專利名稱：一種優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血管內(nèi)皮祖細(xì)胞鑒定方法，本發(fā)明特別涉及優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定，屬于運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)與生物技術(shù)交叉領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
冰雪運(yùn)動(dòng)是耐力項(xiàng)目，對(duì)心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)功能要求很高。不僅要求有很好的有氧代謝功能，而且還要有較強(qiáng)的負(fù)氧能力，所以在選材時(shí)要把運(yùn)動(dòng)員的心肺功能放在重要因素之內(nèi)。一般冰雪運(yùn)動(dòng)員心肺功能發(fā)育良好、心容量大、脈搏有力、每博輸出量大、搏動(dòng)活動(dòng)頻率較低、脈壓差較大、脈搏回降迅速、脈活量大等等。一氧化氮作為內(nèi)皮細(xì)胞松馳因子，在心血管系統(tǒng)主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞以左旋精氨酸與活性氧分子為底物，在一氧化氮合酶的催化下產(chǎn)生并釋放，具有舒張血管、改善冠狀動(dòng)脈功能、增大毛細(xì)血管通透性等作用，在運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)過(guò)程中對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)體的心血管功能具有重要的生理意義。冰雪運(yùn)動(dòng)員由于長(zhǎng)期在高氧、高寒地區(qū)活動(dòng)，對(duì)心血管功能要求極高，血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞更新速度較正常入的高，所以冰雪運(yùn)動(dòng)員外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的含量也比普通人的高。血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，即能分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的祖細(xì)胞，又稱血管母細(xì)胞(angioblast)或血管內(nèi)皮干細(xì)胞(endothelial stem cells),來(lái)源于骨髓的原始細(xì)胞,與人類胚胎時(shí)期的成血管細(xì)胞(angioblast)和人胳帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)相似，在一定條件下可誘導(dǎo)分化成為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, ECs)。1997年，Asahara等人首次分離并證實(shí)成年入外周血中存在著能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮祖細(xì)胞，并在體內(nèi)證實(shí)了其生成血管的能力，人們開始了對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞各方面的研究，目前，內(nèi)皮祖細(xì)胞先后從臍血、脂肪、骨髓和胎肝中被分離出來(lái)。但是，內(nèi)皮祖細(xì)胞的表面標(biāo)志與其他干細(xì)胞標(biāo)志極其相似，造成內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定限制了其在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志 物一般認(rèn)為OT34+VEGFR-2+rai33+。然而，⑶133是造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，其選擇性地表達(dá)于早期造血細(xì)胞以及骨髓、胚胎肝和外周血的祖細(xì)胞，所以單純用其鑒定不能區(qū)分EPCs和造血干細(xì)胞，同樣⑶34和VEGFR-2，它們?yōu)樵煅岛蛢?nèi)皮系細(xì)胞所共有，也不是必要的EPCs標(biāo)志。vWF(von Willebrand factor)主要由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生,與內(nèi)皮素等共同存在于內(nèi)皮細(xì)胞Weibel-Palade小體中，因此Weibel-Palade小體被作為內(nèi)皮細(xì)胞的識(shí)別標(biāo)志。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為提供一種鑒定優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法。一種通過(guò)透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞器Weibel-Palade小體從而鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法。在電子染色過(guò)程中，本發(fā)明對(duì)染色溫度進(jìn)行了改進(jìn)，采用37°染色30s，節(jié)約了染色時(shí)間，提高了染色效率。
具體實(shí)施例方式(一 )優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員外周血⑶34+內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞分離培養(yǎng)無(wú)菌采集優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員外周血40ml，肝素抗凝，用Hakn’ s液等倍稀釋血液。然后采用Fiocll密度梯度離心法分離。方法如下:(I)在離心管中加入淋巴細(xì)胞分離液；(2)取肝素抗凝血與等量Hanks液充分搖勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面，水平離心，2000rpm, 20min ；(3)離心后管內(nèi)分為三層，上層為血漿和Hanks液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個(gè)核紅飽包括淋巴細(xì)胞、 內(nèi)皮祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞。