紙條的組裝 a、硝酸纖維素膜的處理 檢測(cè)線的制備:將鼠抗人C反應(yīng)蛋白單克隆抗體用20mmol/L pH7.2的PB緩沖液稀釋到2.0mg/ml的濃度，0.8ul/cm在離硝酸纖維素膜右端4.0cm處劃線得到檢測(cè)線。質(zhì)控線的制備:將兔抗鼠IgG抗體按4mg/ml的濃度，0.8ul/cm在硝酸纖維素膜右端3.5cm處劃質(zhì)控線，該線與檢測(cè)線平行，與檢測(cè)線間隔5_，然后在干燥箱內(nèi)20°C鼓風(fēng)干燥 12h。封閉蛋白線:將封閉蛋白液I包被于硝酸纖維素膜左端6mm處，包被量為1.5ul/cm。膠體金抗體包被線:采用封閉蛋白液II包被上述處理的硝酸纖維素膜，包被于膜左端1.5mm處，包被量為1.3ul/cm，置于25°C干燥2h，然后用膠體金一抗體復(fù)合物在封閉蛋白II的位置劃線置于25°C干燥4h，密封干燥保存。b、樣品墊的制備
將樣品墊用lOOmmol/L PBS緩沖液浸泡2 4小時(shí)，取出后25°C干燥8小時(shí)。C、吸水墊的制備 吸水紙裁剪成30*2.7cm每條。d、組裝
塑料底襯、樣品墊和吸水紙為本領(lǐng)域通用的部件。將上述硝酸纖維素膜、吸水墊、樣品墊粘貼在塑料底襯上(如附圖1)。將貼好的中間物用斬切機(jī)切成5.6cm寬一條的試紙條。2、CRP膠體金檢測(cè)試紙條的使用 (I)定性檢測(cè)
把待檢樣品滴加在本試紙條的樣品墊上，45s-60s后即可出現(xiàn)定性結(jié)果:若在試紙的質(zhì)控線和檢測(cè)線的位置處分別出現(xiàn)一條紫紅色的條帶，表明待檢液中含有相應(yīng)的抗原即為陽(yáng)性樣品；若僅在試紙的質(zhì)控線位置處出現(xiàn)紫紅色的條帶，表明待檢液中含有相應(yīng)的抗原在檢測(cè)下限以下即為陰性樣品；若在試紙的質(zhì)控線和檢測(cè)線的位置處都無紫紅色的條帶出現(xiàn)，表明該檢測(cè)結(jié)果為無效結(jié)果。(2)定量檢測(cè) a、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
制備好的CRP膠體金檢測(cè)試紙條樣品墊上加入不同濃度CRP抗原標(biāo)準(zhǔn)品(取六個(gè)不同濃度，分別為0.5、1、3、10、100、200mg/L，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù))，60 s后，通過南京基蛋生物科技有限公司的FIA8100系列免疫定量分析儀讀取信號(hào)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析見表1:
表1 CRP標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種干式免疫檢測(cè)試紙條，其特征在于，在塑料底襯上從左到右依次粘有樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，硝酸纖維素膜右端設(shè)有相互平行的質(zhì)控線和檢測(cè)線；硝酸纖維素膜左端設(shè)有示蹤粒子標(biāo)記抗體/抗原包被線和封閉蛋白線I，封閉蛋白線I為封閉蛋白液I包被硝酸纖維素膜形成的線，抗體/抗原包被線為示蹤粒子標(biāo)記抗體/抗原噴到封閉蛋白線II上形成的線，其中，封閉蛋白線II為封閉蛋白液II包被硝酸纖維素膜形成的線。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種干式免疫檢測(cè)試紙條，其特征在于所述的示蹤粒子為膠體金顆粒、熒光顆粒、膠乳顆粒、磁性顆粒中的任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種干式免疫檢測(cè)試紙條，其特征在于所述的檢測(cè)線上包被有抗體或抗原。
4.一種干式免疫檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)樣品墊的制備:將樣品墊用100mmol/LPBS緩沖液浸泡2 4小時(shí)，取出后25°C干燥8小時(shí)； (2)硝酸纖維素膜的處理: A、檢測(cè)線的制備:將待測(cè)物質(zhì)相對(duì)應(yīng)的抗原/抗體用20mmol/LpH7.2的PB緩沖液稀釋到2.0mg/ml的濃度，0.8ul/cm在離硝酸纖維素膜右端4.0cm處劃線得到檢測(cè)線； B、質(zhì)控線的制備:將兔抗鼠IgG抗體按4mg/ml的濃度,0.8ul/cm在硝酸纖維素膜右端 3.5cm處劃質(zhì)控線，該線與檢測(cè)線平行，與檢測(cè)線間隔5_，然后在干燥箱內(nèi)20°C鼓風(fēng)干燥12h ； C、封閉蛋白線的制備:將封閉蛋白液I包被于硝酸纖維素膜左端6mm處，包被量為1.5ul/cm ； D、示蹤粒子標(biāo)記抗體/抗原包被線的制備:采用封閉蛋白液II劃線于硝酸纖維素膜左端1.5mm處,包被量為1.3ul/cm,置于25°C干燥2h,然后用示蹤粒子標(biāo)記的抗體/抗原在封閉蛋白II的位置劃線置于25°C干燥4h，密封干燥保存； (3)吸水墊的制備:吸水紙裁剪成30*2.7cm每條； (4)組裝:將上述硝酸纖維素膜、吸水墊、樣品墊粘貼在塑料底襯上，將貼好的中間物用斬切機(jī)切成一定寬度的試紙條。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種干式免疫檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于所述封閉蛋白液I與封閉蛋白液II均包含酪蛋白與BSA。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種干式免疫檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于所述的封閉蛋白液I的制備方法:用三蒸水溶解質(zhì)量比為1:5-2:1的酪蛋白與BSA，然后配置成濃度不高于15%的溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種干式免疫檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于所述的封閉蛋白液II的制備方法:用三蒸水溶解質(zhì)量比為1:5-1:1的酪蛋白與BSA，然后配置成濃度不高于15%的溶液。
8.一種干式免疫檢測(cè)試紙條應(yīng)用于雙抗夾心法或者競(jìng)爭(zhēng)法原理的免疫定量檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種干式免疫檢測(cè)試紙條及其制備方法與應(yīng)用。該試紙條在塑料底襯上從左到右依次粘有樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，硝酸纖維素膜右端設(shè)有相互平行的質(zhì)控線和檢測(cè)線；硝酸纖維素膜左端設(shè)有示蹤粒子標(biāo)記抗體/抗原包被線和封閉蛋白線Ⅰ，封閉蛋白線Ⅰ為封閉蛋白液Ⅰ包被硝酸纖維素膜形成的線，抗體/抗原包被線為示蹤粒子標(biāo)記抗體/抗原噴到封閉蛋白線Ⅱ上形成的線，其中，封閉蛋白線Ⅱ?yàn)榉忾]蛋白液Ⅱ包被硝酸纖維素膜形成的線。該試紙條應(yīng)用于雙抗夾心法或者競(jìng)爭(zhēng)法原理的免疫檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單、層析迅速、特異性強(qiáng)、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性強(qiáng)。
文檔編號(hào)G01N33/558GK103226143SQ20131011715
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月7日
發(fā)明者蘇恩本, 王勇, 焦麗蓉 申請(qǐng)人:南京基蛋生物科技有限公司