(4)用吸管插到云霧層，吸取單個(gè)核細(xì)胞，植入另一離心管中，加入5倍以上體積的Hanks液,離心，1500rpm, IOmin,洗漆細(xì)胞2次。(5)末次離心后，棄上清，加入含有，重懸細(xì)胞。取一滴細(xì)胞懸液與一滴0.2%臺(tái)酚蘭染液混合，于血球計(jì)數(shù)板上，計(jì)算細(xì)胞活率。(6)將收集的單個(gè)核細(xì)胞與⑶34單克隆抗體孵育Ih后，1200rpm離心洗滌2次，流式細(xì)胞儀分選CD34+細(xì)胞。( 二)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員外周血⑶34+細(xì)胞體外富集(I)培養(yǎng)板及培養(yǎng)瓶的的包被取IOml I %明膠加入培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶，放入37°C培養(yǎng)箱中孵育2h取出，吸出多余的液體備用。(2) CD34+細(xì)胞傳代培養(yǎng)將流式細(xì)胞儀分選⑶34+細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清和細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF和bFGF、青霉素鏈霉素各1X105IU/L的M199培養(yǎng)基中。以5X108的密度接種于鋪有明膠包被的培養(yǎng)瓶中，放入37°C，5% CO2，濕度100%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后棄去貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞離心收集，以2 X IO6個(gè)/mL的密度接種于六孔板中，加入上述完全培養(yǎng)基，4d后換液繼續(xù)培養(yǎng)，以后每隔2d換液。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合超過(guò)80%，即可傳代。吸出培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗2 3次。用0.25%胰酶消化液消化，隨時(shí)觀察消化細(xì)胞的變化，當(dāng)觀察到大量細(xì)胞回縮變圓，即加入完全培養(yǎng)基輕輕吹打細(xì)胞，以1: 2進(jìn)行傳代。傳代培養(yǎng)過(guò)程中，每2 3d換一次完全培養(yǎng)基，直至細(xì)胞生長(zhǎng)匯合超過(guò)80 %。重復(fù)以上操作，并按1: 2的比例傳代、接種、培養(yǎng)。(三)優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員外周血⑶34+細(xì)胞透射電子顯微鏡下觀察(I)細(xì)胞收集:取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞成單層鋪滿瓶底后，倒掉培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍，每遍5min，用胰酶消化細(xì)胞，收集于2ml EP管中，1500rpm,離心5min,棄去上清。(2)標(biāo)本固定:2.5%戊二醛4°C固定2h，將細(xì)胞團(tuán)移入青霉素小瓶中，在4°C條件下用PBS漂洗3次，每次5min。再用四氯化餓4°C固定30min，接著用PBS漂洗3次。(3)脫水:50%丙酮溶液，IOmin, I次；70%丙酮溶液，IOmin, I次；90%丙酮溶液，10min，2 次;100%丙酮溶液，lOmin，3 次。
(4)浸透:吸去瓶中脫水劑，加入3ml純丙酮一 EP0N812包埋劑，室溫下放置30min，棄去稀釋的包埋劑，加純包埋劑1ml，室溫放置2h。(5)包埋:把細(xì)胞團(tuán)塊移入膠囊膜塊孔的底部中心，注滿混合包埋劑，放置于60°C烤箱烘烤24h，使之固化成為硬塊。(6)修塊:將包埋塊安置在特制的夾具上，用單刃刀修整包埋并做標(biāo)記。(7)制備半薄切片:將修好的包埋塊在超薄切片機(jī)上切取厚度為I μ m的半薄切片。取潔凈載玻片，浸入1%明膠和1%鉻明礬的混合液中，取出放在烤片機(jī)上加熱至60°c使之干燥。在玻片上加一滴蒸餾水，用鑷子將半薄切片移入水滴中，放在烤片機(jī)上加熱使之展平干燥。然后滴加美藍(lán)溶液，在60°C染30s，水洗，烤干。在顯微鏡下觀察半薄切片的細(xì)胞圖像，確定行超薄切片的部位并做標(biāo)記。(8)制備超薄切片:用氯仿制備0.45% Formvar溶液,將潔凈載玻片垂直浸入此溶液，即刻取出，玻片表面即形成一層薄膜。用刀片劃開薄膜四周，浸入盛滿水的水槽中使薄膜于玻片分開。將銅網(wǎng)小心仿在薄膜上并用封口膜覆蓋其上，一并將銅網(wǎng)及支持膜取出。在超薄切片機(jī)上固定包埋塊，調(diào)整刀距，切取50nm厚度的超薄切片，貼在銅網(wǎng)有支持膜的一側(cè)，保存在干燥器皿中待染色。(9)電子染色:將載有切片的銅網(wǎng)垂直夾于橡膠板上并放入平皿內(nèi)，在切片的一側(cè)滴加I滴醋酸雙氧鈾染色液，室溫下染色37°染色30s。取出橡膠板，用雙蒸水沖洗切片，濾紙吸干后，放入平皿中，加I滴鉛染色，室溫下染37°染色30s。水洗、吸干、晾干備用。(10)透射電鏡(8000X)觀察并照相。(見附圖)


附圖是冰雪運(yùn)動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞Weibel-Palade小體透射電鏡圖。
權(quán)利要求
1.通過(guò)透射電子顯微鏡觀察優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞器Weibel-Palade小體，用于血管內(nèi)皮祖細(xì)胞鑒定的方法。
2.依據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，在電子染色過(guò)程中，本發(fā)明對(duì)染色溫度進(jìn)行了改進(jìn)，采用37°染色30s，節(jié)約了染色時(shí)間，提高了`染色效率。`
全文摘要
本發(fā)明公開了一種優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定方法，本發(fā)明提供了通過(guò)透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞器Weibel-Palade小體來(lái)鑒定優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員的內(nèi)皮祖細(xì)胞，該方法的特異性、專一性強(qiáng)，成本低廉。
文檔編號(hào)G01N1/30GK103234993SQ20131012314
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月11日
發(fā)明者王世君, 張海龍, 胡萍, 白春雨, 李向臣, 關(guān)偉軍 申請(qǐng)人:哈爾濱體育學(xué)院